高效液相色譜分析中的樣品前處理

◎ 田一茗

（咸陽市食品藥品檢驗檢測中心彬長旬區(qū)域分中心，陜西 咸陽 713500）

近年來，消費者對于食品安全問題越來越重視，國家對食品安全的監(jiān)管力度不斷加強。食品檢測作為食品安全監(jiān)管的技術支撐，其檢測結果的準確性對于食品監(jiān)管至關重要。食品檢測技術不斷發(fā)展，其中液相色譜分析法使用廣泛，是目前食品檢測領域最主流的技術手段之一。

一方面，由于食品生產工藝的不斷進步以及監(jiān)管部門加大監(jiān)管力度且食品中的目標組分含量越來越少，對檢測過程中樣品處理技術的要求越來越高，加大了檢測人員工作的難度。另一方面，在食品檢測過程中，能夠直接進入液相色譜儀分析的樣品極少。因此，選用合適的樣品前處理方法在液相色譜分析中尤為重要。

1 樣品前處理的重要性

樣品前處理是整個儀器分析實驗環(huán)節(jié)從采樣到數據處理中相當關鍵的一環(huán)，也是儀器分析中操作最復雜、最耗時的部分。液相色譜分析中樣品前處理的重要意義概括來說有以下幾個方面。①樣品的基質過于復雜，影響了目標組分的測定。由于食品的配料以及加工工藝等原因，其所含成分復雜，可能會出現與目標組分性質相似的干擾成分，導致與被測組分的峰分離不完全或者出峰時間接近無法判斷，檢測人員需要通過預處理減少雜質干擾、改善分離效果。②樣品中目標組分的含量過低，遠遠低于色譜儀的檢出限，無法準確測得目標物含量，需要通過提取、富集、濃縮等預處理方法提高檢測的靈敏度。③樣品中含有的某些物質，破壞色譜柱。通過樣品的前處理，可以除去對色譜柱有破壞的物質，如強酸、強堿、微生物分子以及提取時的強極性溶劑，延長色譜柱的使用壽命。④由于前處理的步驟繁雜，在處理過程中方法不得當或者忽略某一操作，會使加標回收率偏低，目標物質定性錯誤，出現結果偏離。

2 樣品的前處理技術

2.1 蒸餾技術

蒸餾技術是利用液體混合物中不同組分的沸點不同將目標組分分離的前處理技術。實驗室常用的蒸餾方法有水蒸氣蒸餾、減壓蒸餾以及常壓蒸餾。①水蒸氣蒸餾法。將待測樣品與水共同蒸餾，目標組分與水共沸后隨水蒸氣分餾出來，是目前實驗室常使用的提取方法之一，如食品添加劑丙酸鹽的提取[1-2]。②減壓蒸餾法。在常見的蒸餾裝置中加入一個真空泵，使得蒸餾裝置內的壓力降低，降低了液體的沸點，用來分離或提純沸點較高且熱穩(wěn)定性差的物質，如辣椒中蘇丹紅的提取。③常壓蒸餾法。主要用于易揮發(fā)物質與不易揮發(fā)物質以及兩種沸點相差較大的物質，除去待測樣品中的干擾組分。

2.2 溶劑萃取技術

溶劑萃取萃取依據萃取對象的基質可分為液-液萃取、液-固萃取、液-氣萃取，液液萃取是分析實驗中常用到的萃取方式。液液萃取應用了相似相容原理，利用樣品中不同組分在不混容的兩種溶液中的分配比例不同，從而將目標組分從復雜基質中分離出來。例如蜜餞中色素赤蘚紅的提取[3]，將樣品溶液與三正辛胺-正丁醇溶液混合，振搖后，待水相與有機相分層后，分取溶有目標組分的有機相進行后續(xù)實驗操作。在實驗操作中，檢驗人員應選擇適當的溶劑進行萃取，一般遵守的溶劑選擇原則是：①萃取溶劑與原來溶液中的溶劑不發(fā)生作用、互不相溶。②萃取溶劑對于待測組分的溶解度要比原溶液中的溶劑大得多。③萃取溶劑對待測組分溶解度大且對其他雜質的溶解度小，使待測組分從混合物中被有選擇地分離開來。

2.3 超聲萃取技術（SAE）

超聲萃取技術就是在溶劑萃取時將其置于超聲環(huán)境下進行，縮減了溶劑萃取的時間，提高萃取效率。在超聲振動的過程中，所產生的能量被介質吸收轉化成為熱量使介質的溫度不斷增加到一定程度，這樣的升溫方式與傳統(tǒng)的水浴加熱所獲得的效果不相上下，而且更加便捷。空化機制[4]是超聲萃取技術的主動力，當超聲波作用于液體且其所產生的聲壓足夠大時，液體的平均分子間距不斷加大，最終大于分子間的極限距離，這時液體中會產生微小氣泡，這些微小氣泡在高頻率振蕩下生長不斷聚集聲場能量，當所積聚的能量達到一定值，其空腔內部激烈收縮且崩潰，瞬間產生高壓和高溫，使液體中微粒的運動速度加快，使得萃取效率大大提高。超聲技術不止應用在萃取中，在乳化、分散以及加速試劑溶解中都廣泛應用，比傳統(tǒng)的分液漏斗振蕩和水浴振蕩器操作更加便捷高效。

2.4 固相萃取技術（SPE）

固相萃取技術是目前液相色譜分析中運用最廣泛的樣品前處理萃取技術，如黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A等真菌毒素類以及其他農殘檢驗項目的樣品前處理都有采用固相萃取技術。固相萃取利用固體吸附劑將樣品中的干擾物質與目標組分分離開來?；驹恚簶悠方涍^處理后成為樣液，通過有吸附劑填充的萃取小柱，目標組分和干擾雜質被吸附，然后利用選擇性溶劑去掉雜質，用洗脫溶劑洗脫出目標組分，濃縮、過濾后上機測定。操作步驟如下。①活化。一方面為了除去吸附劑中可能存在的與吸附相互作用且比目標組分更強的雜質，另一方面可以使吸附劑填料濕潤，否則會使目標組分過早流出萃取小柱，導致最終結果偏低。不同萃取小柱在使用活化溶劑時應當注意，非極性類的、反相固相萃取柱和離子交換柱用到的活化溶劑應易溶于水，如乙腈、甲醇、丙酮等，再用水或者緩沖溶液洗去殘留的有機溶劑。極性的正相固相萃取小柱通常用非極性溶劑進行活化，因為極性溶劑會與填充物中的極性物質鍵合，減小了目標組分與填充物的作用面積，導致回收率低。②上樣。應當注意加入萃取柱中的樣品體積應與填充物用量相匹配，否則就減少加入小柱內樣品的體積。樣品流速應當適合，不可過快，盡可能保證所有的目標組分能夠有充分的時間被吸附劑吸附。③淋洗。用極性較弱的溶劑除去吸附在萃取柱中的干擾化合物，對于反相萃取柱來說，一般用含適量有機溶劑的水溶液或者緩沖溶液來淋洗。④洗脫。使用強度合適的洗脫劑將目標組分完全洗脫下來，經過氮吹、濃縮后復溶。為了獲得較高回收率的同時，使用盡量少的洗脫溶劑，檢驗人員可以通過條件實驗來選擇洗脫溶劑的用量和強度。確定一個最佳的洗脫方式，不但能夠最大限度地洗脫目標組分，也可以使干擾組分能夠不被洗脫下來，而且減少了濃縮體積，提高實驗效率。

2.5 衍生化技術

在液相色譜分析中，部分目標組分不能夠直接被分離、檢測或者對檢測器響應值低甚至無響應時，使用衍生化試劑（具有特殊官能團的試劑）與之反應，將這種官能團引入到目標組分中，使其容易被分離或檢測。衍生化技術分為柱前衍生化和柱后衍生化。柱前衍生是將多組分樣品先通過衍生化反應生成衍生化產物，進入色譜柱分離后，進入檢測器進行分析。但是，柱前衍生比較突出的缺點是把復雜組分衍生化后，可能會生成多種衍生化產物，不利于色譜分離，加大了色譜分離的難度。而柱后衍生化技術[5]改變了衍生化反應和色譜分離的先后順序，克服了柱前衍生中多種衍生化產物引起的色譜分離效果不好的困難。相較于柱前衍生反應時間短、操作簡便、重現性良好、分析自動化更高，因此被廣泛應用。柱后衍生是將多組分樣液通過色譜柱在一定色譜條件下分離并流出色譜柱后，各組分分別與衍生化試劑反應，得到的衍生化產物又重新進入檢測器進行分析。比較常用的方法有熒光檢測的衍生化、紫外-可見檢測的衍生化以及電化學衍生化[6]。在黃曲霉毒素B1檢測過程中就用到了高效液相色譜-柱后衍生法，國家標準GB 5009.22—2016[7]中規(guī)定了3種檢測方法溴或碘試劑衍生、電化學衍生、光化學衍生。實驗中，采用光化學柱后衍生法，黃曲霉毒素B1分子上的活性雙鍵在紫外光的照射下發(fā)生羥基化反應，生成熒光強度更高的物質。這種方法在不使用任何試劑的情況下，有效解決了黃曲霉毒素B1因響應值過低而達不到儀器檢測要求的問題。

3 樣品前處理的發(fā)展趨勢

樣品前處理技術在不斷發(fā)展的過程中，需要尋求的是一種比傳統(tǒng)技術和現有技術更加高效、更加環(huán)保且回收率高、重現性好的處理技術。近幾年，樣品前處理技術自動化迅速發(fā)展。自動化儀器比起傳統(tǒng)手工操作，不僅效率高而且結果好。例如，濃縮過程中，氮吹儀的自動化，省去了手動調節(jié)試管高度，避免了因人工操作不穩(wěn)導致的溶液外漏。還有，固相萃取從最初的手動單個樣品處理以及自制萃取柱，到后來的可以批量處理的固相萃取裝置，通過與真空泵的連接來調節(jié)液體流速，以及固相萃取柱的商品化，如免疫親和柱、分子印跡柱、凈化柱等，再到全自動固相萃取儀，可以萃取、濃縮一體操作。各種樣品前處理儀器的自動化在樣品前處理環(huán)節(jié)中，不但將復雜煩瑣的操作變得簡便快捷，而且還能在處理過程中減少有毒有害試劑、氣體對檢驗人員造成的身體傷害以及對環(huán)境的污染。如今，傳統(tǒng)的前處理技術已經不再滿足當下的檢驗需求，探索和學習前沿技術不僅是提高實驗效率的手段，更成為未來樣品前處理技術發(fā)展的新趨勢。

4 結語

樣品前處理是目前色譜分析中的關鍵環(huán)節(jié)，也是操作相對較為困難的環(huán)節(jié)。想要得到較好的回收率，在樣品的前處理階段就需要選擇與目標組分性質相匹配的前處理方法，所選方法是否適用直接決定了檢測結果的準確性。近年來，各種新型的前處理技術不斷發(fā)展、設備不斷更新，除了現有技術的學習使用外，檢測人員也應加強新技術的學習，不斷提高檢測能力。