阿爾茨海默病動(dòng)物模型研究進(jìn)展

賈亞泉,宋軍營,曾華輝,謝治深,張紫娟,王銣,袁野,張振強(qiáng)

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046)

AD的主要病理特征在于認(rèn)知功能的進(jìn)行性惡化,這可能與AD患者的腦容量顯著減少有關(guān)[1],腦萎縮是由神經(jīng)元的死亡和突觸的退化引起的,大腦特別是海馬中在認(rèn)知記憶和空間定位中起主要作用[2-4]。在AD疾病機(jī)制研究中主要通過動(dòng)物模型來實(shí)現(xiàn),現(xiàn)有的AD動(dòng)物模型有自然衰老動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)人類基因動(dòng)物模型、物理法構(gòu)建癡呆動(dòng)物模型、化學(xué)法構(gòu)建動(dòng)物模型,以及兩種或兩種以上方法共同構(gòu)建等,但每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn),均不能完美的與臨床病理特征相符合。因此,在AD疾病機(jī)制研究和防治藥物篩選中選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型起到關(guān)鍵性作用。

1 衰老動(dòng)物模型

人類衰老機(jī)制研究和抗衰老藥物篩選的重要手段是選擇合適的衰老動(dòng)物模型。應(yīng)用衰老動(dòng)物模型對(duì)AD進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究具有一定的代表意義。在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用的衰老動(dòng)物模型主要有自然衰老動(dòng)物模型和快速老化動(dòng)物模型。

1.1 自然衰老模型

自然衰老動(dòng)物模型是通過對(duì)1～2月齡的大小鼠日常維持飼養(yǎng)到小鼠18～24月齡、大鼠24月齡基本相當(dāng)于人類56～70歲[5]來構(gòu)建衰老動(dòng)物模型。自然衰老動(dòng)物模型建模簡單,在衰老期時(shí)出現(xiàn)腦內(nèi)神經(jīng)元變性、膽堿能功能降低、感覺、行為和記憶障礙等與臨床患者相似的各種病理特征[6-7]。因此,在AD研究中自然衰老動(dòng)物模型作為首選動(dòng)物模型。但自然衰老模型的缺點(diǎn)是建模時(shí)間較久,一般情況下要飼養(yǎng)15個(gè)月以上(現(xiàn)在雖然可以直接購買到適齡動(dòng)物,但每只動(dòng)物的價(jià)格高的驚人),由于在建模過程中飼養(yǎng)時(shí)間過長,投入的人力和物力成本相對(duì)較大,另外,在飼養(yǎng)過程中感染其他疾病機(jī)率也相對(duì)較高且健康狀態(tài)較差,特別是進(jìn)入老齡期后容易死亡,在后期樣本檢測(cè)中個(gè)體差異大。

1.2 快速老化模型

日本京都大學(xué)竹田俊男教授在1968年培育出快速老化小鼠(SAM),在此基礎(chǔ)上又于1975年培育出易快速老化系小鼠(SAMP)和抗快速老化系小鼠(SAMR)。根據(jù)生理病理表現(xiàn)SAMP分為P1-3和P6-11,SAMR分為R1、R4和R5。其中SAMP8小鼠在學(xué)習(xí)記憶減退、神經(jīng)遞質(zhì)改變、APP代謝異常、Aβ沉積等方面表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的AD臨床特征,一致認(rèn)為是研究AD最好的動(dòng)物模型。SAMP8小鼠的一般生存時(shí)間為10～12個(gè)月,在6個(gè)月齡之后進(jìn)入老化加速期[8]。在月齡相同情況下,SAMR1小鼠表現(xiàn)出抗癡呆特征,在實(shí)驗(yàn)研究中一般作為SAMP8鼠的對(duì)照[9]。快速老化小鼠具有飼養(yǎng)周期短,衰老特征明顯的優(yōu)點(diǎn),但快速老化小鼠相比其他模型小鼠價(jià)格較貴,且SAM動(dòng)物繁殖能力較弱,相對(duì)來源較少,具有一定的局限性。

2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)病原因確定,病理癥狀已知,有利于AD機(jī)制研究和防治藥物的篩選。一般以與AD發(fā)病有關(guān)的APP、早老素(PS)和ApoE等基因突變?yōu)橹鞯膯无D(zhuǎn)基因、雙轉(zhuǎn)基因和多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型為主要研究對(duì)象。

2.1 APP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

神經(jīng)細(xì)胞β-淀粉樣前體蛋白(APP)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型是將人源性APP基因與小鼠基因組整合、表達(dá)和遺傳。與正常動(dòng)物相比,APP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦中Aβ表達(dá)過量,引起認(rèn)知功能障礙等系列AD臨床病理特征。

2.1.1 PDAPP小鼠模型

轉(zhuǎn)人類APP695swe和APP717 V-F基因的PDAPP小鼠模型是由C57BL/6鼠與DBA/2F1鼠雜合而生。PDAPP小鼠APP表達(dá)水平高,6～9月齡時(shí)在模型小鼠大腦多區(qū)域表現(xiàn)出與AD相似的病理表現(xiàn),如細(xì)胞外Aβ異常沉積、突觸丟失、神經(jīng)炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞增生等,但NFTs形成不明顯。采用Aβ疫苗免疫轉(zhuǎn)基因鼠,可以明顯降低腦組織中淀粉樣沉淀,從而改善記憶力的減退[10],由于PDAPP小鼠在同月齡腦中Aβ沉積異常,主要用于與Aβ相關(guān)的AD疾病機(jī)制研究[11]。

2.1.2 Tg2576小鼠模型

Tg2576小鼠模型是轉(zhuǎn)人類APP695基因小鼠,在9～12個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶功能減退,在大腦多部位逐漸出現(xiàn)Aβ沉積和形成老年斑(SP),在皮層出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集[12-13];Bilkei[14]認(rèn)為Tg2576小鼠的認(rèn)知障礙與AD病人相比不明顯,出現(xiàn)神經(jīng)元丟失,但無NFTs形成。根據(jù)以上Tg2576小鼠的病理特點(diǎn),該模型一般應(yīng)用于早期AD的研究。

2.1.3 APP23小鼠模型

將人類APP695基因通過倉鼠由轉(zhuǎn)人類APP695鼠和APPV717I鼠交配得到的APP23小鼠模型,主要特點(diǎn)是APP水平在腦內(nèi)過度表達(dá)引起一系列的AD病理表現(xiàn),在3月齡時(shí)呈現(xiàn)進(jìn)行性加重的空間學(xué)習(xí)記憶障礙[15];在6月齡時(shí)出現(xiàn)Aβ沉積、神經(jīng)炎性斑塊、突觸丟失、tau蛋白過度磷酸化及CAA等,但無SPs形成。在8～9個(gè)月齡時(shí)Aβ沉積加重,并有SPs形成[16]。APP23小鼠緩慢性形成SPs與AD患者病理發(fā)展較一致[17]。

2.1.4 TgCRND8小鼠模型

由轉(zhuǎn)人類APP695鼠和APPV717F鼠交配得到的TgCRND8小鼠模型,在3月齡時(shí)出現(xiàn)Aβ沉積、認(rèn)知功能障礙等AD病理表現(xiàn),5月齡時(shí)伴有神經(jīng)炎癥反應(yīng),形成SPs,伴隨膠質(zhì)細(xì)胞增生出現(xiàn),且隨年齡增長而加重[18-19]。

2.2 tau轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型是根據(jù)神經(jīng)元軸突中的tau蛋白基因突變引起的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)這一AD主要病理特征構(gòu)建的。沈林林等[20]認(rèn)為tau轉(zhuǎn)基因小鼠由于自噬能力降低,使大腦中異常tau蛋白磷酸化水平累積,p62蛋白表達(dá)水平降低,引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死,最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。該轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物的主要特性是認(rèn)知功能障礙和NFT形成,但Aβ沉積不明顯[21]。

2.3 APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因模型

利用基因打靶技術(shù)培育出的APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因鼠,在3月齡時(shí)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙、Aβ增多和形成SP,6月齡時(shí)即可出現(xiàn)嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶力衰退、認(rèn)知功能障礙,神經(jīng)元變性和突觸丟失等多種AD病理特性[11,22-24]。對(duì)AD病理特征中Aβ和SP方面的研究主要采用APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因鼠。但其外源性基因表達(dá)不夠穩(wěn)定、動(dòng)物價(jià)格高。

2.4 APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因模型

APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠模型是由APPSwe、PS1、TauP301L基因系突變建立的[25],首先在皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)Aβ異常沉積、SP和NFTs形成,隨后,海馬區(qū)也逐漸出現(xiàn)Aβ沉積、SP和NFTs,以及突觸丟失、神經(jīng)元變性[26]等一系列AD臨床病理表現(xiàn)。APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠模型是目前與AD病理特征最為接近的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,但其外源性基因表達(dá)穩(wěn)定性較差、造模較困難且造價(jià)高。

3 物理損傷動(dòng)物模型

動(dòng)物腦血流量老年期較成年期減少20%以上,腦部慢性缺血、缺氧使腦的正常功能受損,出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙等AD病理性改變[27]。由此理論在實(shí)驗(yàn)研究中通過永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈血管(2VO)建立的缺血性癡呆動(dòng)物模型,表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙明顯,淀粉樣蛋白前體升高、神經(jīng)元和腦細(xì)胞死亡、tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激反應(yīng)和產(chǎn)生慢性炎癥等AD病理特征[28-29]。該動(dòng)物模型病程較長,在行為學(xué)表現(xiàn)上如認(rèn)知功能障礙與AD比較一致,病理上也高度相似,但引起AD的外因在該動(dòng)物模型中不能體現(xiàn)出來,另外,2VO動(dòng)物模型手術(shù)操作具有一定難度,模型復(fù)制后動(dòng)物存活率低且時(shí)間短,不適合給藥周期長的實(shí)驗(yàn)研究[30]。

另外,還有永久性結(jié)扎單側(cè)頸總動(dòng)脈[30]、去胸腺衰老模型和γ射線致衰老模型[31]、控制性皮質(zhì)撞擊模型[32]、液壓腦損傷模型[33]等,由于這些模型在造模方法上復(fù)雜、難度高、造模后動(dòng)物容易死亡、且結(jié)果不理想,僅在個(gè)別特殊目的實(shí)驗(yàn)中有所應(yīng)用。

4 化學(xué)損傷動(dòng)物模型

主要是以向模型鼠腦部、皮下或腹腔注射特定物質(zhì)來建立模型,如通過立體定位儀、微透析等方法向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物腦內(nèi)海馬、基底核、側(cè)腦室等不同部位注入Aβ片段,鵝蒿蕈氨酸(IBO)、STZ等物質(zhì)?；蛲ㄟ^皮下或腹腔注射D-半乳糖、三氯化鋁、岡田酸(OKA)和東莨菪堿(SCOP)等致?lián)p物質(zhì)。

4.1 Aβ誘導(dǎo)模型

Aβ誘導(dǎo)模型是通過在海馬CA1區(qū)或者側(cè)腦室多次注射Aβ片段誘發(fā)Aβ沉積、形成SP為主要病理特點(diǎn)的AD動(dòng)物模型。Aβ誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型腦內(nèi)Aβ沉積明顯、Aβ斑塊周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,行為呆滯,易臥,學(xué)習(xí)記憶能力衰退,出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、體能衰減明顯等AD病理表現(xiàn)[34]。Aβ誘導(dǎo)動(dòng)物模型,影響因素單一,模型形成時(shí)間長,造模過程中,有對(duì)腦組織造成穿透性損傷的不確定性,另外,由于注射部位過于集中,使Aβ沉積部位與AD患者Aβ在腦內(nèi)多區(qū)域分布有所不同。

4.2 IBO誘導(dǎo)模型

IBO能對(duì)大腦產(chǎn)生毒性作用。特別是對(duì)大腦神經(jīng)元的毒性作用最大,可以導(dǎo)致腦內(nèi)SP沉積,行動(dòng)呆慢,學(xué)習(xí)記憶能力衰退等病理表現(xiàn)[35]。將IBO注入ChE傳遞和學(xué)習(xí)記憶能力的主要位點(diǎn)Meynert基底核,通過谷氨酸受體特異激動(dòng)膽堿能神經(jīng)元引起神經(jīng)元損傷、ACh含量和ChAT活性降低,信號(hào)通路隨之調(diào)節(jié)異常,認(rèn)知功能障礙等[36-37]。在實(shí)驗(yàn)研究中,IBO聯(lián)合Aβ復(fù)制AD動(dòng)物模型其臨床病理特征更明顯[38]。

4.3 STZ誘導(dǎo)模型

在AD患者腦內(nèi)由于胰島素分泌異常形成SP和NFT。據(jù)此,通過在動(dòng)物側(cè)腦室注射鏈脲菌素(STZ)破壞腦部的糖和能量正常代謝,使動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力衰退,認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙等AD的病理特征[39]。少量STZ影響神經(jīng)元活性,引起行為學(xué)改變、認(rèn)知功能障礙、能量代謝加速、Aβ異常沉積、膽堿能缺失、tau蛋白過度磷酸化等[40-41]。但有研究認(rèn)為腦內(nèi)注射STZ后3個(gè)月才能逐漸觀察到Aβ沉積,而且SP的形成具有差異性[42]。STZ誘導(dǎo)模型與阿爾茨海默病的普遍特征相符,但由于注射部位在腦,操作難度相對(duì)較大,模型復(fù)制后動(dòng)物的存活率相對(duì)較低,且模型復(fù)制時(shí)間相對(duì)比較長。

4.4 D-半乳糖模型

D-半乳糖(D-galactose,D-gal)是一種還原單糖,使組織滲透壓升高、產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),促進(jìn)神經(jīng)衰老的發(fā)生和發(fā)展。通過皮下連續(xù)注射D-gal建立亞急性衰老動(dòng)物模型,導(dǎo)致認(rèn)知功能和膽堿能功能障礙,產(chǎn)生氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng),海馬區(qū)tau蛋白過度磷酸化[43]。D-gal衰老模型與自然衰老模型相比造模時(shí)間短、與SAM模型相比具有價(jià)格低、結(jié)果可靠穩(wěn)定,有自然衰老動(dòng)物模型在氧化損傷、神經(jīng)行為學(xué)以及病理形態(tài)方面的病理特征等的優(yōu)點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用較多。但其缺點(diǎn)是在生化分析中與自然衰老動(dòng)物模型具有一定的差異[44]。

4.5 鋁中毒誘導(dǎo)模型

通過對(duì)小鼠側(cè)腦室或腹腔注射AlCl3造成空間學(xué)習(xí)障礙和記憶損傷建立衰老模型[45],由于腦組織中鋁濃度升高使腦內(nèi)NFT和Aβ聚集加快、神經(jīng)元變性或凋亡,損傷神經(jīng)系統(tǒng)功能[46]。但該模型的AD神經(jīng)病理改變非廣泛性[47]。使該模型在應(yīng)用中具有一定的局限性,現(xiàn)在多與D-半乳糖等其它致衰老模型聯(lián)合復(fù)制衰老模型。

4.6 SCOP誘導(dǎo)模型

SCOP為膽堿能拮抗劑,通過腹腔注射SCOP引起模型動(dòng)物膽堿能系統(tǒng)功能障礙引起由于氧化應(yīng)激增加的認(rèn)知能力的下降[48-49]。由SCOP誘導(dǎo)的癡呆模型被認(rèn)為是揭示AD相關(guān)認(rèn)知功能障礙的理想癡呆模型[50]。由于此種模型造模方法簡單、費(fèi)用相對(duì)較少、所以在對(duì)AD認(rèn)知功能研究中應(yīng)用比較廣泛,缺點(diǎn)是動(dòng)物模型缺乏AD神經(jīng)元變性、Aβ沉積等典型病理改變。

4.7 OKA誘導(dǎo)模型

通過在大鼠腦內(nèi)不同位點(diǎn)注射蛋白磷酸酶的選擇性抑制劑OKA誘導(dǎo)Tau蛋白發(fā)生過度磷酸化復(fù)制AD動(dòng)物模型,出現(xiàn)ACh活性和表達(dá)異常的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能障礙引起的認(rèn)知功能缺陷[51]。表現(xiàn)出與臨床AD病人腦組織中的病理特征相似性。

5 小結(jié)

AD的發(fā)病機(jī)制作為世界研究的熱點(diǎn),至今未明。目前在實(shí)驗(yàn)研究中所使用的AD動(dòng)物模型均不能完全復(fù)制AD臨床上在的病理特征。多數(shù)研究者采用兩種或兩種以上方法聯(lián)合復(fù)制AD動(dòng)物模型,以期在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中與臨床病理表現(xiàn)盡量相符合,隨著對(duì)AD研究不斷深入及開發(fā)防治AD藥物的需要,選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)臨床和藥物篩選直到積極作用。