高效液相色譜法測定飼料添加劑吡咯喹啉醌二鈉含量

胡朝陽

（福建省產(chǎn)品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

吡 咯 喹 啉 醌 （ pyrroloquinoline quinone，PQQ） 是繼煙酰胺和核黃素后于微生物中發(fā)現(xiàn)的又一種氧化還原酶輔酶， 廣泛存在于原核生物、植物和哺乳動物的生物組織中。 PQQ 具有抗氧化、 促進神經(jīng)生長因子再生等多種功能。 在飼料應用中， 吡咯喹啉醌二鈉鹽 （PQQ-2Na） 是吡咯喹啉醌 （PQQ） 的最常用形式。 相關研究表明， 吡咯喹啉醌二鈉鹽具有較強的抗氧化能力，能夠調節(jié)蛋雞機體的抗氧化能力和代謝能力，促進蛋雞尤其是初生蛋雞的早期發(fā)育生長能力，因此作為飼料添加劑在飼料中有著廣泛的應用前景。

目前， 吡咯喹啉醌的測定方法主要是高效液相色譜法 （HPLC）， 針對的是吡咯喹啉醌純物質。 飼料添加劑中吡咯喹啉醌二鈉鹽的檢測還未見報道。 本文建立了高效液相色譜法測定飼料添加劑吡咯喹啉醌二鈉。 該方法簡單快速，重現(xiàn)性好， 適用于飼料添加劑吡咯喹啉醌二鈉的定量檢測， 可為飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)、 飼料添加劑監(jiān)督部門及進出口檢測部門提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測器 （美國安捷倫科技有限公司）； DS-8510 超聲波發(fā)生器 （上海生析超聲儀器有限公司）； 分析天平 （賽多利斯北京有限公司）； Milli Q 超純水制備器 （美國密理博有限公司）。 乙腈（色譜純， 山東禹王實業(yè)有限公司）， 其它試劑均為分析純。

對照品： 吡咯喹啉醌二鈉 （PQQ-2Na， 純度86.5%） 由福建優(yōu)佰福生物科技有限公司提供。

1.2 溶液配制

稀釋液： 稱取1.13g 磷酸氫二鈉和0.95g 磷酸二氫鈉溶解于500mL 純水中。

流動相鹽溶液： 稱取3.87g 四丁基溴化銨和1.632g 磷酸二氫鉀溶解于600mL 純水中。

標準儲備液的配制： 準確稱取吡咯喹啉醌二鈉對照品各0.1501g， 用稀釋液溶解并定容至100mL， 配制得濃度均為1.30mg/L 的標準儲備液。

標準工作溶液的配制： 將吡咯喹啉醌二鈉的標準儲備液采用逐級稀釋法用稀釋液配制濃度為0.2mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 5.0mg/L、 9.8mg/L、49.0mg/L 的系列標準工作溶液。 所有標準儲備液和標準工作溶液置于冰箱中于0℃～4℃溫度下保存。

1.3 樣品預處理

稱取飼料添加劑樣品 0.1g （ 精確至0.0001g） 于25mL 具塞比色管中， 加入8mL 稀釋液， 置于超聲波振蕩器中超聲萃取20min， 用稀釋液定容至刻度線并混勻， 以水相濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 高效液相色譜條件

色 譜 柱： Welch ultimate XB -C 18 柱（4.6mm×250mm， 5 μm， 月旭科技 （上海） 股份有限公司)。 柱溫： 35℃。 流動相： 乙腈 （A） -流動相鹽溶液 （B） =40/60 等度洗脫； 洗脫時間： 12min； 進樣量5 μL； 檢測波長249nm。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

為了考察檢測波長對目標化合物檢測靈敏度的影響， 利用DAD 檢測器在210nm～800nm波長范圍內對標準溶液進行掃描， 得到吡咯喹啉醌二鈉的紫外—可見分光譜圖 （見圖1）。 為消除溶液中有紫外吸收的雜質在低波長處的干擾， 最終選擇249nm 作為檢測波長。

2.1.2 色譜柱和流動相的選擇

實 驗 比 較 了 Silversil C18柱 （ 4.6mm ×250mm， 5μm）、 和Welch ultimate R XB-C18柱（4.6mm×250mm， 5μm） 這2 種分析柱以及不同流動相體系對吡咯喹啉醌二鈉的分離效果 （見圖2）。 實驗結果表明， 當流動相體系為乙腈/水時， 目標物在Welch ultimate R XB-C18柱上無法出峰 （見圖2A）； 當流動相體系為乙腈/流動相鹽溶液時， 在Welch ultimate R XB-C18柱上可得到較理想的分離效果， 吡咯喹啉醌二鈉色譜峰的靈敏度高且出峰時間適宜 （見圖2B）；在Silversil C18柱上達到基線分離， 但出峰較靠前， 可能受雜質峰干擾， 影響定量 （見圖2C）。因此本文選用Welch ultimate R XB-C18柱作為分析柱， 以乙腈/流動相鹽溶液為流動相進行梯度洗脫檢測。

圖1 吡咯喹啉醌二鈉的紫外—可見光譜圖

圖2 采用不同色譜柱和不同流動相時吡咯喹啉醌二鈉的色譜圖

2.2 線性方程、 線性關系、 檢出限及定量限

配制吡咯喹啉醌二鈉濃度為13.0mg/L 到520mg/L 之間的系列混合標準工作溶液， 以峰面積對濃度進行線性回歸， 線性方程、 相關系數(shù)見表1。 結果表明， 吡咯喹啉醌二鈉在13.0mg/L～520mg/L 內具有很好的線性關系， 相關系數(shù)r 為0.9997， 方法定量限完全能滿足飼料添加劑中吡咯喹啉醌二鈉的檢測要求。

表1 吡咯喹啉醌二鈉的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍

表2 飼料添加劑樣品加標回收率實驗結果（n＝3）

2.3 方法回收率和精密度

在優(yōu)化后的檢測條件下， 取空白基質酵母粉樣品進行加標回收率測試， 加標水平分別為5.2%， 10.4%， 20.8%， 每個水平重復分析3 次，結果見表2。 從表2 中可知， 該方法的加標回收率范圍為101.7%～102.2%， 相對標準偏差RSD范圍為0.7%～3.6%， 結果表明， 該方法適用于飼料添加劑中吡咯喹啉醌二鈉的日常分析檢測。

2.4 穩(wěn)定性

取標準曲線范圍內13.0mg/L、 130mg/L 和520mg/L 三個質量濃度的吡咯喹啉醌二鈉標準溶液， 于室溫下放置2h， 4h， 6h， 8h， 12h 和2～6天， 考察吡咯喹啉醌二鈉標準溶液日內和日間穩(wěn)定性。 實驗結果表明， 低、 中、 高三個質量濃度的吡咯喹啉醌二鈉標準溶液日內穩(wěn)定性的精密度分別為0.2%～0.9%、 0.1%～0.5%和0.1%～0.9%， 日間穩(wěn)定性的精密度分別為0.2%～1.3%、0.1%～0.8%和0.1%～1.1%。 由此可見， 吡咯喹啉醌二鈉日內和日間穩(wěn)定性均較好， 有利于實驗的進行。

3 結論

本文采用高效液相色譜法對飼料添加劑吡咯喹啉醌二鈉含量進行分析檢測。 該方法采用稀釋液超聲萃取， 過膜上機， 操作簡單快速，適合飼料添加劑樣品的大批量前處理。 實驗結果表明， 所建立的飼料添加劑吡咯喹啉醌二鈉具有良好的精密度和回收率， 方法日內和日間穩(wěn)定性均較好， 完全能夠滿足飼料添加劑中吡咯喹啉醌二鈉的日常監(jiān)測。 該方法簡便快速，重現(xiàn)性好， 適用于飼料添加劑中吡咯喹啉醌二鈉的定量檢測， 可為飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)、 飼料添加劑監(jiān)督部門及進出口檢測部門提供技術支持。

參考文獻 （略）