HPLC法測定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量

孔凡建 劉然

摘要：目的建立一種高效液相色譜法來測定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）為流動相，柱溫30℃，檢測波長為350nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果在上述色譜條件下，復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量在2.4076～38.5220μg·mL-1（R=0.9998）線性關(guān)系良好（R=0.9998），回歸方程為y=25.69x-18.127，測得平均加樣回收率為100.13%，RSD為1.48%（n=9）。結(jié)論所建立的方法簡便準(zhǔn)確，可用于測定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量，可為其質(zhì)量控制與評價提供參考。

關(guān)鍵詞：復(fù)方金銀花顆粒;木犀草苷;高效液相色譜;含量測定

中圖分類號：R927.11文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號：1007-2349（2021）02-0071-04

復(fù)方金銀花顆粒由金銀花、連翹、黃芩三味中藥組成，具有清熱解毒，涼血消腫的功效，用于風(fēng)熱感冒，喉痹，乳蛾，目痛，牙痛及癰腫瘡癤等癥[1]。處方中金銀花和連翹均為清熱解毒類中藥的代表，兩者均有清熱解毒的功效，在抗菌、抗炎、抗病毒等方面效果顯著[2]。黃酮類的木犀草苷和有機(jī)酸類的綠原酸是金銀花中重要的活性成分，也是對其進(jìn)行質(zhì)量評價時的指標(biāo)成分。其中，木犀草苷具有較強(qiáng)的殺菌消炎，解熱鎮(zhèn)痛的功效，在抗病毒和抗腫瘤方面表現(xiàn)出較好的作用[3]，也具有較低的肝毒性，對肝細(xì)胞有保護(hù)作用。2005年版《中國藥典》把木犀草苷的含量列為了金銀花質(zhì)量的評價標(biāo)準(zhǔn)之一，并且首次確定了對金銀花藥材采用高效液相色譜法測定其中木犀草苷的含量;連翹中主要成分為連翹酯苷、連翹苷、皂苷等，有研究從注射用雙黃連（凍干）的連翹中共分離得到了39個化合物，黃酮類化合物有8個，其中就包含木犀草苷，說明連翹中也含木犀草苷[4];黃芩中富含多種黃酮類化合物，其中包括黃芩苷及黃芩素等，但尚未報道其是否含有木犀草苷。黃芩具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤，心血管保護(hù)、抗高血糖及預(yù)防并發(fā)癥等作用[5]。

復(fù)方金銀花顆?，F(xiàn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑·第十冊》（WS3-B-1985-950），標(biāo)準(zhǔn)中僅收載有對該制劑進(jìn)行理化鑒別，黃芩苷的薄層色譜鑒別項(xiàng)以及常規(guī)檢查的方法，尚未收載含量指標(biāo)測定的方法，不利于質(zhì)量控制。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前已有一些學(xué)者對復(fù)方金銀花顆粒研究、建立了多種有效成分含量測定的方法。比如：何悅[6]、范婉思[7]、唐勵靜等[8]運(yùn)用HPLC法對其中10余種成分的含量進(jìn)行了測定，為復(fù)方金銀花顆粒的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量保證提供了理論依據(jù);楊志雄等[9]運(yùn)用RP-HPLC法對其中的黃芩苷進(jìn)行了含量測定，但相關(guān)資料中并未發(fā)現(xiàn)復(fù)方金銀花顆粒中的木犀草苷含量測定的具體方法。因此，為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文以木犀草苷為復(fù)方金銀花顆粒的含量指標(biāo)，建立高效液相色譜法測定復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的含量。

1材料

1.1儀器Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱;Agilent高效液相色譜儀（型號：1260 Infinity）;北京賽多利斯BP211D電子分析天平;北京賽多利斯MSE224S-11CE-DU電子天平;上海必能信CPX5800H-C超聲波清洗儀;Carry60紫外分光光度計（安捷倫科技-中國有限公司）。

1.2試藥與試劑木犀草苷對照品（批號：111720-201810，含量：93.5%，中國食品藥品檢定研究院）;復(fù)方金銀花顆粒（廠家：廣州諾金制藥有限公司，批號：0271203、0271221、0271246，規(guī)格：10 g/袋，相當(dāng)于總藥材3.5 g）;乙腈、甲醇為色譜純（默克股份兩合公司），無水乙醇、磷酸為分析純（四川西隴科學(xué)有限公司）;水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）;以乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）為流動相;柱溫為30℃;流速為1.0 mL/min;檢測波長350nm;進(jìn)樣體積為10μL。在此色譜條件下，供試品溶液B的色譜圖與對照品溶液A的色譜圖在相應(yīng)保留時間處顯相同的峰，陰性對照品溶液C與對照品溶液A相應(yīng)的保留時間內(nèi)未出現(xiàn)色譜峰，色譜圖見圖1。

2.2溶液的制備取木犀草苷對照品10mg，精密稱定，置于100 mL的棕色量瓶中，加入70%乙醇30 mL，超聲溶解，用70%乙醇稀釋至刻度線，搖勻，即得100μg/mL的對照品貯備液，放在陰涼避光處進(jìn)行保存，備用。精密量取1 mL對照品儲備液，用70%乙醇稀釋并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得到對照品溶液。

取裝量差異項(xiàng)下的復(fù)方金銀花顆粒，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率350W，頻率50kHz）20 min，放至室溫，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

按處方比例稱取不含金銀花和連翹的其它藥材，按其制法制備陰性制劑，依法制備成陰性對照品溶液。

2.3方法學(xué)考察線性關(guān)系考察：精密量取對照品儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為2.5、5、10、20、30、40μg/mL的溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以木犀草苷對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明對照品濃度為2.4076μg/mL～38.5220μg/mL的范圍內(nèi)木犀草苷對照品的濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：A=25.69C-18.127，R=0.9998（n=6）。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μL，記錄木犀草苷峰面積。結(jié)果木犀草苷的平均峰面積為253.20802，峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明儀器的精密度良好，滿足測定要求。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品（批號：271203）6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”中所敘述的條件進(jìn)行測定，對檢測得到的峰面積進(jìn)行記錄，根據(jù)回歸方程計算木犀草苷的含量，結(jié)果木犀草苷的平均含量為0.1257mg/g，含量的RSD為0.99%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液于0、2、4、8、12、24小時進(jìn)樣測定，每次進(jìn)樣10μL，對檢測到的峰面積進(jìn)行記錄，計算木犀草苷的含量。結(jié)果木犀草苷的平均含量為0.1253mg/g，含量的RSD為0.25%（n=6），表明依上述方法制備的樣品溶液在24 h內(nèi)變化不明顯，測定結(jié)果較穩(wěn)定，能夠滿足正常測定需要。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（批號為0271203，每份約1.5 g）9份，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別在1、2、3號樣品中精密加入木犀草苷對照貯備溶液1.0 mL，在4、5、6號樣品中精密加入木犀草苷貯備溶液2.0 mL，在7、8、9號樣品中精密加入木犀草苷貯備溶液3.0 mL，依法得到供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，計算得復(fù)方金銀花顆粒中木犀草苷的回收率。結(jié)果木犀草苷的平均回收率為100.13%，RSD=1.48%（n=9），詳見表1。

樣品含量測定取3個不同批次的復(fù)方金銀花顆粒（批號為271203、271221、271246），每批平行2份，依法制備供試品溶液，按擬定色譜條件進(jìn)樣測定峰面積，并計算樣品中木犀草苷的含量，結(jié)果見表2。

3結(jié)論與討論

3.1檢測波長的選擇取木犀草苷對照品適量，用70%乙醇配制成3μg·mL-1木犀草苷對照品溶液，照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2015版四部），在200～600nm范圍下掃描，如圖2，結(jié)果顯示木犀草苷紫外最大吸收為350nm，參考文獻(xiàn)、藥典及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定檢測波長為350nm。

3.2耐用性試驗(yàn)本研究選用C18柱進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)中考察了不同品牌的C18色譜柱的分離效果，Phenomenex luna C18（250×4.6mm，5μm），漢邦Kromasil C18（250mm×4.6 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm），結(jié)果木犀草苷在三種色譜柱的分離度分別為1.85、1.61和2.12，分離度均大于1.5，結(jié)果表明不同品牌的色譜柱均能滿足檢測的需求。

3.3提取溶劑和時間選擇試驗(yàn)通過比較70%甲醇50 mL、70%乙醇50 mL作為提取溶劑，超聲提取20min，測定木犀草苷含量，發(fā)現(xiàn)兩種溶劑提取測得木犀草苷含量無差別，同時，對比25 mL70%乙醇和50 mL 70%乙醇，發(fā)現(xiàn)加入50 mL70%乙醇后，木犀草苷提取率相對較高，因此，最終選擇70%乙醇50 mL作為溶劑。試驗(yàn)還考察了加入70%乙醇后分別超聲10min、20min和30min對測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示超聲10min，測定木犀草苷的含量偏低，超聲20min和超聲30min，測得樣品中木犀草苷的含量基本一致，考慮到節(jié)省時間，因此選擇超聲20min。

目前，國內(nèi)市場上已有30多家獲批生產(chǎn)藥企生產(chǎn)復(fù)方金銀花顆粒，但是《中國藥典》還未將復(fù)方金銀花顆粒收載記錄，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對其有效成分的含量測定并未收載檢測方法，缺少對主要有效成分的指標(biāo)控制。金銀花和山銀花的化學(xué)成分、藥理作用有所差別，金銀花中木犀草苷的含量高于山銀花，解熱抗炎效果也比山銀花好，山銀花和金銀花的價格相差較大，部分商人為謀取更大的利潤，用山銀花代替金銀花，臨床用藥時出現(xiàn)藥效不足、用藥過多等問題[10]。為避免用山銀花代替金銀花來使用的現(xiàn)象，有必要對該制劑中木犀草苷的含量進(jìn)行檢測，以控制金銀花的質(zhì)量而使該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有所提高。

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（收稿日期：2020-07-15）