鴨疫里默氏菌毒力相關(guān)因子研究進(jìn)展

李林林，孫敏華，董嘉文，張俊勤，黃允真，黃 瑜，廖 明

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥與診斷學(xué)科群廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.福建省禽病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東廣州 510640)

鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)可感染雛鴨、雛火雞、鵝等多種禽類(lèi)，引發(fā)高致病性、接觸性傳染病。本病最早于1932年發(fā)現(xiàn)于美國(guó)紐約州的長(zhǎng)島，其后在英國(guó)、加拿大、前蘇聯(lián)、澳大利亞等國(guó)亦有發(fā)生。我國(guó)于1982年首次報(bào)道有該病的存在。鴨疫里默氏菌病也稱(chēng)鴨傳染性漿膜炎(Infectious serocitis，IS)，該病主要感染1周齡～8周齡，尤其是2周齡～3周齡的雛鴨，引起多發(fā)性、滲出性炎癥和全身性敗血癥。病變主要以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。鴨疫里默氏菌病發(fā)病率可達(dá)90%以上，病死率高達(dá)75%。目前，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

鴨疫里默氏菌為革蘭氏陰性菌，其菌體細(xì)胞壁表面多糖抗原具有多樣性使得該菌的血清型呈多態(tài)化。目前確定的鴨疫里默氏菌有20多種血清型，且不同地區(qū)流行的血清型存在較大差異。血清1型、2型、10型菌株是近年來(lái)國(guó)內(nèi)的優(yōu)勢(shì)流行菌株。不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)性，生產(chǎn)中多見(jiàn)多種血清型混合感染且新血清型不斷出現(xiàn)的情況，給該病的防控造成很大困難。

病原菌致病是細(xì)菌與宿主復(fù)雜相互作用的結(jié)果。一方面細(xì)菌通過(guò)表達(dá)、分泌多種毒力因子入侵宿主、逃避宿主免疫系統(tǒng)的捕殺并完成在宿主內(nèi)的繁殖，另一方面宿主通過(guò)其防御系統(tǒng)抵抗這些毒力因子的作用。為有效防治鴨疫里默氏菌病，需要深入研究該菌感染的分子機(jī)制和毒力因子。近年來(lái)，隨著研究的深入，越來(lái)越多的RA毒力相關(guān)因子被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[1]。

1 細(xì)菌外膜相關(guān)組分

1.1 外膜蛋白

外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，位于病原菌表面，也是最先與宿主細(xì)胞相互作用的部位，在維持菌體自身結(jié)構(gòu)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、致病等方面發(fā)揮著重要作用。OMPs還具有較強(qiáng)的免疫原性且能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[2]。非菌毛黏附素——外膜蛋白A(OmpA)是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，存在于大多數(shù)革蘭氏陰性菌的外膜中。OmpA蛋白是鴨疫里默氏菌中最早被鑒定的、具有免疫原性的主要外膜蛋白[2]。研究發(fā)現(xiàn)，RA野生株Th4的OmpA基因缺失株Th4ΔompA對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力顯著低于野生株，且Th4ΔompA對(duì)10日齡櫻桃谷鴨的致死力較野生株下降了10倍以上[3]。表明OmpA是RA的一個(gè)重要毒力因子。

1.2 表面多糖

1.2.1 脂多糖生物合成相關(guān)因子 細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱(chēng)內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌胞壁特有的組分。在感染過(guò)程中，LPS可激活炎性細(xì)胞釋放多種炎癥因子，導(dǎo)致多種生理和病理?yè)p傷。LPS由3種不同的成分組成，即脂質(zhì)A、O抗原和核心寡糖。研究發(fā)現(xiàn)，RA Yb2株AS87-04050基因編碼LPS。通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入誘變技術(shù)使AS87-04050基因失活，銀染鑒定突變株RA2640的LPS形態(tài)與野生株不同，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上由光滑型變?yōu)榇植谛停籖A2640較野生株對(duì)抗生素、消毒劑和正常鴨血清的敏感性更高，且RA2640的毒力降低了10萬(wàn)倍以上。表明RA AS87-04050基因與RA LPS的生物合成有關(guān)，并影響RA的致病性和毒力[4]。

研究者通過(guò)構(gòu)建RA Tn4351轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)，分別篩選到RA CH3菌株M949-1360、M949-RS01035、M949-RS01915基因的缺失突變株RAΔ604、RA1062、RA1067。突變株RAΔ604不能產(chǎn)生LPS，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力較野生株下降，且對(duì)鴨的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)比野生株高了200倍[5]。突變株RA1062與抗CH3 LPS單克隆抗體作用無(wú)反應(yīng)，LPS表型較CH3野生株粗糙，且對(duì)補(bǔ)體依賴性殺傷的敏感性更高，血液細(xì)菌載量降低，毒力減弱[6]。M949-RS01915基因參與RA LPS O抗原的合成，其基因缺失突變株RA1067的LPS與野生株相比存在缺陷；RA1067生長(zhǎng)較野生株慢，對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)更加敏感，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和侵襲能力均下降，感染鴨血液中菌量也明顯降低，毒力下降了360多倍[7]。以上結(jié)果表明RA CH3菌株的M949-RS01915、M949-1360、M949-RS01035基因也與RA LPS的生物合成和RA的毒力有關(guān)。

1.2.2 莢膜多糖生物合成相關(guān)因子 莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是位于細(xì)菌最外面的一層厚度不定的黏液物質(zhì)，主要由酸性多糖組成。CPS直接與細(xì)菌所處的環(huán)境接觸，可保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受宿主免疫機(jī)制的影響，包括抗吞噬和抗溶菌活性、免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)，且CPS還具有免疫原性。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli) Wza是一種保守的外膜脂蛋白，參與1族CPS通過(guò)外膜的輸出，而Wzc是一種內(nèi)膜酪氨酸自激酶。Wza-Wzc復(fù)合物可以跨越周質(zhì)，連接內(nèi)外膜，提供1族CPS輸出途徑，調(diào)節(jié)1族CPS的合成和輸出。研究發(fā)現(xiàn),RAwza缺失突變株未能產(chǎn)生CPS，缺失株具有更強(qiáng)的疏水性，更易自聚集，形成更多生物膜，毒性比野生型要低[8]。還發(fā)現(xiàn)RAwza和wzc雙基因缺失影響了莢膜的生成、輸出和細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致表面疏水性、自凝集能力、生物膜形成能力增強(qiáng)，降低了RA的致病性[8]。以上結(jié)果表明，wzc與wza均參與CPS的合成與輸出，并影響RA的毒力。

2 細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)相關(guān)因子

鐵是大多數(shù)細(xì)菌的基本元素，鐵離子是病原菌重要的生長(zhǎng)因子。細(xì)菌的獲鐵系統(tǒng)在其感染宿主及致病過(guò)程起著重要作用。細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)的蛋白同時(shí)也是重要的毒力因子。

2.1 TonB蛋白

TonB蛋白是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的一種蛋白，參與鐵等物質(zhì)的運(yùn)輸。革蘭氏陰性菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要從外界攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。一些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以自由地通過(guò)革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜，而一些大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)需要特異性的TonB復(fù)合物依賴性外膜受體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。TonB復(fù)合物由TonB、ExbB、ExbD構(gòu)成，ExbB和ExbD蛋白質(zhì)將TonB錨定在細(xì)胞質(zhì)膜中，而作為能量傳遞蛋白的TonB作為二聚體跨越周質(zhì)空間，與高豐度的外膜受體相互作用。TonB蛋白已被證明對(duì)許多細(xì)菌病原體的毒性至關(guān)重要。

RA預(yù)計(jì)包含2個(gè)TonB-ExbB-ExbD系統(tǒng)[9]，即ExbB1-ExbD1-TonB1和ExbB2-ExbD2-ExbD29-TonB2。研究發(fā)現(xiàn)，RA CH3 株TonB1、TonB2基因缺失株CH3△tonB1、CH3△tonB2對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和侵襲較親本株顯著降低，在雛鴨體內(nèi)的LD50分別比CH3野生株高224倍和87倍，感染后雛鴨血液細(xì)菌載量均較CH3親本株顯著降低[9]，表明TonB1和TonB2蛋白都影響RA的毒力。在L-半胱氨酸存在下，RA CH3可以利用血紅素作為唯一的鐵源，但CH3△tonB1出現(xiàn)血紅素鐵獲取缺陷；進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建雙突變體系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)tonB1和tonB2都被突變時(shí)，RA CH1株血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)才被完全取消[9]，表明TonB1和TonB2蛋白還通過(guò)參與血紅素在RA中的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響細(xì)菌獲鐵功能和毒力。

2.2 TonB依賴受體TbdR1

TonB依賴受體TbdR1是TonB系統(tǒng)中的一種外膜受體， TbdR1通過(guò)與TonB復(fù)合物相互作用，參與血紅素鐵的獲取[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在低鐵環(huán)境下，RA CH3株tbdR1基因缺失株CH3△tbdR1比野生株和回補(bǔ)株生長(zhǎng)速度慢，生物被膜形成能力較野生株顯著降低，毒力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生株[10]，表明 TbdR1 是鴨疫里默氏菌的一種毒力因子。

2.3 鐵載體相互作用蛋白

鐵載體相互作用蛋白(siderophore-interacting protein，sip)參與調(diào)控鐵載體基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，在鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，RA CH3 株sip基因缺失突變株CH3△sip在限鐵的條件下生長(zhǎng)增殖緩慢且生物膜形成減少，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附和入侵能力降低，對(duì)小鴨的LD50是親本株的 35 倍[11]。還發(fā)現(xiàn)23/24(95.83%)RA強(qiáng)毒株具有sip基因[11]。以上結(jié)果表明，sip基因參與了RA的鐵吸收且與RA的毒力相關(guān)。

除TonB、TbdR1和SIP外，據(jù)報(bào)道，RA血清1型菌株CH-1的B739-1343(編碼 TonB 依賴性的轉(zhuǎn)鐵蛋白)，B739-1208(血晶素受體基因)基因編碼蛋白與鐵的攝取有關(guān)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，CH-1株B739-1343基因缺失株CH-1ΔB739-1343在缺鐵環(huán)境下較親本株生長(zhǎng)受到明顯抑制，且對(duì)鴨的致病力明顯降低[12]。CH-1 株的B739-1208基因缺失株CH-1ΔB739-1208也喪失了對(duì)鐵的攝取能力，生長(zhǎng)能力和毒力較親本株顯著下降，感染后鴨血液、肝臟、腦組織的菌載量都顯著降低[13]。以上結(jié)果表明B739-1343、B739-1208基因與RA的毒力相關(guān)。

3 細(xì)菌分泌系統(tǒng)相關(guān)因子

致病菌毒力因子的釋放有賴于專(zhuān)屬的分泌系統(tǒng)，許多革蘭氏陰性細(xì)菌通過(guò)分泌系統(tǒng)將毒力因子從細(xì)菌的胞內(nèi)分泌到宿主細(xì)胞或者環(huán)境中。已發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌分泌系統(tǒng)有9個(gè)(Ⅰ型到Ⅸ型)。sprT、sprA基因是Ⅸ型分泌系統(tǒng)(T9SS)組成元件，研究發(fā)現(xiàn)，RA基因缺失株ΔsprT和ΔsprA對(duì)10日齡雛鴨的毒力均較親本株顯著下降，血液和脾臟組織中菌載量較親本株低，且對(duì)鴨血清殺菌活性的敏感性較親本株高[14]。通過(guò)構(gòu)建RA Yb2菌株Tn4351轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)，篩選到與滑行運(yùn)動(dòng)及Ⅸ型分泌系統(tǒng)相關(guān)的gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因缺失株[15-20]。毒力測(cè)定結(jié)果顯示，缺失株Yb2ΔgldG、Yb2ΔgldK、Yb2ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN毒力較Yb2親本株分別下降了2 953倍、7 009倍、184倍、48倍、54倍、110倍[15-20]。缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM、Yb2ΔgldL、Yb2△gldN、Yb2ΔgldL-gldN感染鴨組織中的細(xì)菌量均較親本株顯著降低[17-19]，缺失株Yb2ΔgldK、Yb2 ΔgldM在滑行運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)分泌方面存在缺陷[16-17]。對(duì)RA CH-1 的gldK基因缺失株進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，CH-1ΔgldK感染后鴨血液、肝臟、腦組織的菌載量明顯低于野生株，對(duì)鴨的LD50約為野生株的1.5×103倍，且對(duì)鴨的致死率顯著低于野生株[20]。以上結(jié)果表明sprT、sprA、gldG、gldK、gldM、gldL、gldN基因與RAⅨ型分泌系統(tǒng)相關(guān)，Ⅸ型分泌系統(tǒng)與RA的毒力有關(guān)。

4 細(xì)菌調(diào)控相關(guān)因子

鐵攝取調(diào)節(jié)(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur) 蛋白可調(diào)控細(xì)菌對(duì)鐵的攝取和利用，同時(shí)對(duì)廣泛細(xì)胞過(guò)程(氧化還原脅迫反應(yīng)、毒素與毒力因子)具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，RA Fur缺失突變株感染產(chǎn)生的病理?yè)p傷較野生株輕，且毒力降低[21]，提示Fur蛋白與RA的毒力相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RAYM-RS09735和RAYM-RS09740是1對(duì)PhoP/PhoR雙組份調(diào)控系統(tǒng)。RAYM-RS09735/RAYM-RS09740雙基因缺失突變株的LD50> 1011CFU，且缺失株在心臟、大腦、肝臟、血液和脾臟中的菌載量顯著低于野生型，感染雛鴨后毒力顯著降低[22]，表明該雙組份調(diào)控系統(tǒng)與菌株的毒力有關(guān)。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(ArsR)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶(SthK)位于同一操縱子上。通過(guò)構(gòu)建ArsR/SthK雙基因缺失突變株，發(fā)現(xiàn)該缺失突變株對(duì)鴨的毒力下降[23]，提示ArsR/SthK雙組份與RA的毒力有關(guān)。

5 其他

LuxE基因編碼酰基蛋白合成酶(luxE)，該酶激活脂肪酸，形成脂肪酰AMP介導(dǎo)物，并作為生物發(fā)光脂肪酸還原系統(tǒng)的第二步發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，luxE基因缺失株Yb2ΔAS87-03730在TSB中的生長(zhǎng)速度和對(duì)Vero細(xì)胞的侵襲能力均較親本株顯著降低，LD50約為親本株的80倍，提示AS87-03730與RA的毒力相關(guān)[24]。

煙酰胺酶A(PncA)是催化煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酸的關(guān)鍵酶，是NAD挽救途徑中的一個(gè)重要反應(yīng)，影響病原體在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和傳播。通過(guò)轉(zhuǎn)座子技術(shù)獲得pncA(AS87 U 01735基因編碼)基因缺失株Yb2ΔpncA，與野生株Yb2相比，缺失株Yb2ΔpncA感染鴨血液中的細(xì)菌含量較低，心臟、肝臟和脾臟沒(méi)有明顯的組織學(xué)變化，對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力下降，對(duì)鴨的毒力下降了488 000倍[25]。表明AS87-03730與RA的毒力相關(guān)。

RIA-1614基因(RanB)是RA菌ABC的外排泵組分。研究發(fā)現(xiàn)，RA-GD菌株的RIA-1614基因缺失株RA-GD△RIA-1614的LD50值是親本株的43倍，感染雛鴨后的血液細(xì)菌載量比親本株降低了38倍，提示RIA-1614蛋白參與了菌株的毒力[26]。

除去以上概述的各種毒力相關(guān)因子，已報(bào)道的RA毒力相關(guān)因子還有CH3株M949-RS00050基因[27]、Yb2株AS87-RS09170(bioF)基因[28]、CH-1株B739-0373基因[29],CH-1株dps基因[30]等。

6 小結(jié)

鴨疫里默氏菌作為重要的水禽細(xì)菌病病原之一，一直受到研究者的高度關(guān)注。該菌引發(fā)的疫情多發(fā)生于鴨群，但近幾年鵝群暴發(fā)該病的報(bào)道逐漸增多。雖然商品化的RA疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水禽養(yǎng)殖，但生產(chǎn)中該病仍較多發(fā)生。且由于抗菌藥物的不規(guī)范使用導(dǎo)致耐藥菌株持續(xù)增加，使得RA在水禽養(yǎng)殖中的感染更為普遍和嚴(yán)重。

近年來(lái)，越來(lái)越多的鴨疫里默氏菌毒力相關(guān)因子被發(fā)現(xiàn)和研究，基于毒力因子的基因缺失疫苗研究也在不斷探索。由于RA的毒力因子多種多樣，不同毒力因子在致病過(guò)程中發(fā)揮的作用也不同。目前很難確定哪種毒力因子在致病過(guò)程中占主要地位，且毒力因子在細(xì)菌致病過(guò)程中的協(xié)同作用也需進(jìn)一步明晰。鑒于細(xì)菌毒力系統(tǒng)的復(fù)雜性，未來(lái)仍有很多問(wèn)題需要解決。因此，需要進(jìn)一步探究已知毒力因子的功能，探索已知毒力因子在致病過(guò)程中的協(xié)同作用，以及鑒定新的毒力相關(guān)因子，為闡明RA的致病機(jī)制、防治措施提供依據(jù)，同時(shí)也為新型藥物和疫苗的研發(fā)提供新的思路。