抗凍蛋白研究現(xiàn)狀及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

◎ 趙明明

（山東省食品藥品審評(píng)認(rèn)證中心，山東 濟(jì)南 250014）

隨著研究的逐步深入，人們對(duì)抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)、特性及作用機(jī)理等方面進(jìn)行了闡述。不同來(lái)源的抗凍蛋白具有不同的特性，為此，本文綜述了抗凍蛋白的來(lái)源、提純及其在食品工業(yè)的應(yīng)用，為尋找抗凍蛋白的新來(lái)源，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 抗凍蛋白的來(lái)源

目前，抗凍蛋白的研究已涉及多類(lèi)生物，從研究對(duì)象分析，抗凍蛋白主要來(lái)源于魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物[1]。魚(yú)類(lèi)中的抗凍蛋白研究比較透徹，并已經(jīng)將其基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)來(lái)降低植物凍害；昆蟲(chóng)中抗凍蛋白的抗凍活性是魚(yú)類(lèi)的10倍～100倍；植物中的抗凍蛋白具有顯著抑制冰晶形態(tài)的作用，但對(duì)植物中抗凍蛋白的研究較晚，依據(jù)相對(duì)較少。本文將從魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物3大類(lèi)來(lái)源進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1.1 魚(yú)類(lèi)中的抗凍蛋白

自20世紀(jì)60年代DEVRIES從比目魚(yú)血清中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白以來(lái)，不斷有科學(xué)家從其他極地魚(yú)類(lèi)和冷水魚(yú)中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白[2]?？箖龅鞍字饕獊?lái)自于極地魚(yú)類(lèi)和冷水魚(yú)類(lèi)的血清和上皮組織中，魚(yú)類(lèi)血清是從魚(yú)類(lèi)獲取抗凍蛋白的主要來(lái)源?？茖W(xué)家們已從南極大頭鰻鱺、太平洋鯡魚(yú)等的血清中提取到不同類(lèi)型的抗凍蛋白。根據(jù)已有研究[3]，目前從魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白主要有5大類(lèi)，分別是抗凍糖蛋白、抗凍蛋白I、抗凍蛋白Ⅱ、抗凍蛋白Ⅲ和抗凍蛋白Ⅳ。

1.2 昆蟲(chóng)中的抗凍蛋白

伴隨著魚(yú)類(lèi)血清中不斷發(fā)現(xiàn)新的抗凍蛋白，研究者試圖從耐寒的昆蟲(chóng)血淋巴中提取抗凍蛋白。1968年GRIMSAY首次證實(shí)黃粉甲幼蟲(chóng)血淋巴中存在高活性的抗凍蛋白。之后又有學(xué)者不斷從不同昆蟲(chóng)血淋巴中提取出抗凍蛋白。MOK YEE-FOONG從馬里恩島的17種節(jié)肢動(dòng)物包括螨、蜘蛛、彈尾目、嚙蟲(chóng)目及鞘翅目等的血清中分離到不同類(lèi)型的抗凍蛋白。昆蟲(chóng)血淋巴是探索分離新的昆蟲(chóng)抗凍蛋白最常用的途徑之一，且在昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白多存在于越冬的昆蟲(chóng)體內(nèi)。目前，對(duì)以下4種昆蟲(chóng)抗凍蛋白的研究最為廣泛，即黃粉蟲(chóng)、美洲脊胸長(zhǎng)椿、樅色卷蛾和甲蟲(chóng)[4]。TOMALTY HEATHER E等已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種從實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的冷馴化甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)中產(chǎn)業(yè)化提取抗凍蛋白的方法。

1.3 植物中的抗凍蛋白

自1992年加拿大的GRIFFITH第1次明確提出獲得植物內(nèi)源性抗凍蛋白以來(lái)，目前已研究了60多種植物體中抗凍蛋白的存在性，并在多種植物體中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白[5]，如野生香蕉、沙冬青、冬油菜等。抗凍蛋白多存在于耐寒植物體中，在不同組織均有發(fā)現(xiàn)。在不同生物體或同一生物體的不同組織中抗凍蛋白的存在和活性是不一樣的。目前，對(duì)植物抗凍蛋白的研究雖然有所進(jìn)展，但對(duì)植物體內(nèi)具體抗凍蛋白的理化特性、類(lèi)型及具體的作用機(jī)制還不太清楚。下一步，從不同植物體內(nèi)提取內(nèi)源性抗凍蛋白，并對(duì)其類(lèi)型、結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析是研究的重點(diǎn)。

2 抗凍蛋白的分離純化方法

分離純化出抗凍蛋白是確定抗凍蛋白來(lái)源，進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)抗凍蛋白的前提。目前，人們已在魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物、細(xì)菌和真菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種抗凍蛋白，部分已采用基因工程，將提取出的抗凍蛋白基因進(jìn)行表達(dá)，導(dǎo)入生物體內(nèi)組織培養(yǎng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。現(xiàn)對(duì)抗凍蛋白分離純化常用方法進(jìn)行闡述。

2.1 傳統(tǒng)的分離純化方法

傳統(tǒng)的分離純化方法主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子量、所帶電荷、等電點(diǎn)和親水性等性質(zhì)的差異進(jìn)行分離。常用的技術(shù)有離子交換層析、凝膠層析、等電聚焦、疏水層析及高效液相色譜等方法，在實(shí)際操作中一般將幾種技術(shù)聯(lián)合使用。

其一般步驟以DEBORAH J. SIMPSON等[6]分離抗凍蛋白為例，取35 g樹(shù)皮在液氮下?lián)v碎→加熱煮沸15 min→紗布過(guò)濾，在4 ℃、20 000 g、離心15 min獲上清→通過(guò)探索確定Q-sepharose層析的緩沖液pH=7→洗脫并收集有活性的成分→4 ℃對(duì)磷酸緩沖液（pH=7）透析過(guò)夜→透析液上羥基磷灰石柱子，1 M磷酸緩沖液（pH=7）、1 mL·min-1洗脫→收集有活性成分，超濾濃縮→上Superdex75，50 mmol Tris-hcl（pH=7），1 mL·min-1洗脫→收集有活性成分SDS-PAGE分析為單一蛋白。

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，植物中的抗凍蛋白一般具有熱穩(wěn)定性，可以根據(jù)這一特性在抗凍蛋白分離過(guò)程中加入熱處理，以除去雜質(zhì)蛋白，利于后續(xù)純化。傳統(tǒng)分離方法存在分離周期長(zhǎng)、過(guò)程復(fù)雜、收率低、分離過(guò)程不穩(wěn)定及重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。

2.2 冰吸附法分離純化抗凍蛋白

抗凍蛋白具有吸附到冰晶表面并修飾冰晶形態(tài)的特性，科學(xué)家嘗試?yán)盟楸鶃?lái)提取抗凍蛋白。2003年KUIPER設(shè)計(jì)一套冰手指裝置，通過(guò)降溫吸附蛋白，成功純化出抗凍蛋白Ⅲ。2010年，CAI等[7]把碎冰加入到女貞葉粗提液中直接冰提抗凍蛋白，并探討了冰提時(shí)間和用冰量對(duì)抗凍蛋白提取的影響，最終獲得了4種抗凍蛋白。冰特異性吸附分離法利用抗凍蛋白對(duì)冰的特殊吸附，一步分離后可顯著提高抗凍蛋白的純化倍數(shù)，比傳統(tǒng)的色譜法更快、更有效。但這種方法需對(duì)純化過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格控制，且分離裝置較為復(fù)雜。隨著目前蛋白質(zhì)純化設(shè)備的發(fā)展和改進(jìn)，該方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 SDS-PAGE分離純化抗凍蛋白

HON等[8]采用單一的SDS-PAGE法從冬小麥中獲得7個(gè)主要的抗凍蛋白多肽，其中的5個(gè)分子量為19、26、32、34及36的多肽顯示出高抗凍活性。其操作步驟為：冬小麥預(yù)處理→95 ℃處理5 min→上12%的SDS-PAGE→電泳跑完后將膠壓碎，用50 mmol Tris-HCL（pH=8）和0.1%SDS洗提多次→進(jìn)行離心去除膠，得上清→加入4倍上清體積的預(yù)冷乙醇處理→得沉淀溶解與10 μL的0.1 M NH4HCO3，獲得0.6 mg抗凍蛋白。這一方法是已知文獻(xiàn)中獲得抗凍蛋白最簡(jiǎn)便的方法。

3 抗凍蛋白在食品中的應(yīng)用

抗凍蛋白因其安全且能有效抑制冰晶重結(jié)晶的能力，在食品的冷凍冷藏中具有廣泛的應(yīng)用前景，能有效抑制冰晶生長(zhǎng)，減少營(yíng)養(yǎng)成分的損失，保證食品品質(zhì)。

目前，已有學(xué)者成功將抗凍蛋白應(yīng)用到冷凍豬肉、冷凍面團(tuán)、冰淇淋及果蔬保鮮中。冰淇淋是食品工業(yè)領(lǐng)域中抗凍蛋白應(yīng)用最為成功的案例。ZHANG等[9]向冰淇淋中加入0.1%抗凍蛋白，提高了冰淇淋的再結(jié)晶性和耐熔化性。此外，0.1%抗凍蛋白的加入使冰淇淋的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度由-29.14 ℃提高到-27.74 ℃。

4 結(jié)語(yǔ)

抗凍蛋白雖然顯示了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用前景，但仍存在成本較高、不易產(chǎn)業(yè)化等特點(diǎn)。因而分離純化出不同來(lái)源的抗凍蛋白，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、基因序列進(jìn)行分析，是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的前提。分離純化出高活性的抗凍蛋白并對(duì)其進(jìn)行基因重組、克隆是下一步研究的重點(diǎn)。