加減薯蕷丸對APP/PS1 小鼠海馬區(qū)AMPK/eEF2K/eEF2 信號通路的影響?

程宇航，邱 靜，鄢文靜，張雨婷，汪怡萍，譚子虎

湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢430065

阿爾茨海默病（alzheimer’s disease，AD）是一種以認知功能障礙為核心、伴有日常生活能力及社會功能損害為特點的神經(jīng)退行性疾病，占癡呆總數(shù)的50%～70%，遠高于其他類型癡呆［1］。目前AD 發(fā)病機制復雜，尚缺乏有效預防和治療藥物，積極尋求新的治療方法顯得尤為重要。本課題組以健脾補腎、祛瘀化痰為法擬定加減薯蕷丸，前期臨床研究［2］發(fā)現(xiàn)其能提高輕、中度AD 患者簡易智能量表、日常生活功能量表評分，因此有必要對加減薯蕷丸對AD 的作用機制進行深入研究，本研究應用APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠探討加減薯蕷丸治療AD的可能機制，為藥物的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級5 月齡APP/PS1 雄性雙轉(zhuǎn)基因小鼠，購于南京大學模式動物研究所，實驗動物合格證號：SCXK（蘇）20180008，體質(zhì)量（33.7±3.2）g。飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院SPF 級實驗動物中心。溫度（21±3）℃，相對濕度（60±5）%，自由飲食飲水，12 h明暗交替。

1.2 實驗藥物加減薯蕷丸濃縮劑（薯蕷健脾益智合劑，湖北省中醫(yī)院制劑中心制備，鄂藥制字Z20150027，批號：20190101）。藥物組成：山藥30 g，制何首烏24 g，熟地黃24g，黨參20 g，麩炒白術(shù)18 g，茯苓18 g，白芍20 g，當歸20 g，川芎10 g，杜仲15 g，炙遠志12 g，石菖蒲14 g，枸杞子18 g，五味子10 g。加水煎煮3 次，每次1 h，過濾合并，經(jīng)物理方法濃縮提純，制成口服液，含生藥1 g/mL，真空包裝，250 mL/袋，4℃冷藏備用。

1.3 實驗試劑和儀器RIPA 裂解液（批號：P0013B）、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天（批號：P0010）；ECL 底物液（Thermo，批號：NCI5079）、兔多抗p-AMPKα1（thr172，批號：2535S）、兔多抗p-eEF2（thr56，批號：A00830-2）、兔多抗eEF2K（批號：A02277-1）購于武漢博士德生物工程有限公司；鼠單抗p-eEF2K（ser366，批號：3691S)購于santa cruz；SYN-1(批號：5297S、111-005-003）及PSD-95(批號：36233s、115-005-003)檢驗所用一抗、二抗均由湖北中醫(yī)藥大學提供。mulISKANMK3型酶標儀（美國Thermo公司）；HI650型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；微量移液器（Eppendorf）；CPA 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DYCZ-24DN 垂直電泳槽、DYCZ-40轉(zhuǎn)膜儀、DYCZ-24K電泳儀（北京六一儀器廠）；三套自制新物體識別實驗工具（每套包含1 個40 cm×40 cm×40 cm 空箱，2 個相同物體及1 個大小與前者相同、但顏色形狀不同的新物體）。

1.4 分組與給藥20 只雄性5 月齡APP/PS1 小鼠，按隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥組各10 只；另取10 只同窩野生型小鼠作為空白組，中藥組按14 g/（kg·d）灌胃（根據(jù)大鼠有效灌胃劑量進行換算）加減薯蕷丸濃縮劑，每日1次，連續(xù)28天；模型組和空白組灌胃同體積生理鹽水。

1.5 新物體識別實驗空箱均安置于安靜環(huán)境中，實驗分為3 個部分：適應期，將小鼠放置于空箱中，每天上下午各1 次，10 min/次，持續(xù)3 天；熟悉期，將兩個相同物體放入同一空箱內(nèi)對稱位置，讓小鼠自由探索10 min；測試期24 h后，將測試箱中的1 個物體替換為另一種大小相近、顏色和形狀不同的新物體，位置不變，記錄小鼠探索新物體的時間A（s）和探索原物體的時間B（s）。每次將小鼠放入空箱內(nèi)的位置和方向相同，不同小鼠之間測試時需清理測試箱，測試完成后計算各組小鼠的相對分辨指數(shù)（A-B）/（A+B）。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測蛋白水平小鼠水合氯醛麻醉后斷頭取腦，冰上分離海馬，根據(jù)實驗步驟進行海馬蛋白提取。采用BCA 試劑盒對蛋白樣品進行濃度測定，每孔蛋白上樣量30μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉或5%BSA室溫封閉2 h，按不同比例稀釋一抗（AMPKα1 1∶2000，eEF2 1∶400，p-AMPKα1、p-eEF2、eEF2K、p-eEF2K均為1∶1000，SYN-1 為1∶500，PSD-95 為1∶1000）4℃過夜；1×TBST 液洗3×5 min；二抗（羊抗兔1∶1萬，兔抗鼠1∶1萬）室溫搖床1 h；1×TBST液洗3×10 min。ECL 發(fā)光液使條帶可視化，Image J 1.41軟件測量條帶灰度值，以目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白β-actin 灰度值，進行歸一化處理，將蛋白質(zhì)水平的相對變化標準化為對照樣品。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1 小鼠分辨指數(shù)小鼠相對分辨指數(shù)空白組為0.598±0.179，模型組為0.109±0.072，中藥組為0.299±0.172。模型組小鼠的新物體識別能力較空白組下降，中藥組小鼠新物體識別能力較模型組提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 APP/PS1 小 鼠 海 馬 區(qū)p-AMPKα1/AMPK α1、p-eEF2K/eEF2K及p-eEF2/eEF2相對水平與空白組比較，模型組小鼠海馬區(qū)p-AMPKα1/AMPKα1、p-eEF2K/eEF2K 及p-eEF2/eEF2 相對表達水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組p-AMPKα1/AMPKα1、p-eEF2K/eEF2K 及p-eEF2/eEF2 相對表達水平降低（P＜0.01）。見表1及圖1—3。

表1 各組小鼠海馬蛋白相對表達水平比較（±s）

表1 各組小鼠海馬蛋白相對表達水平比較（±s）

注：與空白組相比，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05；與模型組相比，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05

圖1 小鼠海馬區(qū)AMPKα1電泳圖

圖2 小鼠海馬區(qū)eEF2K電泳圖

圖3 小鼠海馬區(qū)eEF2電泳圖

2.3 加減薯蕷丸對海馬突觸蛋白SYN 和PSD-95的影響與空白組相比，模型組小鼠SYP、PSD-95相對表達水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組小鼠SYN、PSD-95相對表達水平增加（P＜0.01）。見表2及圖4。

表2 各組小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達水平比較（±s）

注：**表示與空白組比較，P＜0.01；△△表示與模型組比較，P＜0.01

圖4 小鼠海馬區(qū)SYN-1、PSD-95電泳圖

3 討論

加減薯蕷丸是已故名老中醫(yī)呂繼端教授根據(jù)《金匱要略》中薯蕷丸化裁而成，全方以補腎填精、化痰開竅為法，前期基于頻數(shù)分析及關(guān)聯(lián)規(guī)則對古代治療癡呆的方劑進行數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸符合中醫(yī)對呆病“腎虛髓減為本、痰瘀互結(jié)為標”的病機認識［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸可調(diào)節(jié)慢性腦低灌注模型小鼠海馬區(qū)AMPK 水平，降低自噬水平［4］，而加減薯蕷丸是否參與AD 模型AMPK 表達水平的調(diào)節(jié)尚不清楚。因此本實驗通過APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠研究加減薯蕷丸對AMPK、eEF2K/eEF2 蛋白水平的影響，探討加減薯蕷丸參與改善AD學習記憶功能的可能調(diào)節(jié)機制。

突觸可塑性是指突觸之間通過連接方式的改變以響應特定刺激，是長期記憶形成的基礎(chǔ)。突觸內(nèi)的核糖體、mRNA、翻譯因子對突觸蛋白質(zhì)合成有重要幫助，這一過程需要消耗大量能量。大腦因為其能量儲備少的特性，幾乎所有能量消耗都來自于線粒體分解葡萄糖產(chǎn)生，而AD 患者腦內(nèi)葡萄糖代謝下降，且這種下降與認知功能障礙程度密切相關(guān)［5］，因此腦內(nèi)葡萄糖代謝障礙是突觸可塑性受損的關(guān)鍵因素之一。AMPK 作為調(diào)節(jié)人體能量代謝的關(guān)鍵因子，可以在任何導致ADP/ATP、AMP/ATP 比例升高的情況下激活、增強AMPK 的磷酸化水平以抑制蛋白質(zhì)的合成、減少能量消耗，短時間內(nèi)恢復能量代謝穩(wěn)態(tài)，這是一種生理條件下細胞應對壓力的保護策略。AMPK由α、β、γ3種亞基構(gòu)成，其中α-催化亞基包含兩種亞型α1、α2，AMPK 的激活依賴于α-亞基的蘇氨酸172 位點磷酸化［6］。在病理狀態(tài)下AMPK 長時間激活會使mRNA 翻譯、合成蛋白質(zhì)這一過程受阻，導致突觸可塑性破壞和記憶形成障礙［7］，尤其是AD 患者存在糖、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應激增加等多種病理變化［8］，AMPK 磷酸化以抑制蛋白質(zhì)合成的不利影響將被進一步擴大，加速細胞應激造成的損害。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組p-AMPKα1/AMPKα1 相對表達水平增加，表明APP/PS1 小鼠腦內(nèi)存在合成代謝障礙，同時存在AMPK 高磷酸化狀態(tài)，加減薯蕷丸干預后p-AMPKα1/AMPKα1 相對表達水平下調(diào)，說明加減薯蕷丸可參與AD 能量調(diào)節(jié)，改善AMPK的過度磷酸化狀態(tài)。

eEF2K 屬于α-激酶的非典型蛋白激酶小家族，可被AMPK 磷酸化其絲氨酸366 位點而激活［9］。eEF2 是eEF2K 目前已知的唯一底物，也是蛋白質(zhì)合成延伸期間肽異位所必需的翻譯因子，eEF2 通過三磷酸鳥苷（Guanosinetriphosphate，GTP）水解促進tRNA 從核糖體的A 位點轉(zhuǎn)移到P 位點，進一步介導核糖體沿mRNA 運動，以完成肽鏈的延伸。eEF2K 能夠磷酸化eEF2 的蘇氨酸56 位點，使其失去與核糖體結(jié)合的能力，不能參與肽鏈的延長，降低蛋白質(zhì)合成水平，導致突觸重塑受阻，影響學習和記憶功能［10］。有研究者通過敲除TG19959小鼠的eEF2K 基因，eEF2 的磷酸化水平降低，且eEF2K 的減少不影響雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬體積與eEF2總水平，其蛋白質(zhì)合成增加，同時因腦內(nèi)eEF2K被抑制，認知功能得到改善［11］。eEF2磷酸化引起的翻譯控制異常，會破壞細胞穩(wěn)定性，導致神經(jīng)細胞死亡［12］。eEF2的磷酸化水平與樹突內(nèi)腦神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）合成密切相關(guān)，其可通過調(diào)節(jié)BDNF 表達改變樹突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，進而影響突觸可塑性［13］。本實驗結(jié)果顯示模型組小鼠海馬區(qū)eEF2K、eEF2 磷酸化水平高于空白組，加減薯蕷丸干預后APP/PS1 小鼠海馬區(qū)eEF2K、eEF2 磷酸化水平下調(diào)，提示加減薯蕷丸可通過調(diào)節(jié)AMPK，影響eEF2K/eEF2信號。

SYN 是突觸囊泡膜上的特定蛋白，參與突觸囊泡的轉(zhuǎn)運、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，且SYN 的表達與突觸的形成有密切關(guān)系。SYN-1 作為SYN 蛋白家族中的一員，具有調(diào)控突觸發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等作用，其含量可作為檢測突觸可塑性的指標。PSD-95 是一種位于突觸后膜胞質(zhì)一側(cè)的蛋白，包含PDZ-95/DLG-A/ZO-1（PDZ）結(jié)構(gòu)域、膜結(jié)合島苷酸激酶（GK）結(jié)構(gòu)域和Src（SH）同源結(jié)構(gòu)域［14］，其中PDZ 結(jié)構(gòu)域介導的蛋白與蛋白的相互作用在調(diào)節(jié)AMPA 受體轉(zhuǎn)運以及突觸可塑性中有重要作用［15］。PSD-95 對突觸可塑性的影響主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)樹突的發(fā)育過程和樹突棘的穩(wěn)定性，此外其還參與突觸內(nèi)部以及突觸之間的信號傳導［16］。本實驗中中藥組小鼠海馬細胞的SYN-1、PSD-95 相對表達水平均升高，說明加減薯蕷丸能夠改善APP/PS1小鼠海馬區(qū)突觸的可塑性。

AMPK 的異常磷酸化導致eEF2K/eEF2 信號激活，參與破壞突觸可塑性以及認知功能的病理過程，與中醫(yī)脾腎虧虛、髓海失養(yǎng)的病機認識相符。另有研究［17］表明，加減薯蕷丸方中制首烏、熟地黃、枸杞、黨參、茯苓、白術(shù)等健脾補腎藥物均可參與人體的能量代謝調(diào)節(jié)。

綜上所述，加減薯蕷丸可通過抑制AMPK 的過度磷酸化，影響下游eEF2K/eEF2 信號，增加突觸蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)突觸可塑性而發(fā)揮抗AD作用。