貓杯狀病毒的進(jìn)化與致病性研究進(jìn)展

王 潔 ， 廖均樂 ， 錢 鵬 ， 陳亞磊 ， 劉玉秀 ， 習(xí)向峰 ， 范 偉 ， 張淵魁 ， 張許科 ， 田克恭

[1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002 ； 2. 國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心 ， 河南 洛陽 471000 ； 3. 兆豐華生物科技(南京)有限公司 ， 江蘇 南京 211102]

貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)是貓上呼吸道疾病主要病原之一，對寵物貓的生命和野生貓科動物的生物多樣性產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。目前FCV僅有1個血清型，該病毒 RNA依賴RNA聚合酶的低保真度和高錯誤率使FCV在復(fù)制中有較高的基因可塑性，在免疫壓力下能較快發(fā)生突變，由此造成的免疫逃避是引起貓杯狀病毒疫苗免疫失敗的主要原因之一。過去50多年，貓杯狀病毒在免疫壓力下隨著時間推移突變出多種可引起貓不同臨床特征的新毒株，從傳統(tǒng)的引起口腔潰瘍和上呼吸道癥狀的毒株，逐漸突變出現(xiàn)引起貓嚴(yán)重下呼吸道癥狀如肺炎的高致病性毒株、引起貓跛行的毒株和引起貓毒性系統(tǒng)性疾病的毒株等。FCV基因型眾多，對臨床診斷和預(yù)防帶來全新挑戰(zhàn)。本文對FCV病原學(xué)、病毒進(jìn)化和致病機理等研究進(jìn)行綜述，對臨床多變的FCV的診斷和預(yù)防進(jìn)行思考，以期為FCV的防控提供理論參考。

1 貓杯狀病毒分類與基因組

貓杯狀病毒為杯狀病毒科(Caliciviridae)水皰疹病毒屬(Vesivirus)成員[1]，引起貓科動物口腔潰瘍、氣管炎、肺炎等呼吸道癥狀和慢性胃腸炎等癥狀，對寵物貓和大型野生貓科動物如老虎、獅子等帶來極大危害[2-4]。FCV是無囊膜單股正鏈不分節(jié)段RNA病毒，直徑35～39 nm，核衣殼呈二十面體對稱，基因組約7.7 kb。FCV基因組包含3個開放性閱讀框(Open reading frame,ORF)，ORF1主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白p5.6、p32、p39、p30、p13(vPg)和p76蛋白，即1個蛋白酶和RNA依賴RNA聚合酶[5]。其中vPg蛋白參與病毒的起始翻譯和感染，該非結(jié)構(gòu)蛋白的缺失會影響FCV的組裝。ORF2編碼約75 kDa的衣殼蛋白前體，經(jīng)蛋白酶切除14 kDa的前導(dǎo)衣殼蛋白(Leader of the capsid protein,LC)后形成成熟衣殼蛋白VP1。VP1蛋白分為S、P1和P2區(qū)域，F(xiàn)CV中和表位多集中在P2區(qū)域[6]，VP1蛋白在病毒致病性、病毒組裝和抗原特異性方面起著重要作用。ORF2包括A～F共6個區(qū)域，其中A區(qū)高度保守，B、D區(qū)和F區(qū)相對比較保守，B區(qū)組成病毒的核心結(jié)構(gòu)，含潛在的肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP結(jié)合位點；F區(qū)位于結(jié)構(gòu)蛋白羧基端，位于病毒的表面。B、D區(qū)和F區(qū)是非中和單克隆抗體的靶點[5]。C區(qū)和E區(qū)是高變區(qū)，E區(qū)分由5′端高變區(qū)、中心相對保守區(qū)和3′端高變區(qū)組成。E區(qū)的5′端高變區(qū)和C區(qū)多為病毒中和表位區(qū)，該區(qū)域的基因多變性是不同F(xiàn)CV毒株血清交叉反應(yīng)低的原因，C、D區(qū)和E區(qū)基因的突變會影響FCV的免疫原性[7]。FCV B細(xì)胞表位主要位于E區(qū)中心保守區(qū)域和5′端高變區(qū)[8]，位于中心相對保守區(qū)域的B細(xì)胞表位是FCV可與異源FCV毒株血清發(fā)生交叉反應(yīng)的原因。ORF3編碼的次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2參與病毒的正確組裝，在病毒的復(fù)制、成熟、蛋白合成及病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)的合成過程中起一定的作用[9]。

FCV感染的細(xì)胞中，除FCV病毒基因組外，還存在若干長度不一的亞基因組。亞基因組參與編碼ORF2和ORF3，5′端和3′端結(jié)構(gòu)與基因組一致[10]。FCV復(fù)制過程中RNA依賴RNA聚合酶缺乏校對和低保真度性而具有很強的基因可塑性，這種易于出錯的病毒復(fù)制機制使病毒在免疫壓力下快速做出反應(yīng)，易于突變逃避機體免疫清除[11]，產(chǎn)生多個基因型FCV，不同基因型之間的同源性為75.9%～98.7%[12]。不同基因型FCV感染引起的主要臨床癥狀有一定的差異，并逐漸復(fù)雜化。隨著時間推移，感染貓杯狀病毒的臨床癥狀從典型的口腔潰瘍等上呼吸道癥狀，逐漸出現(xiàn)下呼吸道疾病(如嚴(yán)重肺炎)、FCV相關(guān)關(guān)節(jié)炎，以及2000年前后出現(xiàn)的高致病性FCV(Virulent-systemic caliciviruses,VS-FCV)引起的發(fā)熱、口腔潰瘍、皮膚潰瘍、黃疸、肝等組織壞死的毒力系統(tǒng)性疾病，死亡率高達(dá)67%[13]。

2 引起上呼吸道感染的貓杯狀病毒

1957年Fastier等[14]在新西蘭首次從貓病料中分離到FCV，F(xiàn)CV主要在上呼吸道和口腔部位組織細(xì)胞中復(fù)制，引起眼鼻分泌物和口腔、鼻鏡潰瘍，發(fā)病率高但死亡率低，多為良性經(jīng)過。因FCV基因易變異，不同地區(qū)流行毒株的基因型均不同，不同毒株的FCV衣殼變異區(qū)的差異達(dá)到20%～40%[15]。中國廣西省流行的引起貓上呼吸道癥狀的FCV毒株(GX01-13株)的ORF1、ORF2和ORF3基因與疫苗F9株基因氨基酸相似性分別為90.5%、86.5%和88.8%[16]。巴西流行的可致上呼吸道癥狀的FCV毒株與疫苗F9株之間ORF2中C區(qū)和E區(qū)的核苷酸序列差異值均為0.8%～50.1%[17]。

3 引起肺炎的貓杯狀病毒

FCV不斷進(jìn)化變異出毒力更強、組織噬性從上呼吸道擴散到下呼吸道的毒株。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)CV感染貓出現(xiàn)肺炎癥狀，F(xiàn)CV相關(guān)的輕度肺炎被認(rèn)為是FCV典型癥狀，重度肺炎是FCV非典型癥狀。FCV自然引起肺炎的相關(guān)報道很少，目前對FCV引起肺損傷的相關(guān)了解大多來自于試驗研究。有研究稱，F(xiàn)CV導(dǎo)致肺部感染是由于試驗中使用細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制的高含量病毒對幼貓進(jìn)行滴鼻感染[18]。有一些學(xué)者提出不同的聲音：在自然感染的貓中嚴(yán)重肺炎可能并不罕見[19]。1995 年美國密蘇里州暴發(fā)了由肺炎型FCV 21223株引起的疫情，流行毒株FCV 21223株與疫苗F9株基因組序列有顯著差異(20.4%)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV 21223株與VS-FCV毒株的E區(qū)序列無顯著相關(guān)性，且未在FCV 21223株序列上發(fā)現(xiàn)VS-FCV毒株的特異性突變；FCV 21223株與經(jīng)典FCV毒株氨基酸序列相似性達(dá)51%及以上[20]。

4 引起跛行的貓杯狀病毒

目前有多株FCV分離株被證實與感染貓產(chǎn)生跛行癥狀有關(guān)，如英國的F65株和加拿大的LLK株、2280株。早在1960年Crandell等[21]從美國有跛行癥狀貓中分離獲得1株FCV，并首次復(fù)制出跛行綜合征貓感染模型。1997年，Geissler等[22]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV導(dǎo)致跛行癥狀與病毒衣殼蛋白序列無明顯關(guān)聯(lián)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，貓杯狀病毒2280株與其余FCV分離株處于不同分支上，而貓杯狀病毒LLK株與其他導(dǎo)致呼吸道癥狀FCV流行株分散在一起，2280株和LLK株與其他FCV分離株之間有34%～46%核苷酸是可變的，但核苷酸插入現(xiàn)象少見。1999年，Glenn等[23]序列分析后發(fā)現(xiàn)F65株、LLK株和2280株與其他FCV分離株在基因序列和系統(tǒng)發(fā)育上無明顯統(tǒng)一差異。有研究利用肺炎型255株感染貓出現(xiàn)了跛行癥狀，表明255株改變了原有組織噬性，獲得了感染關(guān)節(jié)的能力，但該變化是否穩(wěn)定仍需進(jìn)一步研究[24]。目前，F(xiàn)CV導(dǎo)致貓跛行的遺傳標(biāo)記尚未找到。少數(shù)貓接種FCV疫苗后出現(xiàn)FCV型跛行綜合征，研究發(fā)現(xiàn)部分與FCV疫苗毒株的進(jìn)化相關(guān)[25]。

5 引起全身性疾病貓杯狀病毒

1998年以來，美國和歐洲[13,26-27]相繼出現(xiàn)以高死亡率及系列臨床癥狀為特點的高毒性FCV毒株(VS-FCV)。2000年，Pedersen等[13]分離的VS-FCV可引起貓嚴(yán)重全身性系統(tǒng)疾病，包括發(fā)熱(40 ℃以上)、精神不振、呼吸道癥狀(眼鼻分泌物、口腔潰瘍和結(jié)膜炎)、肺炎、脫發(fā)、皮下水腫、不同程度的皮膚潰瘍等癥狀，部分感染貓還會出現(xiàn)黃疸及病毒血癥。VS-FCV感染貓潛伏期短，病死貓剖檢可見多器官病變(如肺炎、胰腺炎和肝壞死等)?？梢鹭埳虾粑腊Y狀和肺水腫、胰腺炎和肝壞死的上海VS-FCV分離株FCV SH/14株的VP1基因與其他VS-FCV毒株同源率為84%～88.5%[28]。貓源FCV SH/14株與虎源TIG-1株有較高相似性，TIG-1株對貓有較高發(fā)病率和致死率，表明FCV可在貓科動物間傳播。對57株FCV衣殼蛋白E區(qū)氨基酸序列分析顯示[29]，部分VS-FCV毒株出現(xiàn)特征性氨基酸，即438T、448A和465S，但某些經(jīng)典毒株也有出現(xiàn)；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，VS-FCV無明顯獨立的分支，VS-FCV在E區(qū)高變異區(qū)域較短，表明突變是在不同F(xiàn)CV毒株進(jìn)化過程之中逐漸積累而成，極少具有統(tǒng)一性；多元對應(yīng)分析顯示，VS-FCV與經(jīng)典FCV相比可能有以下特征：第438位氨基酸是具有脂肪鏈的非極性氨基酸、第440位和第452位不是小氨基酸、第448位是帶極性的帶正電荷的氨基酸、第455位不是帶負(fù)電荷的氨基酸、第465位是極性氨基酸以及第492位是一種小氨基酸。

6 貓杯狀病毒的致病機理

FCV感染宿主首先吸附到細(xì)胞表面與受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用穿過細(xì)胞膜，經(jīng)過與pH相關(guān)的病毒脫殼過程，病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行復(fù)制。貓連接黏附分子-A(Feline junctional adhesion molecule,fJAM-A)是FCV的細(xì)胞受體，介導(dǎo)FCV在細(xì)胞表面附著和感染性病毒進(jìn)入，也是杯狀病毒科所有病毒成員的主要細(xì)胞受體[30]。

FCV通過口腔、鼻腔和眼部分泌物排出，也可在感染貓血液、尿液和糞便中檢出?？谇皇荈CV主要復(fù)制部位，口腔潰瘍是FCV典型癥狀，病毒入侵引起上皮細(xì)胞壞死，舌頭邊緣首先出現(xiàn)水泡，隨后破裂形成潰瘍，鼻鏡處也會出現(xiàn)潰瘍。在口腔及鼻鏡病變部位上覆上皮壞死和中性粒細(xì)胞浸潤，通常2～3周愈合[18]。FCV引起的肺炎最初由局灶性肺泡炎所致，導(dǎo)致急性滲出性肺泡炎，然后又發(fā)展成一種增生性間質(zhì)性肺炎。Kahn等[31]用255株感染貓，感染首日即在肺泡壁細(xì)胞檢測特異性病毒熒光，急性炎癥后肺泡巨噬細(xì)胞增多，胞漿內(nèi)檢測到病毒。隨后在支氣管和細(xì)支氣管上皮中也觀察到特異性病毒熒光。FCV感染跛行主要為急性滑膜炎、滑膜增厚和關(guān)節(jié)內(nèi)滑液量增加，伴有纖維性滲出和巨噬細(xì)胞增多。VS-FCV與經(jīng)典型FCV不同，多種組織器官出現(xiàn)病變，包括肝臟(肝壞死)、胰腺(胰腺炎)和皮膚(皮膚水腫和潰爛)等，感染貓死亡率高達(dá)50%以上[13,32]。VS-FCV感染的發(fā)病機制尚不清楚，可能包括病毒變異、免疫介導(dǎo)因素以及環(huán)境和管理因素。

7 防控

FCV在世界范圍流行，感染貓持續(xù)排毒數(shù)月至數(shù)年不等。目前，F(xiàn)CV防制的主要措施是疫苗，F(xiàn)CV疫苗分為弱毒活疫苗和滅活疫苗，國內(nèi)所用大多為FCV滅活苗。FCV毒株抗原的易變性導(dǎo)致疫苗免疫效果不佳，不能對所有流行毒株完全保護，不能有效預(yù)防病毒傳播，僅能減輕臨床癥狀。Sato等[33]研究顯示，現(xiàn)有疫苗對同源型FCV毒株保護效力較好，但對異源型FCV不能提供有效的免疫保護。另外，F(xiàn)CV毒株之間交叉反應(yīng)性較差，疫苗免疫后產(chǎn)生抗體對流行毒株的中和率較低。近年來，VS-FCV毒株的出現(xiàn)極大增加了臨床對FCV新型疫苗的迫切感。有免疫史的貓對VS-FCV仍易感，研制FCV新型疫苗應(yīng)考慮FCV基因型眾多的問題，可多分離不同地區(qū)FCV野毒株，采用疫苗株陽性血清與其進(jìn)行交叉保護性試驗，將試驗數(shù)據(jù)作為疫苗株篩選的依據(jù)，提高FCV疫苗對本國野毒株的交叉保護率。

8 展望

FCV通過持續(xù)積累基因突變一直進(jìn)化，進(jìn)而不同病毒株對宿主組織噬性不斷深入，從而導(dǎo)致致病性的改變。利用反向遺傳學(xué)研究病毒-宿主之間感染性與基因之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而利用基因手段研發(fā)基因重組疫苗和DNA疫苗。此外，探索VS-FCV的相關(guān)遺傳標(biāo)記和明確分子致病機制仍是目前FCV需要不斷深入探究的方向，以期早日研發(fā)出針對VS-FCV的新型疫苗。