蛭龍活血通瘀膠囊對家兔頸動脈粥樣硬化斑塊組織p-NF-κB、NLRP3 表達(dá)的影響?

劉孟楠，羅 鋼，劉 平，劉佳利，劉 顏，周 華，楊思進(jìn)△

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 瀘州646000；2 澳門科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）危害巨大，是誘發(fā)冠心病、心肌梗死、腦梗死等疾病的主要原因［1］。血脂代謝紊亂與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在動物實(shí)驗(yàn)研究、流行病學(xué)研究及臨床試驗(yàn)中已達(dá)到共識［1］。近年來研究報道膽固醇結(jié)晶可作為內(nèi)源性信號分子激活NLRP3 炎癥小體，促進(jìn)炎癥因子的成熟與分泌，介導(dǎo)AS早期炎癥反應(yīng)［2］，而核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)磷酸化與NLRP3炎癥小體的激活關(guān)系密切，通過活化NFκB模式識別受體或細(xì)胞因子受體可啟動NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［3］，表明p-NF-κB、NLRP3炎癥小體參與了AS的發(fā)生和發(fā)展。

目前對于AS 及血脂紊亂的治療重點(diǎn)在于改善低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），隨著他汀類藥物的廣泛應(yīng)用，血脂的調(diào)理更為科學(xué)有效，但AS 的危險性仍然存在［4］。針對AS誘發(fā)的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，楊思進(jìn)教授研發(fā)蛭龍活血通瘀膠囊“補(bǔ)氣通絡(luò)，活血化瘀，化痰祛風(fēng)”，治療AS 類疾病中取得了較好效果，為補(bǔ)氣、活血、祛風(fēng)、化痰類中成藥改善血脂代謝及防治AS提供了策略［5］。本研究旨在探討蛭龍活血通瘀膠囊對高脂血癥頸動脈粥樣硬化家兔血脂的影響及該藥物改善頸動脈病變組織p-NF-κB及NLRP3的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級新西蘭大白兔40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.0±0.4）kg，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（川）2018-065。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，光照每日12 h，室溫19～22℃，濕度40～60%飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院動物倫理委員會審查。

1.2 藥品與試劑基礎(chǔ)飼料由西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料配方（以下均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：96%的普通飼料、2%的膽固醇、2%的豬油。蛭龍活血通瘀膠囊（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑室提供，批準(zhǔn)文號：川藥字Z20070528，規(guī)格：0.4 g×48 粒/瓶）；阿托伐他?。ū本┘瘟炙帢I(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093819，規(guī)格：20 mg×7片/盒）；麗春紅、吐溫20、丙烯酰胺及BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白裂解液（RIPA）購自碧云天生物技術(shù)研究所；Tris-Hcl、NaCl 購自生工生物工程股份有限公司；0.45 μm PVDF 膜（Millipore，Schwalbach，Germany）、anti-p-NF-κB（貨號：stj28018）購自英國St John′s Laboratory；anti-NF-κB（貨 號：arp38197_p050）、anti-NLRP3 antibody（貨號：arp63297_p050）購自美國Aviva Systems Biology公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器BS224 型電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；78-1 型磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；3K15 型低溫高速離心機(jī)（Sigma公司）；冷凍離心機(jī)（HettichMikro 200R）；Berthold LB941微孔板式多功能酶標(biāo)儀（Berthold公司）；MINI-PTET 型Western blotting 系統(tǒng)型號；COMP SYS；10 W；1.0 MM、POWERPAC HC POWER SUPPLY、SEMI DRY BLOT APPARATUS（Bio-Rad 公司）；Tanon 6600發(fā)光成像工作站（Tanon公司）。

1.4 造模方法參考武曉玲等［6］報道的使用高脂飼料加空氣干燥術(shù)建立頸動脈粥樣硬化動物模型。實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前禁食12 h，不禁水，經(jīng)麻醉、頸部脫毛清潔消毒后，作頸部正中切皮，于甲狀軟骨上方水平分離左側(cè)頸總動脈，長約2.5 cm。血管兩端以動脈夾阻斷血流，使用4.5 號頭皮針于血管縱軸方向穿刺進(jìn)入阻斷血管兩端，用生理鹽水沖洗置換出管腔內(nèi)血液，接流量為250 mL/min 的氣流干燥內(nèi)皮5 min，然后將夾閉的頸動脈內(nèi)重新充滿生理鹽水并取下動脈夾使頸動脈恢復(fù)血供。濕潤棉片輕輕壓迫穿刺點(diǎn)2～3 min止血。縫合皮膚創(chuàng)口并包扎。術(shù)后肌肉注射慶大霉素預(yù)防感染，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周建立兔頸動脈粥樣硬化模型。

1.5 分組給藥方法家兔用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊組、阿托伐他汀組、蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組。除正常組繼續(xù)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組均高脂飼料喂養(yǎng)外，手術(shù)后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周。單籠喂飼，飲水不限，每日每只進(jìn)食150 g 飼料。蛭龍活血通瘀膠囊成人用量每日4.8 g，體質(zhì)量按60 kg 計算，換算為動物高劑量為含生藥3.12 g/（kg·d），為成人用量6 倍。阿托伐他汀組0.51 mg/（kg·d），為臨床成人用量3 倍。灌胃體積均為4 mL/kg［7］。

1.6 樣品采集與血脂測定第4 周末動物禁食不禁水12 h，采用空氣注射法處死家兔，股動脈采血。血樣室溫自然凝固，4℃、離心半徑8 cm，3000 r/min 離心10 min，分離血清。采用全自動生化儀檢測血清膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）以及LDL-C 水平；沿前期頸部造模處位置做一正中切口，暴露頸總動脈，分離動脈鞘及周邊組織，截取造模處頸動脈組織約2 cm備用。

1.7 頸動脈組織總蛋白提取和免疫印跡分析稱取頸動脈組織約50 mg，用干凈的剪刀將組織塊剪碎；加400μL RIPA 裂解液于勻漿器中進(jìn)行勻漿，離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清，BCA 定量。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育相應(yīng)的一抗，4℃過夜，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。然后將膜置于封閉袋中，加入適量適當(dāng)濃度的二抗，封閉袋口，室溫下孵育1 h。剪開自封袋，用TBST洗膜3次，每次10 min。等體積混合化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液，將膜蛋白面向下與此混合液充分接觸；5 min 后用Tanon 6600 發(fā)光成像工作站進(jìn)行檢測，并使用Image Pro Plus 6.0 軟件分析光密度值，檢測p-NF-κB、NF-κB、NLRP3蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.8 HE 染色分離1 cm 長的頸動脈組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋并制成4 μm 石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水，切片入蘇木素染液染后，沖洗分化反藍(lán)，經(jīng)伊紅染色后脫水封片。400 倍光鏡下觀察組織情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況家兔一般狀況良好，實(shí)驗(yàn)過程中各組家兔未出現(xiàn)厭食、消瘦、明顯不能耐受藥物等副作用表現(xiàn)及突發(fā)的急性死亡。各組家兔體質(zhì)量呈生理性增長，在第0、2、4 周組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組家兔不同時間體質(zhì)量比較（±s） kg

表1 各組家兔不同時間體質(zhì)量比較（±s） kg

2.2 血脂水平與正常組比較，模型組TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平均升高（P＜0.01），提示高脂血癥模型造模成功；各用藥組HDL-C 均有所升高，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組TC、TG、LDL-C 水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各給藥組TC、TG 水平下降（P＜0.01），阿托伐他汀組及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組LDL-C降低（P＜0.01），蛭龍活血通瘀膠囊可一定程度上降低LDL-C，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與阿托伐他汀組相比，蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組降低TC的效果更明顯（P＜0.01），蛭龍活血通瘀膠囊組及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀降低LDL-C 的作用較阿托伐他汀組更強(qiáng)（P＜0.05）；各給藥組及模型組間HDL-C 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組家兔血脂水平比較（±s） mmol/L

表2 各組家兔血脂水平比較（±s） mmol/L

注：與正常組比較，##表示P＜0.01；與模型組比較，**表示P＜0.01；*表示P＜0.05；與阿托伐他汀組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05

2.3 頸動脈組織p-NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)與模型組相比，蛭龍活血通瘀膠囊組、阿托伐他汀組和蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組p-NF-κB、NLRP3水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組比較，蛭龍活血通瘀膠囊組p-NF-κB、NLRP3 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），阿托伐他汀組p-NF-κB 水平高于蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 頸動脈組織p-NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)

2.4 頸動脈形態(tài)學(xué)改變藥物干預(yù)4 周后，光鏡下正常組家兔頸動脈內(nèi)皮完整，分界較清晰，內(nèi)膜光滑，平滑肌細(xì)胞完整，排列整齊；模型組頸動脈內(nèi)大量脂質(zhì)沉積并有向管腔內(nèi)凸起的斑塊，中膜內(nèi)層出現(xiàn)斷裂，平滑肌細(xì)胞顯著增生，可見由大量泡沫細(xì)胞構(gòu)成的脂質(zhì)斑塊，斑塊內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤并有變性壞死；治療后蛭龍活血通瘀膠囊組，阿托伐他汀組和蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組炎癥細(xì)胞減少，內(nèi)皮細(xì)胞增生腫脹并有脂肪細(xì)胞浸潤，中膜平滑肌細(xì)胞腫大增生、排列紊亂頸動脈內(nèi)膜有粥樣斑塊沉積，其中蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組內(nèi)皮細(xì)胞下有脂質(zhì)沉積，其形態(tài)學(xué)變化接近于正常組。見圖2。

圖2 各組家兔頸動脈病理變化（HE，×400）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，蛭龍活血通瘀膠囊可以降低高脂血癥頸動脈粥樣硬化家兔TC、TG，降低頸動脈病變組織NF-κB 的磷酸化及NLRP3 蛋白的表達(dá)。蛭龍活血通瘀膠囊是楊思進(jìn)教授在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開發(fā)的中藥復(fù)方制劑，由黃芪、桂枝、大血藤、水蛭、地龍等藥組成。該中藥復(fù)方制劑在治療腦卒中、冠心病、血栓性疾病等方面臨床反饋較好［5-7］。在蛭龍活血通瘀膠囊的前期研究中吳英等［8］證實(shí)該藥物可降低高脂血癥大鼠血脂水平。楊思進(jìn)等［9］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蛭龍活血通瘀膠囊可以降低家兔預(yù)動脈NF-κB、ICAM-1 表達(dá)，改善高血壓頸動脈粥樣硬化模型家兔頸動脈AS 病變。前期研究與本研究結(jié)果一致，表明蛭龍活血通瘀膠囊抗AS作用確切。

高脂血癥被認(rèn)為是AS 發(fā)生的主要危險因素，脂質(zhì)浸潤學(xué)說認(rèn)為基于脂質(zhì)沉積而形成的斑塊是由于血液中脂質(zhì)水平過高從而滲透至血管內(nèi)膜造成，且有研究報道AS 的發(fā)生與TC 升高呈正相關(guān)［4］。AS 形成需要NLRP3 炎性小體的活化參與，膽固醇晶體通過激活NLRP3 炎性小體，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙誘導(dǎo)AS 的發(fā)生［10-11］。NLRP3 炎癥小體的活化需要啟動和激活雙重信號調(diào)控，NF-κB 介導(dǎo)了啟動過程，磷酸化的NF-κB可上調(diào)NLRP3等相關(guān)炎性因子前體表達(dá)，因此p-NF-κB 為NLRP3 活化提供物質(zhì)基礎(chǔ)［12］。通過抑制p-NF-κB 降低NLRP3 及相關(guān)炎性因子前體的表達(dá)從而抑制NLRP3炎癥小體的激活［13-14］。

本研究采用高脂飼料加空氣干燥術(shù)建立頸動脈粥樣硬化動物模型［9］。該造模方法成熟，成功率高，易于復(fù)制，可在較短時間誘發(fā)兔頸動脈粥樣硬化并形成斑塊。阿托伐他汀是目前臨床常用的降血脂藥物，故本實(shí)驗(yàn)將其選為對照藥物［15-16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛭龍活血通瘀膠囊可以降低高脂血癥頸動脈粥樣硬化家兔TC、TG，抑制頸動脈病變組織p-NF-κB、NLRP3 表達(dá)，可以通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗血栓及對抗脂質(zhì)浸潤的作用來抑制高脂血癥動脈粥樣硬化動物模型頸動脈斑塊的形成，且蛭龍活血通瘀膠囊與阿托伐他汀聯(lián)合可提高療效。因此，蛭龍活血通瘀膠囊發(fā)揮抗AS 的作用機(jī)制可能是通過改善血脂、抑制NF-κB 的磷酸化及NLRP3 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，但其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。