南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的制備及其活性研究

黨慧敏，鄭平安，趙文浩，王 斌

(1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022；2.浙江海力生生物科技股份有限公司，浙江舟山 316022)

南極磷蝦Euphausia superba 生物量可達(6.5～10)×108t，是世界上最大的生物資源之一[1-3]。研究表明南極磷蝦富含多種營養(yǎng)成分和功能分子，其脂質含量約為2.11%，主要是不飽和脂肪酸，易于人體吸收，能夠預防老年癡呆、降壓、降脂、預防冠心病及動脈粥樣硬化、提高免疫力和降低心血管疾病發(fā)病率[4];蛋白質含量超過60%，含人體所需的8 種必需氨基酸，生物效價遠高于肉類蛋白質和牛乳蛋白質[5-7]；南極磷蝦的甲殼中含有的蝦青素能預防腎病、糖尿病、增強免疫力、促進生長繁殖，甚至起到減肥的功效[8]；此外，南極磷蝦富含維生素A、維生素E、鈣、鎂、鋅、磷、碘、鐵和硒等[9]。因此，南極磷蝦具有可觀的經(jīng)濟和研究價值。

肽是介于氨基酸和蛋白質之間以肽鍵將氨基酸鏈接形成的一類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、消除疲勞、抗菌、抗高血壓和抗炎等生物活性，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等較多的領域具有廣闊市場前景[10-12]。海洋生物長期生活在高鹽、高壓、低溫、缺氧等極端環(huán)境中，其蛋白質的氨基酸組成或序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，潛在著許多具有生物活性的氨基酸序列[13]。因此，以海洋生物蛋白資源為原料，利用酶工程技術開發(fā)天然、高效、新穎的海洋蛋白酶解物或者活性肽成為研究焦點[13-15]。例如：李亞會等[16]利用動物蛋白水解酶和風味酶水解擬沙丁魚Sardinops sagax 蛋白，利用超濾獲得的抗氧化肽，可調節(jié)細胞中失衡的抗氧化體系，顯示良好的保護作用。鄧志程等[13]利用酶解、超濾和色譜技術制備馬氏珠母貝Pinctada martensii 免疫活性肽AR/PM 和VR，可顯著促進脾淋巴細胞的增殖與提高巨噬細胞的吞噬能力。張元元[17]采用超濾膜法分離南極磷蝦多肽，MW≤5 ku 的多肽超氧陰離子、羥自由基和DPPH 自由基的清除能力最佳，并對小鼠模型表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

南極磷蝦是重要的蛋白資源，以其為原料制備蛋白酶解物或者活性肽也備受關注。ZHAO Yuqin,et al[18]從南極磷蝦胰蛋白酶酶解物中制備了8 個ACE 抑制寡肽，其中Phe-Ala-Ser (FAS) 可促進HUVEC 細胞中內(nèi)源性舒張因子(NO)的釋放，抑制內(nèi)皮素(ET-1)的生成。XIA Guanghua,et al[21]證明磷酸化的南極磷蝦多肽可以顯著的阻止去卵巢大鼠骨質量的降低，改善松質骨結構和生物化學特性。HOU Hu,et al[20]發(fā)現(xiàn)南極磷蝦寡肽VLGYIQIR 可以作為一種新型的鈣補充劑?；诖?，本實驗以自由基清除率為指標，篩選制備南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物(EPAH)的最適酶種，并對其氨基酸組成和抗氧化活性進行綜合分析，為南極磷蝦資源的高值化利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦蝦粉(脫脂)由浙江海力生生物科技股份有限公司提供。張氏肝細胞(Chang liver)購買于中國科學院上海細胞庫?；钚匝?ROS)測試盒購買于南京建成生物工程有限公司。胰蛋白酶(200 000 U·g-1)、堿性蛋白酶(160 000 U·g-1)、胃蛋白酶(500 000 U·g-1)、中性蛋白酶(50 000 U·g-1)和風味蛋白酶(300 000 U·g-1)購買于上海源聚生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶種類篩選

將南極磷蝦蝦粉(脫脂)按照料液比1:20 加入到酶解溶液中，攪拌均勻。選用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶，在其最佳酶解條件下(表1)進行酶解。雙酶體系(胃蛋白酶+胰蛋白酶)制備EPAH 時，溶液pH 首先調至2.0，加入1.0%胃蛋白酶，于37 ℃酶解2 h；然后將溶液pH 調至8.0，加入1.0%胰蛋白酶，于37 ℃酶解2 h。酶解液于沸水浴滅酶10 min，以4 000 r·min-1的條件下離心15 min，舍棄下層沉淀，上清液冷凍干燥得南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物(EPAH)，以DPPH 自由基(DPPH·)和羥基自由基(HO·)清除率為指標評價EPAH，篩選最適酶種及其組合。

表1 5 種蛋白酶的酶活力及最適溫度和pHTab.1 The enzyme activity,optimum temperature and pH of the five enzymes

1.2.2 自由基清除和脂質過氧化抑制實驗

DPPH·和HO·清除率實驗參照文獻[21-22]描述的方法進行。脂質過氧化抑制實驗參照文獻[23-24]描述的方法進行。

1.2.3 氨基酸組成成分分析

參照GB 5009.124-2016 使用氨基酸分析儀進行測定。按照聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO) 1973 年建議的氨基酸評分標準模式[25]和中國預防醫(yī)學科學院提出的雞蛋蛋白質評分標準模式進行比較分析，包括：氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)[26]。

1.2.4 細胞氧化損傷保護實驗

1.2.4.1 氧化損傷模型的建立

將張氏肝細胞按照1.5×105個/孔接種于4 個96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中孵育24 h后，繼續(xù)將每個96 孔板分為空白對照組和8 個實驗組，空白組加入20 μL 細胞培養(yǎng)基，8 個實驗組分別加入20 μL 的雙氧水(H2O2)使其終濃度分別為100、200、300、400、500、600、700 和800 μmol·L-1，平行6 個復孔。培養(yǎng)12 h 后，加入20 μL 5 mg·mL-1的噻唑藍(MTT)溶液，培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)液體倒置在吸水紙上吸干，每孔再加入150 μL 的二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃避光震蕩15 min，于570 nm 波長測定吸光值(OD)。細胞存活率按以下公式計算：

式中：CSR 為細胞存活率，%；OD實驗組為實驗組吸光值；OD空白對照組為空白對照組吸光值。

1.2.4.2 南極磷蝦蛋白水解物對氧化損傷張氏肝細胞細胞給藥濃度的篩選

將制好的細胞懸液接種于96 孔板。待細胞貼壁后加雙氧水處理12 h，建立張氏肝細胞氧化損傷模型。同時將細胞分為空白組、10 mg·mL-1、20 mg·mL-1、30 mg·mL-1EPAH 給藥組培養(yǎng)24 h，通過MTT 實驗檢測EPAH 對細胞存活率的影響。

1.2.4.3 南極磷蝦蛋白水解物對氧化損傷張氏肝細胞細胞存活率的測定

將張氏肝細胞接種于96 孔板，建模后將細胞分為空白組、模型組、EPAH 組和GSH 組，以最佳濃度的EPAH (15 mg·mL-1)干預24 h，再檢測細胞存活率。

1.2.4.4 細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測定

細胞前處理方法同1.2.3.1，在加入20 μL 雙氧水(H2O2)的同時加入10 μmol·L-1的熒光染料2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，并在恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2 次。通過熒光顯微鏡(激發(fā)/發(fā)射波長為485 nm/535 nm)進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶種類的篩選

蛋白酶的種類顯著影響蛋白酶解物的分子量及其活性[2,24]。因此，本實驗利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶對南極磷蝦蝦粉進行酶解，并比較5 種EPAH 的自由基清除活性。

圖1A 結果表明：在15.0 mg·mL-1的樣品濃度下，胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的DPPH·清除率分別為44.09%±1.04%和46.7%±2.39%，顯著高于中性蛋白酶(35.28%±2.33%)、風味蛋白酶(32.54%±1.86%)、堿性蛋白酶(41.12%±1.2%)EPAH 的DPPH·清除率(P＜0.05)，且胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的DPPH·清除率無顯著性差異(P＞0.05)。圖1B 結果表明：在15 mg·mL-1的樣品濃度下，胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的HO·清除率分別為35.76%±1.58%和33.03%±1.71%，顯著高于中性蛋白酶(29.39%±1.57%)、風味蛋白酶(23.53%±1.35%)、堿性蛋白酶(28.13%±2.36%)EPAH 的HO·清除率(P＜0.05)，且胰蛋白酶和胃蛋白酶EPAH 的HO·清除率無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 5 種南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的DPPH 自由基(A)和羥基自由基(B)清除活性Fig.1 DPPH radical (A) and hydroxide radical (B) scavenging rate of five antioxidant hydrolysates of E.superba protein

圖2 結果表明：在15 mg·mL-1的樣品濃度下，雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)制備的EPAH 的DPPH·和HO·清除率分別為55.49%±3.05%和48.94%±1.11%，顯著高于胰蛋白酶和胃蛋白酶制備的EPAH (P＞0.05)。因此，選取雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)制備EPAH。

圖2 胰蛋白酶、胃蛋白酶和雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的DPPH 自由基(A)和羥基自由基(B)清除率Fig.2 DPPH radical (A) and hydroxide radical (B) scavenging rates of antioxidant hydrolysates of E.superba protein using pepsin,trypsin,and double enzyme system (pepsin+trypsin),respectively

2.2 南極磷蝦蛋白水解物(EPAH)的氨基酸組成分析

EPAH 氨基酸組成如表2 所示。測定17 種氨基酸，其中包括Val、Met、Ile、Leu、Thr、Phe 和Lys 7 種必需基酸，His 和Arg 2 種半必需氨基酸，Gly、Ala、Pro、Asp、Ser、Cys、Glu 和Tyr 8 種非必需氨基酸，總氨基酸(WTAA)含量為62.72%±0.42%，必需基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸分別占總氨基酸含量的26.17%±0.16%、5.64%±0.03%和30.91%±0.24%。

表2 南極磷蝦蛋白水解物的氨基酸組成分析(,n=3)Tab.2 The contents of amino acids in protein hydrolysate of E.superba

表2 南極磷蝦蛋白水解物的氨基酸組成分析(,n=3)Tab.2 The contents of amino acids in protein hydrolysate of E.superba

注:* 鮮味氨基酸；** 必須氨基酸.

南極磷蝦蛋白水解物必需氨基酸的AAS、CS和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)計算結果(表3)顯示：AAS 第一限制性氨基酸為纈氨酸(Val)，評分為0.75，其次是蘇氨酸(Thr)，評分為0.76；苯丙氨酸+酪氨酸(Phe+Tyr)評分最高，AAS為1.04，其次為賴氨酸(Lys)，AAS 為1.09。在CS中，賴氨酸(Lys)的化學評分最高，為0.75，其次是蘇氨酸(Thr)，為0.65，最低的是甲硫氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)，CS為0.50，其次為纈氨酸(Val)，CS 為0.57。金槍魚魚卵必需氨基酸指數(shù)EAAI 值為63.02。必需氨基酸/氨基酸總量(WEAA/WTAA)的值為40.73%，WEAA/WNEAA 的值為84.67%。

表3 南極磷蝦蛋白水解物的氨基酸評分(AAS)和化學評分(CS)Tab.3 Amino acids scores (AAS) and chemical score(CS) in protein hydrolysate of E.superba

2.3 南極磷蝦蛋白水解物脂質過氧化抑制活性

抗氧化物結構的不同，對自由基清除的機制和能力有所差異。因此，常采用脂質過氧化抑制實驗綜合評估蛋白水解物的抗氧化能力[18,24]。以谷胱甘肽(GSH)為陽性對照物，將濃度為15.0 mg·mL-1的EPAH 加入到實驗體系中，每天記錄500 nm 吸光值?；衔锏目寡趸芰υ綇姡鋵営退嵫趸囊种谱饔镁驮酱?，500 nm 吸光值上升緩慢。

圖3 結果表明：空白對照組500 nm 吸光值變化最大，在7 d 時間里迅速上升，表明亞油酸的氧化程度最高；谷胱甘肽(GSH)組500 nm 吸光值變化最小，說明GSH 具有最強的抗氧化能力，很好地抑制了亞油酸的氧化變質；EPAH 組500 nm 吸光值顯著低于空白對照組，說明其可以較好地抑制系統(tǒng)中亞油酸的過度氧化。因此，南極磷蝦蛋白水解物具有明顯的脂質過氧化抑制能力，但活性低于GSH。

圖3 南極磷蝦蛋白水解物的抗脂質過氧化能力Fig.3 Lipid peroxidation inhibition assays of protein hydrolysate of E.superba

2.4 南極磷蝦蛋白水解物對氧化損傷張氏肝細胞的保護作用

2.4.1 張氏肝細胞氧化損傷模型的建立

以MTT 檢測不同濃度H2O2對張氏肝細胞存活率的影響，細胞存活率在50%左右為建模最佳濃度[27]。圖4 結果表明：雙氧水(H2O2)濃度對張氏肝細胞存活率有顯著性的影響(P＜0.05)，隨著雙氧水濃度的增加，細胞存活率顯著下降，在300 μmol·L-1濃度下，細胞存活率為47.61%±3.92%。因此，選擇濃度為300 μmol·L-1的H2O2建立張氏肝細胞氧化損傷模型。

圖4 雙氧水濃度對張氏肝細胞存活率的影響Fig.4 Effects of H2O2 concentration on viability of Chang liver cells

2.4.2 南極磷蝦蛋白水解物對氧化損傷張氏肝細胞細胞存活率的影響

圖5A 結果表明：EPAH 作用張氏肝細胞24 h 后，細胞存活率均保持在90%以上，與空白組無顯著性差異(P＞0.05)。說明EPAH 在0～30 mg·mL-1濃度下對張氏肝細胞的增殖沒有顯著的抑制作用。圖5B 結果表明：在15 mg·mL-1濃度下，EPAH 將張氏肝細胞的存活率提高到57.98%±2.57%，顯著高于模型組(47.61%±3.92%) (P＜0.01)，但其活性略低于陽性對照GSH。因此，EPAH 可以顯著降低H2O2對張氏肝細胞的氧化損傷。

圖5 南極磷蝦蛋白水解物對張氏肝細胞(A)和氧化損傷張氏肝細胞(B)存活率的影響Fig.5 Effects of protein hydrolysate of E.superba on viability of Chang liver cells (A) and H2O2 damaged Chang liver cells (B)

2.4.3 南極磷蝦蛋白水解物對氧化損傷張氏肝細胞活性氧(ROS)水平的影響

圖6 結果表明：模型組較對照組張氏肝細胞中ROS 水平顯著性升高(P＜0.001)，說明所建氧化損傷模型可用。與模型組相比，15 mg·mL-1濃度的EPAH 可以顯著降低H2O2損傷的張氏肝細胞內(nèi)的ROS 水平(P＜0.01)，降低H2O2對細胞的氧化損傷。

圖6 南極磷蝦蛋白水解物對氧化損傷張氏肝細胞活性氧水平的影響Fig.6 Effects of protein hydrolysate of E.superba on level of reactive oxygen species of H2O2 damaged Chang liver cells

3 結論

南極磷蝦是目前儲量最豐富的海洋優(yōu)質蛋白資源，其高值化開發(fā)利用備受關注。本實驗以DPPH·和HO·清除率為導向，篩選出雙酶體系(胰蛋白酶和胃蛋白酶)制備南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物。制備的南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物富含必需基酸和半必需氨基酸，必需氨基酸指數(shù)(EAAI)為63.02，具有較高的營養(yǎng)價值。另外，南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物具有顯著的脂質過氧化抑制作用。用南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物配成一定濃度的溶液，建立細胞氧化損傷模型，測定ROS 水平變化情況，以此為指標來衡量南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的抗氧化活性強弱。實驗結果表明，15 mg·mL-1的酶解物抗氧化活性較好。本實驗為進一步進行南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物抗氧化活性機制研究提供了一定的參考價值，可通過測定南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物的氨基酸序列來驗證本實驗結果。因此，雙酶體系(胰蛋白酶+胃蛋白酶)制備的南極磷蝦蛋白抗氧化酶解物為抗氧化功能產(chǎn)品的研發(fā)提供了一定的方向。