復(fù)方臭靈丹合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李江 陳凌云 付鵬 余曉玲

摘要：目的建立復(fù)方臭靈丹合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用TLC對(duì)桔梗和魚腥草進(jìn)行定性鑒別，依據(jù)《云南省中藥材（民族藥材）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》對(duì)其進(jìn)行分析方法驗(yàn)證及重現(xiàn)性考察。采用HPLC對(duì)合劑中的洋艾素和金絲桃苷進(jìn)行定量分析，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)方法學(xué)的考察。結(jié)果桔梗和魚腥草TLC鑒別色譜圖中，供試品與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上均顯相同顏色的特征斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，且分析方法驗(yàn)證與重現(xiàn)性考察均合格。洋艾素和金絲桃苷分別在2.59～55.47 μg/mL和4.02～51.68 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y1=43.24X-12.39（R=0.999 6）和Y2=63.82X-30.04（R=0.999 4），準(zhǔn)確度試驗(yàn)中，平均加樣回收率分別為100.06%和100.14%，RSD值分別為2.36%和2.74%（n=9），其余方法學(xué)考察均合格，洋艾素和金絲桃苷的平均含量分別為2.41 μg/mL和9.95 μg/mL。結(jié)論建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：復(fù)方臭靈丹合劑;桔梗;魚腥草;洋艾素;金絲桃苷;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2021）02-0058-06

Study on the Quality Standard of Compound Laggera Pterodonta Mixture

LI Jiang1， FU Peng1， CHEN Ling-yun1，2， YU Xiao-ling1， 3

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology Research in Universities

of Yunnan Province， Kunming 650500， China;

3. Traditional Chinese Medicine Hospital of Kunming City， Kunming 650011， China）

【Abstract】Objective： To establish the quality standard of Compound Laggera Pterodonta Mixture. Methods： TLC was used to qualitatively identify Platycodon grandiflorum and Houttuynia cordata. According to the "Technical Guidelines for Research on Quality Standards of Chinese Medicinal Materials （Ethnic Medicinal Materials） in Yunnan Province （Trial）"， the analytical methods were verified and reproducible. HPLC was used to quantitatively analyze the artemitin and hyperoside in the mixture， and the related methodology was investigated at the same time. Results： In the TLC identification chromatogram of Platycodon grandiflorum and Houttuynia cordata， the test product and the control medicinal material showed the characteristic spots of the same color on the corresponding positions， negative and no interference. The analytical method verification and reproducibility inspection were all qualified. Artemitin and hyperoside had a good linear relationship in the range of 2.59 to 55.47μg/mL and 4.02 to 51.68μg/mL， respectively. The regression equations were Y1=43.24X-12.39 （R=0.999 6） and Y2=63.82X-30.04 （R=0.9994）， respectively. In the accuracy test， the average sample recovery rates were 100.06% and 100.14%， respectively and the RSD values were 2.36% and 2.74% （n=9）， respectively. The other methodological investigations were qualified. The average contents of artemitin and hyperoside were 2.41 μg/mL and 9.95 μg/mL， respectively. Conclusion： The established quality standards are stable and feasible.

【Key words】Compound Laggera Pterodonta Mixture;Platycodon grandiflorum;Houttuynia cordata;Artemitin;Hyperoside;Quality standard

上呼吸道感染是以咳嗽、咽痛及發(fā)熱等為主要癥狀，與細(xì)菌或病毒感染有關(guān)的疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制與氣道廣泛炎癥、氣道的上皮細(xì)胞損傷、氣道高反應(yīng)性、氣道神經(jīng)炎癥、β腎上腺素能受體功能的改變、M膽堿能受體功能的改變等有關(guān)，并通過(guò)炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、免疫球蛋白等起作用[2]，其治療藥物以抗病毒及抗生素類藥物為主[3]。

復(fù)方臭靈丹合劑中臭靈丹為君藥主要含洋艾素、金腰乙素、槲皮素等黃酮類成分[4]，具有清熱解毒的功效，常用于治療上呼吸道感染[5]，魚腥藥中金絲桃苷具有抑菌抗菌的作用[6]，西青果主要含多酚，類黃酮類成分，具有抗炎，抗菌作用[7]，其余滇柴胡、桔梗等藥味對(duì)此過(guò)程亦有抑制作用[8-9]。全方合用，具清熱解毒、抗菌消炎之功，用于治療感冒、咳嗽、急性扁桃體炎、咽喉炎、腮腺炎等上呼吸道感染疾病。本研究對(duì)復(fù)方臭靈丹合劑中的兩味藥進(jìn)行了薄層鑒別，以洋艾素及金絲桃苷為含量測(cè)定指標(biāo)成分對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，為該合劑后期抗病作用及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）;Diamonsil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，迪馬科技公司）;T-1000型電子天平（美國(guó)雙杰兄弟有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）;WFH-203B三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）;SK2200HP超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;薄層層析硅膠G板（青島海洋化工分廠、青島鼎康硅膠有限公司）。

1.2藥品與試劑洋艾素對(duì)照品（批號(hào)：111879-201001）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-201507）、魚腥草對(duì)照藥材（批號(hào)：21046-201607）、臭靈丹對(duì)照藥材（批號(hào)：121231-200301）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;復(fù)方臭靈丹合劑（批號(hào)180613，180624，180712）由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1復(fù)方臭靈丹合劑的制備本品由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提取，其制備方法如下：按方稱取臭靈丹、西青果等味藥，加水煎煮2次，每次1h，濾過(guò)，濾液合并濃縮至適量，加入適量蔗糖和防腐劑，攪勻，即得。

2.2定性鑒別及其方法學(xué)考察

2.2.1桔梗的薄層鑒別及其方法學(xué)考察取本品30 mL，加硫酸0.5 mL，加熱回流1 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液加水30 mL洗滌，棄去洗液，三氯甲烷液用3 g無(wú)水硫酸鈉脫水，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液[10]。取桔梗對(duì)照藥材0.5 g，加7%硫酸乙醇-水（1∶3）混合液20 mL，自上述“加熱回流1h”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺桔梗的復(fù)方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0502進(jìn)行試驗(yàn)，以硅膠G板為吸附劑，三氯甲烷-乙醚（1∶1）為展開(kāi)劑[11]，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，105 ℃下顯色。結(jié)果顯示，供試品與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上均顯相同顏色的特征斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，分析方法驗(yàn)證及重現(xiàn)性考察中，各溶液最佳點(diǎn)樣量均為10 μL，在15 ℃，25 ℃，35 ℃，50%、75%、90%濕度下[12]桔梗的TLC鑒別無(wú)明顯差異，青島海洋化工分廠和青島鼎康硅膠有限公司的硅膠G板薄層板對(duì)鑒別無(wú)明顯影響，所選三批樣品檢定結(jié)果均合格，故所建立的TLC鑒別方法穩(wěn)定可行。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2.2魚腥草的薄層鑒別[13]及其方法學(xué)考察取本品30 mL，濃縮至10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取魚腥草對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚20 mL超聲10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取缺魚腥草的復(fù)方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0502進(jìn)行試驗(yàn)，以硅膠G板吸附劑，甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）為展開(kāi)劑，于365 nm紫外燈下檢視。各項(xiàng)結(jié)果與“2.2.1”項(xiàng)中結(jié)果相同。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3洋艾素含量測(cè)定

2.3.1溶液的制備精密稱取0.00243 g洋艾素對(duì)照品（含量以99.4%計(jì)），加甲醇定容至10 mL作為儲(chǔ)備液，取1 mL儲(chǔ)備液用甲醇定容至10 mL，作為對(duì)照品溶液（24.15 μg/mL）。本品搖勻后取100 mL，濃縮并定容至50 mL，精密移取定容液25 mL，水浴蒸干，干膏加少量甲醇浸潤(rùn)后移至50 mL容量瓶中加甲醇定容，超聲10 min，濾過(guò)，并用10 mL甲醇洗滌容量瓶及濾渣，合并濾液及洗滌液，蒸干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL，濾過(guò)，作為供試品溶液。取缺臭靈丹的復(fù)方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜條件：C18柱為色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-2%甲酸溶液[14]（45∶55）;流速1 mL/min，波長(zhǎng)350 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，供試品色譜中洋艾素色譜峰與相鄰色譜峰分離度為大于4.0，理論塔板數(shù)以洋艾素計(jì)不低于4000。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3.3線性關(guān)系及線性范圍考察精密稱取洋艾素對(duì)照品0.00279 g，加甲醇定容至5 mL，作為儲(chǔ)備液，精密移取儲(chǔ)備液1 mL，加甲醇定容至10 mL（55.47 μg/mL），取此溶液3 mL，加甲醇定容至5 mL，依次反復(fù)操作得33.28、19.97、11.98、7.19、4.31、2.59 μg/mL對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y1=43.24Y-12.39（R=0.999 6），表明洋艾素在2.59～55.47 μg/mL間線性關(guān)系良好。

2.3.4儀器精密度實(shí)驗(yàn)取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD值為0.78%，表明儀器精密良好。

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于0、4、8、12、16 h按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，峰面積RSD值分別為1.55%和1.88%，表明對(duì)照品溶液及供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品（批號(hào)180406）6份，按“2.3.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，洋艾素平均含量為2.47 μg/mL，RSD為1.67%，表明重復(fù)性較好。

2.3.7準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)精密移取同一批樣品9份（平均含量為2.47 μg/mL），每份50 mL，3份為1組，每組各精密加入0.4、0.5、0.6 mL對(duì)照品溶液（“2.3.1”項(xiàng)下中儲(chǔ)備液，241.54 μg/mL），按“2.3.1”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，平均加樣回收率為100.06%，RSD為2.36%，表明準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.8樣品中洋艾素含量測(cè)定取3批樣品，每批平行取2份，按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。結(jié)果顯示，洋艾素平均含量為2.41 μg/mL，RSD值為2.36%。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4金絲桃苷含量測(cè)定

2.4.1溶液的制備精密稱取金絲桃苷對(duì)照品（含量以94.3%計(jì)）0.00274 g，加甲醇定容至10 mL作為儲(chǔ)備液（258.38 μg/mL），移取1 mL儲(chǔ)備液用甲醇定容至10 mL配得濃度為25.84 μg/mL作為對(duì)照品溶液。本品搖勻后精密移取10 mL，加等體積水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL，濾過(guò)，作為供試品溶液。取缺魚腥草的復(fù)方臭靈丹合劑按供試品制備方法制備陰性樣品溶液。

2.4.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性色譜條件：C18柱為色譜柱;流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水（11∶6∶83）;流速1.3 mL/min，波長(zhǎng)360 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，供試品色譜中金絲桃苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于3.0，理論塔板數(shù)以金絲桃苷計(jì)不低于5000，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4.3線性關(guān)系及線性范圍考察精密移取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品制備液（258.38 μg/mL）1 mL，加甲醇定容至5 mL，取定容液3 mL加甲醇定容至5 mL，依次反復(fù)操作得51.68、31.01、18.60、11.16、6.70、4.02 μg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)，各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y2=63.82X-30.04（R=0.999 4）。結(jié)果表明，金絲桃苷在4.02～51.68 μg/mL間線性關(guān)系良好的。

2.4.4儀器精密度實(shí)驗(yàn)取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD值為0.78%，表明儀器精密良好。

2.4.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“2.4.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于0，4、8、12、16 h按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液及供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品（批號(hào)180406）6份，按“2.4.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，金絲桃苷平均含量為9.74 μg/mL，RSD為1.84%，表明此方法重復(fù)性較好。

2.4.7準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)精密移取同一批樣品9份（平均含量為9.74 μg/mL），每份5 mL，3份為1組，每組各精密加入0.15、0.2、0.25 mL對(duì)照品溶液（“2.4.1”項(xiàng)下中的儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為258.38 μg/mL），按“2.4.1”項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，平均加樣回收率為100.14%，RSD為2.74%，表明準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.8樣品中金絲桃苷含量測(cè)定取3批樣品，每批平行取2份，按“2.4.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。結(jié)果顯示，金絲桃苷平均含量為9.95 μg/mL，RSD值為2.32%。結(jié)果見(jiàn)表3。

3討論

桔梗定性鑒別中，在三氯甲烷-乙醚（2∶1）及二氯甲烷-乙醚（1∶2）[15]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了展開(kāi)劑種類的篩選和展開(kāi)劑比例的優(yōu)化，最終優(yōu)選出三氯甲烷-乙醚（1∶1）最佳。魚腥草定性鑒別中，分別采用乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷[16]萃取樣品，蒸干，加甲醇溶解制成三種供試品，并以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1）、甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）為展開(kāi)劑進(jìn)行了鑒別，最終優(yōu)選出采用乙醚萃取，甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）為展開(kāi)劑。薄層鑒別的分析方法驗(yàn)證中以《云南省中藥材（民族藥材）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》為依據(jù)進(jìn)行考察，15℃～35℃、50%～90%相對(duì)濕度、不同廠家的薄層板均對(duì)所建立的方法無(wú)明顯影響。

因洋艾素及金絲桃苷具有抗菌抑菌的作用，為臭靈丹和魚腥草中的有效成分，且在合劑存放至有效期后仍能測(cè)到較高的含量，故選二者為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。因洋艾素為黃酮類成分，金絲桃苷為黃酮醇苷，試驗(yàn)中對(duì)采用雙波長(zhǎng)-HPLC法對(duì)二種成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定進(jìn)行了考察，以乙腈-0.2%醋酸（18∶82）、乙腈-2%甲酸（45∶55）、乙腈-0.1%磷酸（16∶84）、乙腈-甲醇-水（11∶6∶83）為流動(dòng)相，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了流動(dòng)相比例，柱溫的調(diào)整，均未能使兩種成分同時(shí)達(dá)到分離度的要求，使得方法學(xué)考察難以合格，故最終采用了兩種分析方法對(duì)兩種成分分別進(jìn)行測(cè)定。洋艾素含量測(cè)定時(shí)，供試品制備過(guò)程中對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行了考察（5，10，15 min），結(jié)果顯示，超聲10與15 min所測(cè)含量RSD至小于1.0%，5 min時(shí)含量明顯小于10 min，故確定超聲時(shí)間為10 min。含量下限擬定中，以平均含量的80%為下限，擬定本品含臭靈丹及魚腥草分別以洋艾素和金絲桃苷計(jì)，不得少于1.90和7.90 μg/mL。