牛乳腺上皮細胞體外分離培養(yǎng)模式、方法及其應用進展

母 童 虎紅紅 顧亞玲 張 娟

(寧夏大學農學院，銀川750105)

乳腺作為給犢牛提供生長所需的營養(yǎng)物質和抗體的外分泌腺體，其內部匯集有大量具有泌乳功能的腺泡。腺泡周圍的乳腺上皮細胞(mammary epithelial cells,MECs)以單層而緊密的方式排列，它是乳腺中合成和分泌乳汁的基本單元，也是乳腺對外界病原進行免疫保護的重要組分。乳汁正是在MECs內由血液中的各類營養(yǎng)物質經過一系列復雜生化過程而形成，經過腺泡腔、乳腺導管和乳頭管3個部位，最后從乳頭排出體外[1]。長期以來由于試驗設計和操作等方面的需求，體外培養(yǎng)技術不斷成熟，牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)體外分離培養(yǎng)技術也得到了迅速發(fā)展和應用，在很大程度上解決了活體試驗條件不可控、操作困難、周期長、成本高及個體差異大等諸多問題，還可以為體外研究乳腺組織生長發(fā)育規(guī)律、泌乳機制、乳房疾病等提供良好的細胞模型[2-4]。因此，建立穩(wěn)定的BMECs體外培養(yǎng)技術具有重要的實踐應用價值[5]。雖然BMECs的研究已經歷半個多世紀，但越來越多的學者們利用BMECs開展的研究方向表現出多元化，體外分離培養(yǎng)的BMECs依然存在很多新的問題和缺陷。本文主要從BMECs的分類和作用、培養(yǎng)方法、模式及其在基因表達機理研究和組學中的應用進展進行簡要闡述和總結，以期為BMECs體外分離培養(yǎng)相關研究提供有價值的參考和新思路。

1 BMECs的分類和作用

作為泌乳系統(tǒng)專有的腺體組織，乳腺的發(fā)育大多發(fā)生在出生后[6]，實質為高度分枝的樹狀結構，以腺泡為功能單位。Capuco等[7]研究表明，在整個生物體的生殖生命中乳腺經歷周期性的重塑，在每個發(fā)情周期中，尤其是在懷孕期間，上皮細胞數量顯著增加，組織中可以檢測到更多的腺泡，之后乳腺漸漸發(fā)生退縮，重新恢復至剛開始的穩(wěn)定狀態(tài)。動物出生后乳腺自外胚層逐漸開始發(fā)育、生長，外胚層的小葉-腺泡結構包含形成導管和腺泡基底層的肌上皮細胞、排列在導管管腔內的導管上皮細胞以及合成牛奶蛋白的BMECs[8-9]，一般體外培養(yǎng)的BMECs均含有以上3種細胞。Martignani等[10]指出差速貼壁法和差時消化法很難分離BMECs，只有經過梯度離心等處理才可將其分開。BMECs由單層細胞組成并合成和分泌乳汁進入中央管腔，在導管的中下部形成腺泡，妊娠期分化增殖，臨近分娩時才具有分泌功能，且在干乳期存在退化現象[11]。Green等[12]和Barnes等[13]研究表明，家畜泌乳期過后上皮細胞的退化程度較嚙齒類動物小，反芻家畜產犢后在整個產奶期及干奶期乳腺會發(fā)生有節(jié)制的輪回變化，當奶牛到達干奶期或腺泡發(fā)生破裂后乳腺的恢復機制會明顯加快，之后乳房內的脂肪細胞會占據腺泡退化后騰出的空間。肌上皮細胞是圍繞腺泡和小葉內導管且由分支細胞編織的籃子，主要通過收縮作用于催產素，從而迫使乳汁經腺泡進入導管來促使其排出[14-16]。Rudland等[17]研究還發(fā)現，轉化生長因子C、堿性成纖維細胞生長因子及表皮生長因子等的受體均可由肌上皮細胞形成。此外，越來越多的證據顯示肌上皮細胞在乳腺腫瘤進展中的重要性[18-20]。

2 BMECs體外分離培養(yǎng)、純化及鑒定技術

2.1 BMECs的體外分離培養(yǎng)技術

目前實驗室常見的BMECs體外分離培養(yǎng)措施分別為直接通過活體或體外采集乳腺組織進行細胞培養(yǎng)；利用胰蛋白酶和膠原酶等對剪碎的新鮮乳腺組織樣進行消化，離心后分離培養(yǎng)；將新鮮乳腺組織剪成更小的碎肉后通過沉淀和過濾等方法進行體外培養(yǎng)，或采集牛的新鮮乳汁通過反復離心進行分離、培養(yǎng)[21]。就試驗取材而言，對試驗樣品要求最嚴格的是乳汁分離法，首先整個取樣過程必須嚴格消毒，確保無菌操作，乳汁中體細胞數要求少于200 000個/mL，這樣會減少免疫細胞的污染；其次對采集的新鮮乳汁必須保持和牛體內相近的溫度(37 ℃左右)，以免BMECs活力降低或出現死亡。對BMECs體外分離培養(yǎng)影響較大的因素除樣本要求外，采樣時牛所處的妊娠或泌乳時期也是最關鍵的一點。反芻動物分娩后具備泌乳能力，乳腺內部的腺泡結構在泌乳后期趨于萎縮、退化，泌乳能力降低，經過組織重塑乳腺組織恢復到干奶期結構。因此，乳腺腺泡發(fā)育和分化速度最快的時期處于妊娠中晚期和哺乳期，同樣是BMECs數目較多且泌乳功能最活躍的時期，在這個時間段進行取樣最為合適。有研究利用產犢在6胎左右且沒有乳房及其他疾病的牛為研究對象，采集處于產奶中期或高峰期的乳腺組織進行BMECs的體外培養(yǎng)，結果表明BMECs有較高的活性和成活率[22-23]。在實際應用中不同的體外培養(yǎng)方法根據試驗設計和需求均可靈活選擇。

大多數文章報道的BMECs體外分離培養(yǎng)均采用牛的乳腺組織[24-27]，然而乳腺組織內的腺泡結構并不是孤立的，其外圍還包被有較多的結締組織、脂肪組織和淋巴結等。由于腺泡和附屬組織的界限不是很明顯，在取材時一定要刻意避開肉眼可見的非腺泡組織[2]。組織塊培養(yǎng)法最關鍵的問題在于培養(yǎng)體系條件的控制，雖然培養(yǎng)出來的BMECs具有較高的增殖能力，培養(yǎng)的整個過程中沒有過高的成本，操作也不繁瑣，但消耗的時間是幾種方法里最長的，而且在后期較難將BMECs完全純化出來。成纖維細胞培養(yǎng)3～4 d在培養(yǎng)瓶中已清晰可見，而BMECs在培養(yǎng)7～8 d才會陸續(xù)出現[28]。Jedrzejczak等[29]研究表明，從小母牛身上采集的乳腺樣本是啟動原代培養(yǎng)最有效的材料，且第2代細胞是分析乳腺功能和基因表達活性的最佳模型。Lu等[30]以產高脂肪、高蛋白質乳和產低脂肪、低蛋白質乳的奶牛乳腺組織作為BMECs系的來源，建立了高脂肪、高蛋白質乳和低脂肪、低蛋白質乳BMECs系，為研究乳脂肪、蛋白質的基因功能及脂肪代謝機制提供了有利模型。機械破碎法除兼具組織塊培養(yǎng)法的優(yōu)勢外，還具有分離出的BMECs數目較高、有較快的增殖速度的優(yōu)勢[31]，然而此方法對細胞整體具有一定破壞性，同樣存在純化難度大的問題[2]。酶消化法由于加快了組織裂解的速度，因此獲得細胞的速度明顯較前2種方法快且純化后成纖維細胞污染較少，國內外研究均有報道[25,32-33]。Chen等[34]利用酶消化法在BMECs的分離中發(fā)現乳滴和空泡結構。組織細胞分離中酶的選擇及消化的適時程度是培養(yǎng)的關鍵因素，因此運用酶消化法分離BMECs時研究人員對酶濃度和消化時間的把控至關重要[35-36]。由于在泌乳期乳汁中會經常性地脫落BMECs，因此也可從乳汁中進行體外分離。該方法簡便、易于操作，最大的特點是采樣不受限制且分離的細胞無成纖維細胞污染，BMECs的純度較高，在體外具有較快的增殖速度，給研究者節(jié)省更多寶貴的時間。但該技術對無菌操作要求較高，分離BMECs難度稍高，因為免疫細胞在乳汁中的數量較大，而具有活性的BMECs數量較少，因此在實際操作中應用的不多，盡管如此，目前有很多文獻報道已成功從乳汁中分離出BMECs，且純度較高[37-38]。

2.2 BMECs的純化技術

牛乳腺由不同的細胞組成，包括乳房中的上皮細胞、結締組織中的成纖維細胞、脂肪細胞以及血管內皮細胞[10]。試驗中經常可能遇到的主要問題之一是成纖維細胞的攜帶，這些成纖維細胞能夠以更高的速度增殖并很大程度影響B(tài)MECs的正常生長。自1961年乳腺細胞體外培養(yǎng)成功以來，研究人員經常會被BMECs中成纖維細胞的污染而困擾[2]。為解決這一難題，近年來有研究陸續(xù)報道了各種純化方法，包括刮除法、差速貼壁法、差時消化法、密度梯度離心法、組織塊轉培法、D-纈氨酸或霍亂毒素的培養(yǎng)基法等，不同的純化方法各有特點。在分離培養(yǎng)初期，BMECs長勢較成纖維細胞緩慢，從而導致2種細胞的邊界較為明顯，無用的成纖維細胞能夠用細胞刮刀或無菌槍頭通過刮除的方法分離[39-40]。刮除法雖不會對BMECs造成傷害，但純化效率較低。有學者利用成纖維細胞和BMECs對消化酶敏感性的差異將成纖維細胞分離(BMECs需要5 min，成纖維細胞則只需1～2 min)，進而培養(yǎng)出有較高純度的BMECs[41]。差速貼壁法也是實驗室純化BMECs的重要手段，由于BMECs與成纖維細胞在細胞培養(yǎng)瓶底部貼壁的時間存在差異，成纖維細胞一般在20 min內基本上可完成貼壁過程，而BMECs在同樣的生長環(huán)境中可能需要更長的時間才能完成附著[42]。在實際應用中研究人員多數會結合差速貼壁法與差時消化法，將2種方法同時用于BMECs的純化，即回避了消化酶對細胞的傷害又使得純化效率有明顯提高[43]。另外，李震等[44]和Martignani等[14]分別使用組織塊轉培法和單克隆法也實現了BMECs的純化。林杰等[2]通過在完全培養(yǎng)液中添加D-纈氨酸或霍亂毒素也可以得到純度較高的BMECs，但目前以上3種方法應用相對較少。上述方法均能有效分離出成纖維細胞，但由于試驗需求想要分離出BMECs、導管上皮細胞和肌上皮細胞時卻達不到預期效果，這時就需要通過密度梯度離心法才能夠完成[45]。

2.3 BMECs的鑒定技術

體外分離培養(yǎng)、純化后會得到肉眼可見且具有一定形態(tài)特征的BMECs，但這并不意味著培養(yǎng)的BMECs具備牛體內BMECs特有的增殖分化、基因或蛋白表達的功能。利用BMECs為模型進行分子水平方面的研究前，必須對培養(yǎng)的BMECs有比較明確的形態(tài)認識，目前BMECs鑒定最簡便、直接的方法是形態(tài)學觀察法。Buehring等[46]研究表明，體外培養(yǎng)BMECs在不同的生長階段會表現出特有的形態(tài)特征。BMECs在原代培養(yǎng)初期表現為單層且緊密排列，5～7 d 后，細胞鋪滿整個瓶底，匯集程度達90%以上，視野中可見鵝卵石樣、圓餅樣、多角樣具有典型BMECs形態(tài)的細胞[25,34]。細胞在進一步傳代過程中，由之前的圓餅狀慢慢伸展開來，形成島嶼狀聚集生長的不同形態(tài)(三角形、不規(guī)則多邊形和長方形)且扁平的極性細胞[29]。盡管BMECs在不同生長階段有自己獨特的形態(tài)特征，但形態(tài)學觀察法的可靠性仍然較差且細胞純度無法檢測。

實驗室常用的鑒定技術為標志性骨架蛋白檢測。肌動蛋白纖維、中等纖維及微管蛋白是哺乳動物細胞骨架的重要組成部分，主要用于促使BMECs抵抗理化應激和維持正常組織更新。在BMECs中表達量最高的為具有組織特異性的中等纖維，其理化性質基本不受外界因素影響且容易檢測，是標準的角蛋白纖維，因此可作為BMECs的首選鑒定標志物。目前用于BMECs鑒定的有角蛋白7、角蛋白8、角蛋白18，其中在實踐中廣泛應用的是角蛋白18[47-49]。通常BMECs還會分泌很多特異性蛋白，如κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和αs2-酪蛋白，這些特異性蛋白的表達情況也可以作為BMECs的鑒定指標，進行泌乳能力和細胞類型的評價[2]。由于所有酪蛋白中β-酪蛋白占有的比例最高，為48%，試驗中常作為BMECs培養(yǎng)成功的標志[50]。目前對于細胞骨架蛋白和分泌蛋白所采用的鑒定方法主要有逆轉錄PCR(RT-PCR)、蛋白質免疫印跡(Western blot)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。RT-PCR法主要用于檢測BMECs中特異表達目標基因的量[51]；BMECs分泌的特異性蛋白(如酪蛋白)常用Western blot法進行檢測，最大的優(yōu)點是具有較高的靈敏度和特異性，然而不適于大樣本量的檢測；ELISA法同樣具有很強的特異性，能夠彌補Western blot法的缺陷，但靈敏度不夠理想。

3 體外培養(yǎng)物的添加對BMECs泌乳的調控

試驗操作過程中為了保證體外分離培養(yǎng)的BMECs維持正常的泌乳生理活性，實現其應用價值，研究人員便嘗試建立有效的BMECs體外培養(yǎng)體系。完全培養(yǎng)液中除了含有基礎培養(yǎng)基與胎牛血清外，另外需添加各種激素、微量元素和小分子物質。其中雌激素、孕酮、催產素、胰島素和腎上腺糖皮質激素等與乳腺發(fā)育及泌乳密切相關[52]。段安琴等[53]在基礎培養(yǎng)基中通過添加雌二醇和孕酮等激素成功建立了水牛乳汁分離BMECs的新方法。催乳素具有促進BMECs生長和分化的重要作用，在生物體內催乳素能夠與非受體型酪氨酸蛋白激酶2受體特異結合，刺激腺泡發(fā)育，進而對乳汁、乳蛋白質和乳糖的合成與分泌具有促進作用，同時可以維持泌乳機能的正常進行，而乳脂的分泌基本不受影響[54]。Wu等[55]研究發(fā)現，在懷孕期間，未修飾的催乳素促進乳腺生長，而磷酸化后催乳素的增加抑制其生長。催乳素對乳腺發(fā)育的積極作用還受到胰島素和糖皮質激素的正向促進，其次配體約束力和自動磷酸化誘導作用可以促使胰島素受體蛋白位點的生成，使得胰島素亞基受體Ⅰ被激活，加快BMECs乳汁的生物合成。有研究發(fā)現胰島素對體外培養(yǎng)的細胞貼壁生長具有促進作用[56]。張燕等[40]研究表明，完全培養(yǎng)液在添加胰島素和催乳素的基礎上繼續(xù)添加氫化可的松后會產生更加明顯的泌乳現象，并且對β-乳球蛋白和β-酪蛋白的表達有一定的積極響應。此外，乳腺自身分泌的激素也會影響B(tài)MECs的分泌活動，在含有催乳素的培養(yǎng)基中添加瘦素可以促進α-酪蛋白和β-乳球蛋白表達升高，脂肪酸分泌增加[57]。Accornero等[58]研究還發(fā)現肝細胞生長因子也可以促進BMECs系的增殖和誘導細胞的運動和擴散。

隨著泌乳的持續(xù)進行，BMECs數量的減少可能部分是由于氧化應激所致。硒是幾種抗氧化酶的組成部分[59]，也是一種必需的礦物質營養(yǎng)素，動物體內缺乏硒是一個全球性的問題，導致對各種疾病的易感性和生產性能的下降[60]。Miranda等[61]研究發(fā)現，補充硒蛋氨酸可保護BMECs免受過氧化氫(H2O2)誘導的凋亡，提高BMECs的抗氧化應激能力。Zou等[62]進行無機和有機硒對熱應激BMECs的保護作用研究表明，42.5 ℃熱休克1 h可觸發(fā)熱休克反應，降低細胞存活率，亞硒酸鈉蛋氨酸或亞硒酸鈉預處理細胞可有效減輕熱休克對細胞的負面影響。然而，細胞受亞硒酸鈉處理的影響較大，但對亞硒酸鈉蛋氨酸的耐受性更強。乳汁中的主要滲透成分葡萄糖是牛奶體積的重要決定因素，更是乳糖的主要前體物質，Lin等[63]研究表明，葡萄糖具有誘導BMECs乳糖合成的能力，并對細胞活力和增殖能力有明顯提高。12 mmol/L葡萄糖濃度是誘導BMECs生長和乳糖合成的最佳濃度。在體外，12 mmol/L葡萄糖增加了乳糖含量，并增加了參與葡萄糖轉運和乳糖生物合成途徑的相關基因表達。

4 BMECs二維和三維培養(yǎng)模式的建立

1907和1912年蛙胚神經纖維和雞的結締組織體外培養(yǎng)標志著動物細胞體外二維培養(yǎng)方法的建立[64]。二維細胞培養(yǎng)的優(yōu)點在于易操作、成本低、樣品重復性高及環(huán)境可控(pH、溫度、滲透壓等)等[65]。目前，很多實驗室都在使用二維培養(yǎng)模式體外培養(yǎng)BMECs，進行奶牛泌乳調控機理及奶牛疾病的預防與治療等方面的研究。徐丹丹等[66]和歐陽五慶等[67]分別利用二維培養(yǎng)的方法對奶牛和山羊的MECs進行成功分離、培養(yǎng)及鑒定。在奶牛泌乳調控方面，研究多集中于BMECs泌乳代謝相關調控因子，如乳成分合成前體物、激素對BMECs增殖、凋亡及泌乳相關基因表達的影響[30,68-69]。在奶牛疾病方面，主要探究BMECs炎癥標志物的影響因素及各種致病菌對BMECs生長和程序性死亡的影響[70-71]。但二維培養(yǎng)模式在常規(guī)試驗中也存在一些不足之處，如體外生長的BMECs不能重現生物體內乳房的腺體結構，也不能提供最佳的系統(tǒng)來充分了解增殖、細胞死亡和分化的調節(jié)[72-73]，盡管二維培養(yǎng)在BMECs培養(yǎng)中應用廣泛，但學者們在實踐研究過程中發(fā)現二維培養(yǎng)的BMECs其培養(yǎng)環(huán)境還達不到體內環(huán)境的特殊性，并且BMECs組織學特性會隨著傳代次數的增加逐漸丟失，功能特性得不到完全發(fā)揮，如二維培養(yǎng)的BMECs并不能誘導表達κ-酪蛋白等[66]。生物體內的組織和器官行使其重要功能離不開特定的環(huán)境和細胞自我平衡穩(wěn)態(tài)，體外培養(yǎng)的細胞更是如此，擁有和體內生存環(huán)境相似的培養(yǎng)體系是研究細胞功能和基因表達機理的先決條件，更是試驗成功的重要前提，因此，模擬體內特殊環(huán)境的體外三維培養(yǎng)模式逐漸運用而生。

與二維培養(yǎng)不同，三維培養(yǎng)模式能夠提供細胞生長所需的類似體內環(huán)境的多孔支架，類腺泡結構可以在這種高仿的體外培養(yǎng)系統(tǒng)里面存活半個月或更久。三維生長的BMECs表現出體內乳腺上皮的許多特征，包括形成具有中空管腔的腺泡樣球，組成這些腺泡的細胞頂端基底極化，基底膜成分(Ⅳ型膠原和層黏連蛋白Ⅴ)的基底沉積，在某些情況下有乳蛋白的產生[65,74]。三維培養(yǎng)技術應用較多的有凝膠和海綿技術、中空纖維技術、球體技術等，但膠原凝膠技術是目前最為方便、經濟的培養(yǎng)方法[75]。在膠原凝膠中不同種類的細胞能夠以特有的方式移動和匯集，到達一定時間后，經過不斷增殖和分化形成特定的組織樣結構。細胞在凝膠中的接種方式有埋植培養(yǎng)和頂部培養(yǎng)，其中頂部培養(yǎng)對于氣體和營養(yǎng)物質的轉運更加靈活。目前有關三維培養(yǎng)的研究已是國內外的熱點領域[76-77]，Hillreiner等[78]首次建立了從鮮奶中分離出的具有生理功能的原代BMECs三維細胞培養(yǎng)模型，有望揭開泌乳生理過程的基本分子機制，如乳蛋白生產、細胞分化、免疫反應以及代謝紊亂等。有研究表明，三維培養(yǎng)的BMECs為κ-酪蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和蛋白激酶Bα(AKT1)基因在體內表達的相關研究提供了較好的模型[79]，且能夠改變BMECs在培養(yǎng)基中的生存狀態(tài)、樣式及其作用，促使κ-酪蛋白的表達[66]。Zhan等[75]研究也表示在三維培養(yǎng)中，可在一定傳代范圍內檢測到αS1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的表達，但檢測不到αS2-酪蛋白的表達，提示三維培養(yǎng)系統(tǒng)是長期研究體外泌乳機制的重要工具，但三維培養(yǎng)得到的BMECs與牛體自身細胞的特性仍然存在一定差異。目前，三維培養(yǎng)技術在BMECs培養(yǎng)中的研究是一個熱點話題，在醫(yī)學領域的研究已較為廣泛[80-82]。

5 BMECs體外培養(yǎng)在基因表達機理研究及組學中的應用

BMECs作為經典的模型一直以來被廣泛應用于乳腺組織的生理功能等多方面的研究。李喜艷等[83]已對體外培養(yǎng)的BMECs建立乳腺生物反應器細胞模型和在奶牛乳房疾病中的應用進行了詳細的概述，本文收集了近年最新文獻，重點對體外培養(yǎng)的BMECs在基因表達機理研究及組學中的研究進行詳細闡述，為大數據和組學時代BMECs模型的應用提供有價值的基礎資料。

甾醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP1)作為一種重要的轉錄調節(jié)物，參與調節(jié)乳脂合成酶和蛋白的表達和活性，從而影響B(tài)MECs甘油三酯的合成與分泌。Xu等[25]以酶消化法成功分離的BMECs為模型，研究證明了SREBP1基因是調控乳脂合成的中心轉錄因子，SREBP1基因可能作用于細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號通路來調控過氧化物酶體增殖體激活受體γ(PPARγ)的基因表達，且固醇調節(jié)元件結合蛋白裂解激活蛋白能夠增加細胞核中SREBP1蛋白的表達，對硬脂酰輔酶A去飽和酶基因的轉錄過程具有激活效果[84]。黃牛分娩后整個泌乳過程乳腺中SREBP都具有很強的活性，對BMECs合成乳脂起著重要的作用[85]。Li等[86]基于基因功能研究發(fā)現SREBP-1c基因在乳腺組織中的表達依賴于脂肪酸結合蛋白5(FABP5)正向調節(jié)，促進乳脂的合成，并證實了FABP5是蛋氨酸(Met)和雌二醇(E2)誘導的SREBP-1c基因表達和乳脂合成所必需的。Kadegowda等[87]研究發(fā)現，過氧化物酶體增殖體激活受體失活和長鏈脂肪酸在不同程度上也會改變BMECs脂肪生成基因網絡。Chen等[88]研究發(fā)現，極長鏈脂肪酸延長酶7通過轉錄因子SP1調控而參與BMECs的脂質積累。Chen等[34]又通過qRT-PCR檢測細胞特異性基因的表達，證明乳脂肪球的總RNA主要來源于BMECs，可用于研究BMECs的功能基因表達，解決了哺乳動物乳腺組織不易獲得，乳腺中基因表達水平較難檢測的問題。二?；视娃D移酶1(DGAT1)幾乎在所有組織中表達，包括乳腺。Lu等[89]通過下調BMECs內源性DGAT1表達，結果同樣顯著降低了BMECs中甘油三酯的含量。Wang等[90]以BMECs系為模型發(fā)現黃芪甲苷預處理BMECs可有效抑制細胞內活性氧水平和細胞凋亡率的升高，抑制氨水誘導的炎癥反應，挽救細胞活力的下降，進一步說明黃芪甲苷對氨誘導的BMECs損傷有保護作用。Chen等[91]研究發(fā)現轉化生長因子-β1(TGF-β1)通過TGF-β1/Smad信號通路誘導BMECs上皮-間質轉化。BMECs過表達細胞色素P4501A1能夠減輕脂多糖誘導的上皮細胞增殖抑制，降低了脂多糖誘導的炎性細胞因子和腫瘤壞死因子[92]。

牛乳中不僅含有多種營養(yǎng)成分，還含有被認為是由BMECs分泌的microRNAs(miRNA)。Muroya等[93]將BMECs經催乳素(DIP)處理后，發(fā)現miR-148A表達水平升高可能與其泌乳期乳量增加有關。為了確定miRNA水平上如何調控牛奶中脂質的合成和代謝，Shen等[94]采用組織塊培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)了2頭乳脂含量差異極大的中國荷斯坦奶牛的原代BMECs，分別構建小RNA文庫，通過二代測序和生物信息學技術共檢測到292個已知miRNAs和116個新的miRNAs。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)已知轉錄調節(jié)多種疾病。Wang等[95]通過RNA-Seq技術在牛乳腺炎BMECs模型中篩選可能具有功能的lncRNA，結果發(fā)現lncRNA-TUB在接受促炎刺激的BMECs中的表達高于正常細胞。Ma等[96]研究發(fā)現，LncRNA XIST(調控X染色體失活)介導BMECs炎癥反應通過核因子-κB/炎性小體3(NF-κB/NLRP3)途徑完成。Xu等[97]利用脂多糖刺激BMECs后進行轉錄組學分析，提示白細胞介素-1(IL-1)介導的BMECs通透性增加是通過IL-1β-ERK1/2-肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)軸途徑來實現的。Li等[98]將BMECs暴露在熱應激下，并將它們與對照組進行比較，使用液相色譜-串聯質譜進行相對和絕對定量，與對照組相比，熱處理組鑒定出104個差異升高的蛋白質(>1.3倍)和167個差異降低的蛋白質(<0.77倍)。大多數差異表達的蛋白質與細胞-底物連接組裝、分解代謝過程和代謝過程相關。目前國內外利用體外分離培養(yǎng)的BMECs進行組學分析的報道還相對較少，更多的是通過乳腺組織直接測序分析[92,99-100]。然而BMECs是乳腺的基本功能單位，體外培養(yǎng)的原代BMECs較好地保留了乳腺組織原有的合成和分泌特性，因此是探討乳腺泌乳特性和代謝調控機制的重要輔助研究手段。

6 小 結

BMECs體外二維培養(yǎng)技術目前日趨成熟，通常以乳腺組織分離培養(yǎng)和酶消化法連用，操作簡單且效果最佳，然而不可避免會受到成纖維細胞的影響。乳汁分離法恰好可以彌補這個缺陷，分離的BMECs純度較高，需要注意的是試驗過程中特別注重規(guī)范的無菌操作。在分離培養(yǎng)初期為了使體外培養(yǎng)的BMECs具有和體內細胞盡可能相同的性狀和功能，會添加一些激素和小分子，使得細胞具有正常泌乳生理活性和分化狀態(tài)，且效果也得到了證實。盡管如此，二維培養(yǎng)的BMECs其生長和增殖的環(huán)境還達不到生物體自身條件的特殊性，并且BMECs組織學特性會隨著傳代次數的增加逐漸丟失，功能特性得不到完全發(fā)揮，因此，三維細胞培養(yǎng)作為一項新興的細胞培養(yǎng)技術逐漸被人們所重視，其最大的優(yōu)勢在于能夠提供細胞生長所需的類似體內環(huán)境的多孔支架，類腺泡結構可以在這種高仿的體外培養(yǎng)系統(tǒng)里面存活半個月或更久，因而具有極大的可開發(fā)性。然而目前三維培養(yǎng)得到的細胞生存和分化能力有限，與牛體自身細胞的特性仍然存在一定差異，且受到成本的制約，還有待科研人員更深入地探索和研究。雖然細胞體外培養(yǎng)技術還在不斷地改進和完善，但體外分離培養(yǎng)的BMECs已在牛乳房疾病和基因表達機理研究中廣泛應用。不僅如此，目前已有研究報道將BMECs和組學關聯起來進行差異基因、非編碼序列及蛋白的篩選，尋找調控泌乳或和疾病相關的新基因和蛋白，因此是探討乳腺泌乳特性和代謝調控機制的重要研究手段，具有很好的應用前景。