粵紫萁離體再生技術(shù)研究

陳朋 楊蕾蕾 彭楊 張?zhí)K州 徐桂紅 楊建芬 張壽洲

摘要：粵紫萁（Osmunda mildei）為新近形成的自然雜交種，其分布區(qū)狹窄、種群個體數(shù)量少、有性繁殖能力極低。該文以孢子為外植體， 以MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS為基本培養(yǎng)基，探討不同生長調(diào)節(jié)劑對粵紫萁孢子萌發(fā)、原葉體增殖和孢子體形成的影響。結(jié)果表明：粵紫萁孢子中極少的可育孢子在植物生長調(diào)節(jié)劑的作用下，能夠萌發(fā)并發(fā)育形成原葉體;原葉體生長及增殖的最適組合為1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+0.05 mg·L1 NAA和1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+0.5 mg·L1 IBA;在1/4MS基本培養(yǎng)基中，原葉體增殖的同時生長發(fā)育完善，形成正常的幼孢子體，形成率達(dá)83.49%;孢子體最佳生根配方為MS+0.5 mg·L1 IBA;組培苗在河沙∶黃土∶腐殖質(zhì)=1∶1∶3的栽培基質(zhì)中成活率在98%以上，且生長旺盛。綜上結(jié)果，該研究為粵紫萁的人工繁育及其資源保護(hù)以及其他瀕危蕨類植物的人工保育提供了參考。

關(guān)鍵詞： 粵紫萁， 孢子， 原葉體， 孢子體， 雜交種

中圖分類號：Q813.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：10003142（2021）02030107

Abstract：Osmunda mildea is a recently formed natural hybrid species with a narrow distribution area. The number of the population is very small， and its sexual reproduction is extremely low.Using spores as explants， we investigated the effects of basic media （MS， 3/4 MS， 1/2 MS and 1/4 MS） and different plant growth regulators （PGRs） on spores germination， prothallium proliferation and sporophyte formation. The results were as follows： Extremely few fertile spores of O. mildea could germinate and develop into prothallus in effect of plant growth regulators; The optimal PGRs combinations of prothallus growth and proliferation were 1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+0.05 mg·L1 NAA and 1/2MS +1.0 mg·L1 6BA+

0.5 mg·L1 IBA; In the 1/4MS with no PGR medium， prothallus were well developed with the proliferation， and the young sporophyte seedling formatted， the formation of scale was 83.49%; The best rooting PGR concentration for young sporophyte was MS+0.5 mg·L1 IBA; In loess∶river sand∶humus=1∶1∶3 cultivation matrix was the best， the survival rate was more than 98%， and the seedlings thrived. This study is great significance to the artificial breeding and conservation of O. mildea， and also provides reference to the artificial conservation of other endangered fern species.

Key words： Osmunda mildei， spore， prothallus， sporophyte， hybrid species

粵紫萁（Osmunda mildei）為紫萁科（Osmundaceae）紫萁屬（Osmunda）植物，分布范圍極其狹窄，最早僅在香港發(fā)現(xiàn)有分布（秦仁昌，1959;李添進(jìn)等，2003），后多年在野外難覓其蹤影。20世紀(jì)90年代末，陸續(xù)在廣東省深圳市東部的筆架山、七娘山和田心山，江西省崇義縣和湖南省通道縣發(fā)現(xiàn)有粵紫萁分布（蔣日紅等，2010;嚴(yán)岳鴻等，2011），雖然粵紫萁在多地被重新發(fā)現(xiàn)，但野外記錄數(shù)量極少，到目前為止僅十多株?；涀陷襟w細(xì)胞染色體核型的研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的雜種特性（張壽洲等，2008），孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂構(gòu)型研究（何子燦等，2006）也證實了該種可能為屬內(nèi)組間遠(yuǎn)緣雜交種，基于rbcL 和trnLrnF序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹支持粵紫萁是以華南紫萁（O. vachellii）為母本、紫萁（O. japonica）為父本的雜交種（勾彩云等，2008）?；涀陷綖榉N間雜交種在Tsutsumi et al.（2012）的研究中進(jìn)一步得到確證。

自然雜交是物種自然演化過程中非常重要的一部分。在生態(tài)系統(tǒng)中，自然雜交通過影響遺傳多樣性和物種多樣性進(jìn)而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可恢復(fù)性（商輝和嚴(yán)岳鴻，2017）。盡管目前針對自然雜交對于物種演化的影響與意義已有大量的研究，但對于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的不同物種間的自然遠(yuǎn)緣雜交發(fā)生條件及擴散機理缺少足夠的認(rèn)識。作為異域多地獨立發(fā)生的自然雜交種（王瑩等，2015），粵紫萁為研究自然遠(yuǎn)緣雜交形成機理與演化提供了重要的研究材料。自然條件下，由于粵紫萁僅產(chǎn)生極少的可育孢子，通過孢子自然繁殖非常困難，因此粵紫萁野外數(shù)量極少（商輝和嚴(yán)岳鴻，2017）。植物組織培養(yǎng)為瀕危物種的保育及深入研究提供了重要的途徑，本研究以粵紫萁孢子為外植體，通過不同基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度配比摸索，成功建立了孢子萌發(fā)、原葉體增殖及生根培養(yǎng)的完善組培再生體系。本研究不僅為遠(yuǎn)緣自然雜交機理的深入研究提供重要的技術(shù)保障，而且也為其他瀕危蕨類植物的人工保育提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

外植體采自栽種在深圳市中科院仙湖植物園遷地保護(hù)的一株粵紫萁（圖1：F）。3—5月粵紫萁孢子開始形成，待孢子葉完全展開，孢子囊開始由深綠色向淡綠轉(zhuǎn)變時，將孢子葉摘下，帶回實驗室預(yù)處理。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒采集回來的孢子葉立即用清水沖去表面浮塵，待孢子葉表面的水分晾干后，置于鋪有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，放在干燥器中干燥處理12～24 h。第2天收集硫酸紙上的孢子，在超凈工作臺上，先將其放入小試管中，無菌水浸泡5～10 min，然后用低速離心機3 000 g離心后倒去上清液，再加入0.1%的HgCl2溶液浸泡2～6 min，無菌水沖洗6次，最后加適量無菌水混勻制成懸浮液，每吸管吸取約200 μL懸浮液接種于不同的培養(yǎng)基中。

1.2.2 原葉體的獲得以1/2MS為基本培養(yǎng)基，按6芐氨基腺嘌呤（6BA， 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）mg·L1和萘乙酸（NAA， 0.05）mg·L1設(shè)置5個培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑組合和不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS為基本培養(yǎng)基作為空白對照，接種后觀察孢子萌發(fā)情況，以肉眼可清晰看到綠色為啟動開始時間。

1.2.3 原葉體的繼代增殖培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑對原葉體繼代增殖的影響：以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6BA（0.5、1.0、1.5、2.0）mg·L1與NAA（0.05、0.50）mg·L1 8個培養(yǎng)基組合（表1），研究6BA和NAA對原葉體繼代增殖的影響。

無機鹽濃度對原葉體繼代增殖的影響：設(shè)置MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS 4種基本培養(yǎng)基配方（表2，配方中只改變MS基本培養(yǎng)基配方的大量元素濃度分別為原來的1、3/4、1/2和1/4），進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)試驗。

增殖原葉體量=培養(yǎng)后原葉體重量-接種原葉體重量;增殖率（%）=增殖原葉體重量/接種原葉體重量×100。

以上試驗每瓶均接入2 cm2左右的原葉體團(tuán)5個，每組處理接種10瓶，重復(fù)5次，45 d左右統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4 原葉體中幼孢子體的形成設(shè)置MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS 4種基本培養(yǎng)基配方（表3），以瓶為統(tǒng)計單位，每個培養(yǎng)基接種50瓶，每瓶接種5個2 cm2左右的原葉體團(tuán);為了有利于幼孢子體的形成，接種的同時在固體培養(yǎng)基表面，添加高約1 mm的無菌水。接種后分別于35、45、55、65 d時隨機取出10瓶，統(tǒng)計幼孢子體的形成情況。重復(fù)5次，幼孢子體觀察與統(tǒng)計以肉眼清楚可見幼葉為準(zhǔn)。幼孢子體數(shù)每10瓶為1個統(tǒng)計單位。

成形率（%）=（1瓶培養(yǎng)基中具3片及以上幼葉的單苗棵數(shù)/總苗數(shù)）×100。

1.2.5 生根培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基分別設(shè)置吲哚丁酸（IBA， 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg·L1 和NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg·L1 共10個配方（表4），將原葉體中成形的幼孢子體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，45 d后進(jìn)行統(tǒng)計。試驗重復(fù)5次。

以上各試驗的培養(yǎng)基中均加入30 g·L1蔗糖、6.5 g·L1瓊脂，pH 5.8～6.0，培養(yǎng)室的培養(yǎng)溫度為（25 ± 2）℃，光照時間16 h·d1，光照強度37～40 μmol·m2·s1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析（Duncans）。

2結(jié)果與分析

2.1 原葉體獲得

粵紫萁孢子經(jīng)過消毒處理后，接種到不同的萌發(fā)培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。65 d后在6BA濃度低于1.5 mg·L1的培養(yǎng)基中首先觀察到有綠色點狀物出現(xiàn)（圖1：A），繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)原葉體在生長的同時開始增殖，并彼此相連成簇狀（圖1：B， C），幾乎沒有單個原葉體;75 d后才陸續(xù)在6BA濃度高于1.5 mg·L1以上的培養(yǎng)基中，觀察到有綠色點狀物出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)原葉體長大并在中脈部分增厚，很難見原葉體增殖。未添加植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中始終未見到有綠色點狀物出現(xiàn)。

2.2 原葉體的增殖培養(yǎng)

2.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對原葉體增殖的影響

將成簇狀的原葉體分開后轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察到6BA與NAA的不同濃度組合，對粵紫萁原葉體繼代增殖影響的效果差異顯著。當(dāng)6BA濃度為0.5～1.0 mg·L1時，與NAA組合有利于原葉體的增殖;當(dāng)6BA濃度大于1.5 mg·L1時，與NAA組合既不利于原葉體增殖，還使原葉體的生長狀態(tài)發(fā)生了改變，其中脈明顯增厚增大、細(xì)胞脆性加大，發(fā)生變化的原葉體很難在培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖。

2.2.2 MS中無機鹽對原葉體增殖的影響不同無機鹽濃度MS培養(yǎng)基對原葉體的生長和增殖影響差異顯著（表2）。在MS培養(yǎng)基中，原葉體的增殖速度最快，整個原葉體團(tuán)很難用肉眼辨出單個的原葉體;在3/4MS培養(yǎng)基中，原葉體增殖速度沒有在MS培養(yǎng)基中快，可看到原葉體呈密集的長條狀;在1/2MS培養(yǎng)基中的原葉體，增殖速度沒有前兩者快，但是原葉體的體積和表面積明顯增大，團(tuán)塊邊緣的原葉體因空間足夠，可形成正常的心形;在1/4MS培養(yǎng)基中，原葉體增殖速度最慢，但表面積最大。由此可見，隨著培養(yǎng)基中大量元素的濃度由1/4MS→1/2MS→3/4MS→MS 遞增，原葉體增殖的速度表現(xiàn)為正相關(guān)，但在1/4MS和1/2MS培養(yǎng)基中原葉體能夠生長發(fā)育完善，而在3/4MS和MS培養(yǎng)中原葉體主要以營養(yǎng)增殖為主。

2.3 孢子體的誘導(dǎo)

試驗表明，培養(yǎng)基中添加了植物生長調(diào)節(jié)劑的原葉體，只能不斷進(jìn)行增殖，很難形成孢子體幼苗，必須將原葉體轉(zhuǎn)移到不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基中，才能促使原葉體轉(zhuǎn)化成孢

一周后增加通風(fēng)時間，20 d以后可以完全去除塑料薄膜。在3種栽培基質(zhì)中的幼苗均可以成活，成活率均在98%以上，經(jīng)觀察，栽培基質(zhì)（2）河沙∶黃土∶腐殖質(zhì)=1∶1∶3中的幼苗長勢最旺（圖1：E）。

3討論與結(jié)論

孢子繁殖是蕨類植物自然狀態(tài)下的主要繁殖方式，但蕨類植物的孢子萌發(fā)時間各不相同，有一些蕨類植物的孢子還具有休眠期，借助一些外源生長調(diào)節(jié)劑則可達(dá)到打破休眠，誘導(dǎo)萌發(fā)的作用（張春萌等，2019）。6BA和NAA是植物組織培養(yǎng)中常用的生長調(diào)節(jié)劑，NAA屬于植物生長素，而6BA屬于細(xì)胞分裂素，二者通常搭配使用。研究表明，6BA和NAA不同濃度的組合可以有效地促進(jìn)孢子萌發(fā)，提高孢子萌發(fā)率。在蕨類的配子體生長發(fā)育過程中， NAA也能起到促進(jìn)側(cè)向分生組織發(fā)育的作用，并且傾向產(chǎn)生雄性配子體（Kosakivska et al.， 2016），進(jìn)而由雄性配子體向雌雄同體轉(zhuǎn)變（Somer et al.， 2010）;6BA則是蕨類植物進(jìn)行組織培養(yǎng)的必要成分，它能夠消除脫落酸（ABA）帶來的負(fù)面作用，低濃度也能改變細(xì)胞生長、分裂、伸長和分化的速度，較高的濃度能夠誘導(dǎo)根尖分生組織下的根狀體胚胎的形成（Kosakivska et al.， 2016）。本研究通過使用不同濃度6BA與NAA的配比試驗發(fā)現(xiàn)，粵紫萁綠色成熟孢子在植物生長調(diào)節(jié)劑的作用下可以明顯提高萌發(fā)率。6BA濃度低于1.5 mg·L1時，粵紫萁孢子的萌發(fā)時間縮短，萌發(fā)率顯著提高，在后續(xù)的增殖培養(yǎng)階段，原葉體能夠持續(xù)增殖，但不能形成孢子體幼苗;在6BA（1.5和2.0） mg·L1與NAA 0.05 mg·L1的濃度組合時，萌發(fā)率沒有顯著差異;6BA濃度超過2.0 mg·L1時，孢子萌發(fā)時間推遲，萌發(fā)率也降低。由此推測，生長調(diào)節(jié)劑對蕨類植物的孢子萌發(fā)及增殖具有重要影響，而不同的蕨類植物合適的生長濃度存在一定差異。

除生長調(diào)節(jié)劑外，MS培養(yǎng)基中大量元素的濃度在蕨類植物孢子體的形成中有重要的影響（Mikua et al.， 2015）。在對Osmunda regalis孢子體形成的試驗中證實，1/8MS是其最佳的培養(yǎng)基（Makowski et al.， 2016）。本研究也發(fā)現(xiàn)，1/2MS、1/4MS有利于促進(jìn)粵紫萁原葉體生長發(fā)育，同時配子體授精形成幼孢子體成形率高達(dá)78.08%和83.49%，在3/4MS和全量MS中的原葉體在培養(yǎng)初期由于大量營養(yǎng)性增殖而發(fā)育不完善，配子體很難通過受精作用而形成孢子體幼苗。粵紫萁孢子體形成試驗中，3/4MS和MS培養(yǎng)基產(chǎn)生的孢子體幼苗，推測應(yīng)屬于特殊環(huán)境下的無配子生殖。粵紫萁屬于雜合二倍體種（何子燦等，2006），通過無配子生殖產(chǎn)生的孢子體幼苗，在第3片葉后很難形成正常葉，其后長出的所有葉片依然與第1片葉相同，具體機理還有待于后續(xù)的研究。1/4MS和1/2MS培養(yǎng)基中形成的粵紫萁幼孢子體，有早熟現(xiàn)象，與Yatabe et al.（2011）在人工條件下研究Osmunda × intermedia后代生殖力時，報道其F2有早熟現(xiàn)象的結(jié)果相同，其早熟有可能來自特別組合的結(jié)果，是一種適應(yīng)特殊環(huán)境的現(xiàn)象。

參考文獻(xiàn)：

GOU CY， ZHANG SZ， GENG SL， 2008. Phylogenetic position and genetic relationship of Osmunda mildei （Osmundaceae）： Evidence from rbcL gene and trnLtrnF region [J]. Acta Bot BorealOccident Sin， 28（11）： 2178-2183.[勾彩云， 張壽洲， 耿世磊， 2008. 基于rbcL和trnLtrnF序列探討粵紫萁的系統(tǒng)位置及遺傳關(guān)系 [J]. 西北植物學(xué)報， 28（11）：2178-2183.]

HE ZC，LI Y， YAN B， et al.， 2006. Karyotype analysis of five species in Osmunda（Osmundaceae）[J]. Acta Phytotax Sin， 44（6）： 617-626.[何子燦， 李勇， 閆斌， 等， 2006. 五種紫萁屬植物的核型分析 [J]. 植物分類學(xué)報， 44（6）： 617-626.]

JIANG RH， WU L， NONG DX，et al.， 2010. Supplements to checklist of vascular plants of Guangxi， China （Ⅰ）[J]. J Guangxi Norm Univ （Nat Sci Ed）， 28 （3）： 66-69.[蔣日紅， 吳磊， 農(nóng)東新， 等， 2010. 廣西植物名錄補遺（Ⅰ） [J]. 廣西師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 28（3）： 66-69. ]

KOSAKIVSKA IV， BABENKO LM， SHCHERBATIUK MM， et al.， 2016. Phytohormones during growth and development of polypodiophyta [J]. Adv Biol Earth Sci， 1（1）： 26-44.

LEE TC， CHAU KC， WU SH， 2003. Flora of Hong Kong： Pteridophyta [M]. Hong Kong： Kadoorie Farm & Botanic Garden： 54-55.[李添進(jìn)， 周錦超， 吳兆洪， 2003. 香港植物志： 蕨類植物門 [M]. 香港： 嘉道理植物園： 54-55.]

MAKOWSKI D， TOMICZAK K， RYBCZY SKI JJ， et al.， 2016. Integration of tissue culture and cryopreservation methods for propagation and conservation of the fern Osmunda regalis L. [J]. Acta physiol plant， 38（1）： 19.

MIKUA A， POOAG M， TOMICZAK K， et al.， 2015. Somatic embryogenesis in ferns： A new experimental system [J]. Plant Cell Rep， 34（5）： 783-794.

QIN RC， 1959. Flora Reipublicae Popularis Sinicae [M]. Beijing： Science Press， 2： 79-80.[秦仁昌， 1959. 中國植物志 [M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2： 79-80.]

SHANG H， YAN YH， 2017. Natural hybridization and biodiversity conservation [J]. Biodivers Sci， 25（6）： 683-688.[商輝， 嚴(yán)岳鴻， 2017. 自然雜交與生物多樣性保護(hù) [J]. 生物多樣性， 25（6）： 683-688.]

SOMER M， ARBES R， MENNDEZ V， et al.， 2010. Sporophyte induction studies in ferns in vitro [J]. Euphytica， 171（2）： 203.

TSUTSUMI C， HIRAYAMA Y， KATO M， et al.， 2012. Molecular evidence on the origin of Osmunda × mildei （Osmundaceae） [J]. Am Fern J， 102（1）： 55-68.

WANG Y， SHANG H， GU YF， et al.， 2015. A new cryptic hybrid species of Adiantum L.（Pteridaceae） identified by nuclear and chloroplast DNA sequences[J]. Chin Sci Bull， 60（10）： 922-932.[王瑩， 商輝， 顧鈺峰， 等， 2015. 用核DNA和葉綠體DNA序列鑒別鐵線蕨屬（鳳尾蕨科）新的隱性雜交種 [J]. 科學(xué)通報， 60（10）： 922-932.]

YAN YH， YUAN H， HE ZX， et al.， 2011. New records of ferns from Jiangxi， China[J]. Guihaia， 31 （1）： 5-8.[嚴(yán)岳鴻， 苑虎， 何祖霞， 等， 2011. 江西蕨類植物新記錄 [J]. 廣西植物， 31（1）： 5-8.]

YATABE Y， YAMAMOTO K， TSUTSUMI C， et al.， 2011. Fertility and precocity of Osmunda × intermedia offspring in culture [J]. J Plant Res， 124（2）： 265-268.

ZHANG CM， WANG CX， ZHANG YX， et al.， 2019. Study on the induction of regenerated plants by Lepisorus ussuriensis （Regel et Maack） Ching Sporophyte[J]. Mol Plant Breed， 18（7）： 2326-2330.[張春萌， 王朝興， 張義秀， 等， 2019. 烏蘇里瓦韋孢子誘導(dǎo)再生植株的研究 [J]. 分子植物育種， 18（7）： 2326-2330.]

ZHANG SZ， HE ZC，F(xiàn)AN CR， et al.， 2008. A cytogenetic study of five species in the genus Osmunda[J]. J Syst Evol， 46（4）： 490-498.[張壽洲， 何子燦， 范晨瑞， 等， 2008. 五種紫萁屬植物的細(xì)胞遺傳學(xué)研究（英文） [J]. 植物分類學(xué)報（英文版）， 46（4）： 490-498.]

（責(zé)任編輯周翠鳴）