馬鏈球菌馬亞種3種抗原蛋白對小鼠免疫的免疫原性分析

呂芬芬，馬曉慧，汪 麗，馬 陳，張寶江，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

馬腺疫是由馬鏈球菌馬亞種(S.equi)引起馬屬動物的急性接觸性傳染病，可引起2歲以下馬匹發(fā)熱、咽炎、頭頸淋巴結(jié)腫大、化膿及流膿性鼻液，嚴(yán)重可造成馬匹死亡[1-2]。該病是馬屬動物最常發(fā)的傳染病之一，該病發(fā)病急，傳播快，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并已造成很大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。該病暴發(fā)后對有早期癥狀的病駒采用藥物治療有一定的療效，但治療完成后，馬容易再次患病。此外，該菌產(chǎn)生耐藥性的問題也變得日趨嚴(yán)重[5]。

疫苗是可有效預(yù)防和控制馬腺疫的重要措施，但對其研究還不夠成熟和完善。傳統(tǒng)的滅活全菌疫苗或提取物疫苗因具有較低的免疫效果而不被看好，目前，國外使用較多的馬腺疫疫苗主要有鼻腔接種的弱毒苗和肌內(nèi)注射的蛋白亞單位苗。這兩類疫苗雖有一定效果，但也存在著安全性差和免疫效力低等問題[6-7]，因此，開發(fā)安全性好，免疫效果更佳的疫苗，可對有效防控該病提供技術(shù)支撐[8-9]。

S.equi的多抗原組成的亞單位疫苗可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗的不足和缺陷，且不涉及感染性病原菌，生產(chǎn)和應(yīng)用較為安全，成為馬腺疫疫苗發(fā)展的主要方向之一。SrtA為S.equi等多種革蘭陽性菌表面的一種分選酶[10]，可識別和酶解LPXTG基序，將表面蛋白錨定到細(xì)胞壁的肽聚糖上[11]，以往對豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2，SS2)、A群鏈球菌(group Astreptococci，GAS)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)等菌的研究已表明SrtA可影響病原菌對宿主細(xì)胞的黏附、識別和定植[12-14]。SeM可在S.equi的抗吞噬和黏附過程中發(fā)揮主要作用，且可參與該菌的免疫逃避[15]。EAG是一種IgG結(jié)合蛋白，參與該菌的黏附、抗調(diào)理吞噬及免疫逃避，F(xiàn)lock等[16]研究表明，用EAG 免疫馬駒，該抗原對馬駒具有一定的免疫保護(hù)效果。

目前，已知EAG與CNE具有一定的相互協(xié)同作用。此外，Guss等[17]證明EAG、SclC和CNE蛋白聯(lián)合免疫后可部分保護(hù)馬駒抵抗S.equi的感染，最近的研究證明，以S.equi7種不同蛋白免疫馬駒，對駒的攻擊保護(hù)率可達(dá)到85%，這表明多抗原亞單位疫苗具有發(fā)展的潛力，但這種由7種蛋白組成的疫苗存在生產(chǎn)成本過高的問題。有關(guān)EAG、SeM和SrtA蛋白聯(lián)合免疫協(xié)同作用的研究未見報(bào)道，本研究在多層面和角度對這3種蛋白單獨(dú)及聯(lián)合免疫效果進(jìn)行分析基礎(chǔ)上，綜合評價(jià)該亞單位疫苗組合的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

6～8周齡18～22 g雌性昆明小鼠購自烏魯木齊市動物疾病預(yù)防控制中心，70只小鼠隨機(jī)分為5組， 每組14只，分別為SrtA免疫組、EAG免疫組、SeM免疫組、SeM+EAG+SrtA聯(lián)合免疫組和PBS對照組。

1.2 菌株及主要試劑

馬鏈球菌馬亞種ZZM-3株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存；E.coliBL21(DE3)購自天根公司；大腸桿菌BL21由本室保存。E.coliBL21-pET-28a-SrtA、E.coliBL21-pGEX-4T-SeM、E.coliBL21-pET-28a-EAG由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

DNA Marker、中分子量蛋白 Marker 購自TaKaRa公司，HRP-IgG和分型抗體IgG、弗氏完全及不完全佐劑購自Sigma公司，TMB顯色液購自索萊寶科技有限公司。

1.3 SeM、EAG及SrtA的表達(dá)及純化

取E.coliBL21-pET-28a-SrtA、E.coliBL21-pGEX-4T-SeM、E.coliBL21-pET-28a-EAG表達(dá)菌株分別接種至含50 μg·mL-1的 kan+LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)6 h至菌液OD600 nm值為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)6 h，破碎菌體并收集上清，用親和層析法進(jìn)行純化及測定蛋白濃度。

1.4 動物免疫

將純化的重組蛋白與弗氏佐劑以體積比1∶1混勻，共免疫兩次，第一次免疫采用弗氏完全佐劑，第二次免疫抗原與弗氏不完全佐劑混合，免疫采取背部皮下注射，各免疫組小鼠的注射劑量為50 μg·只-1，首次免疫15 d后進(jìn)行第二次免疫。首次免疫后0、14、35、45 d分別對小鼠尾靜脈采血，收集血清保存于-20 ℃。

1.5 血清抗體效價(jià)及亞型的ELISA檢測

用SrtA、EAG和SeM各100 ng作包被抗原，50 mmol·L-1的碳酸鹽作包被緩沖液 (pH9.6) 溶解抗原，用3種重組蛋白(300 ng·孔-1)4 ℃過夜包被ELISA板，用間接ELISA法[16]分別對免疫小鼠抗體效價(jià)和亞型進(jìn)行檢測，將采集的小鼠血清作梯度稀釋，以1∶10 000稀釋的HRP山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行血清抗體效價(jià)測定。

IgG特異抗體分型采用方法同上，首次免疫后35 d小鼠血清以1∶300稀釋作一抗，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 1∶6 000稀釋作為二抗，進(jìn)行抗體亞型的檢測。

1.6 免疫保護(hù)試驗(yàn)

第二次免疫后30 d，對免疫組及對照組小鼠攻毒，經(jīng)腹腔注射馬鏈球菌馬亞種ZZM-3株，攻毒劑量為1 MLD (8.4×108CFU)，連續(xù)觀察12 d并記錄小鼠精神狀態(tài)、食欲、體重變化及死亡情況。

1.7 荷菌量測定及病理組織學(xué)觀察

攻毒后1 d，隨機(jī)選取4個(gè)試驗(yàn)組和空白組小鼠各3只，取肝、脾、肺、腎組織研磨并梯度稀釋后涂布培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

攻毒后2 d，取免疫組及對照組小鼠各3只，取肝、脾、肺和腎組織用4%福爾馬林固定，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，對病理組織變化進(jìn)行觀察。

1.8 q-RT PCR檢測免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄

第二次免疫后7 d收集小鼠脾細(xì)胞，按照RNA提取說明書抽提各組組織總RNA。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋6個(gè)梯度，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各組織總RNA為模板，根據(jù)GenBank 相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)分子的引物(表1)，使用特異引物采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增免疫相關(guān)基因IL-10、MHCⅠ、TCR、TLR2、TLR3、TLR4及RP105[18]，檢測用Quanti Tect RT-PCR kit (Qiagen)在BIO-RADiQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均設(shè)置2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測, 取其均值。反應(yīng)體系:2×RT-PCR master mix 25 μL, 上下游引物各0.4 μmol·mL-1, Taqman 探針0.2 μmol·mL-1, RT mix 0.5 μL， RNA 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品10 μL， 加nuclease-free water 補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；然后95 ℃ 150 s； 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線參數(shù)：55～95 ℃，每10 s上升0.5 ℃。然后進(jìn)行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因用來標(biāo)定每個(gè)樣品的相對表達(dá)水平的差異，PBS作為對照組，采用2-ΔΔCt法分析免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)水平[18]。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白的表達(dá)及純化

將3種不同的重組菌BL21-pET-28a-SrtA、BL21-pGEX-4T-SeM、BL21-pET-28a-EAG誘導(dǎo)表達(dá)后純化，將獲得的純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果在24、64和27 ku分別出現(xiàn)明顯的目的條帶，與預(yù)期目的蛋白大小相符，表明成功表達(dá)、純化到EAG、SeM和SrtA重組蛋白 (圖1A～C)。

2.2 血清特異性抗體效價(jià)和IgG亞型的檢測

用3種不同抗原蛋白免疫小鼠，首次免疫后35 d 的抗體效價(jià)結(jié)果表明，免疫后可引起良好的抗體反應(yīng)，各免疫組抗體效價(jià)均可達(dá)到1∶72 900，顯著高于對照組，且3種蛋白聯(lián)合免疫組抗體效價(jià)高于各重組蛋白單獨(dú)免疫組(圖2)。

A. SrtA的表達(dá)及純化; B. EAG的表達(dá)及純化; C. SeM的表達(dá)及純化; M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～2. pET-28a-SrtA重組菌純化后蛋白; 3. pET-28a-EAG重組菌純化后蛋白; 4. pET-28a空載體誘導(dǎo)后的蛋白; 5. pGEX-4T-SeM重組菌純化后的蛋白 A. Expression and purification of SrtA; B. Expression and purification of EAG; C. Expression and purification of SeM; M. Protein molecular weight marker; 1-2. Purified SrtA recombinant protein; 3. Purified SrtA recombinant protein; 4. pET-28a empty vetor; 5. Purified SeM recombinant protein圖1 重組蛋白的表達(dá)、純化Fig.1 The expression and purification of recombinant proteins

對IgG亞型的檢測結(jié)果如圖3所示，3種抗原蛋白免疫后誘導(dǎo)的抗體亞型以IgG1和IgG2b為主，且聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)的特異性IgG1和IgG2b抗體水平高于SeM、EAG與SrtA免疫組。

圖2 免疫小鼠血清抗體效價(jià)檢測Fig.2 Specific serum antibody titers in immunized mice

不同字母表示組間同種抗體亞型差異顯著(P<0.05) Different letters indicate significant differences of subtype detection among different groups(P<0.05)圖3 免疫小鼠血清抗體亞型檢測Fig.3 Antibody subtype detection in immunized mice

2.3 熒光定量PCR檢測

采集的第二次免疫后10 d各免疫組小鼠脾細(xì)胞，采用熒光定量RT-PCR方法對免疫相關(guān)基因進(jìn)行檢測。SrtA免疫組MHCⅠ、TCR、TLR2、TLR3及TLR4的表達(dá)水平高于EAG和SeM免疫組，EAG免疫組誘導(dǎo)的IL-10水平最高，聯(lián)合免疫組MHCⅠ、RP105及TLR3的表達(dá)水平高于其他免疫組及對照組(圖4)。

2.4 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)

首免后42 d對所有免疫組及對照組小鼠攻毒，腹腔注射1 MLD的S.equiZZM-3菌株。結(jié)果顯示PBS對照組小鼠在攻毒后3 d內(nèi)全部死亡,EAG+SeM+SrtA聯(lián)合免疫組存活率為87.5%，顯著高于3種蛋白免疫組及對照組(圖5A)。各組小鼠體重在攻毒后4～5 d降低，免疫組體重在攻毒后5～6 d開始回升，除SeM免疫組和PBS對照組外各免疫組體重變化幅度較小，除PBS對照組外，各免疫組小鼠體重在攻毒后5 d恢復(fù)至正常(圖5B)。

2.5 荷菌量測定

攻毒后1 d，各免疫組及對照組小鼠肝、脾、肺、腎荷菌量的檢測結(jié)果顯示(圖6)，與對照組相比，3種 蛋白單獨(dú)免疫組及聯(lián)合免疫組各臟器荷菌量低于PBS對照組(P<0.05)。

2.6 病理組織學(xué)觀察

攻毒后2 d，分別取各試驗(yàn)組小鼠肝、脾、肺、腎進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

2.6.1 肝病理變化 肝病理組織學(xué)觀察如圖7所示，攻毒后2 d免疫組小鼠肝組織可見明顯出血，炎性細(xì)胞浸潤等肝病理損傷有不同程度改善(圖B、C和D)；3種蛋白聯(lián)合免疫組病理損傷最小(圖E)。

A. IL-10; B. MHC Ⅰ; C. RP105; D. TCR; E. TLR2; F. TLR3; G. TLR4; 不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) A. IL-10; B. MHC Ⅰ; C. RP105; D. TCR; E. TLR2; F. TLR3; G. TLR4; Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05)圖4 熒光定量PCR檢測免疫相關(guān)基因的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 The relative transcription level detection of immune related genes by fluorescence quantitative PCR

圖5 小鼠的攻毒保護(hù)率(A)和攻毒后的體重變化(B)Fig.5 The protection rate and body weight change in immunized mice after challenge

A.肝；B.脾；C.肺；D.腎。不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) A. Liver; B. Spleen; C. Lung; D. Kidney. Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05)圖6 攻毒后小鼠各臟器荷菌量檢測Fig.6 The bacterial load of mice organs after challenge

A. 健康對照組; B. EAG組; C. SeM組; D. SrtA組; E. EAG+SeM+SrtA組; F. PBS組。箭頭指示臟器出血明顯 A. Healthy control group; B. EAG group; C. SeM group; D. SrtA; E. EAG+SeM+SrtA group; F. PBS group. The arrow indicates obvious bleeding and inflammatory exudation圖8 小鼠脾主要病理組織學(xué)變化(HE染色)Fig.8 Histopathological changes of spleen in mice(HE staining)

A. 健康對照組; B. EAG組; C. SeM組; D. SrtA組; E. EAG+SeM+SrtA組; F. PBS組。箭頭指示肺間隔增大明顯，炎性細(xì)胞滲出 A. Healthy control group; B. EAG group; C. SeM group; D. SrtA; E. EAG+SeM+SrtA group; F. PBS group. The arrow indicates that the pulmonary septum is enlarged and inflammatory cells exudate圖9 小鼠肺主要病理組織學(xué)變化(HE染色)Fig.9 Histopathological changes of lung in mice(HE staining)

A. 健康對照組; B. EAG組; C. SeM組; D. SrtA組; E. EAG+SeM+SrtA組; F. PBS組。箭頭指示臟器出血明顯 A. Healthy control group; B. EAG group; C. SeM group; D. SrtA; E. EAG+SeM+SrtA group; F. PBS group. The arrow indicates obvious bleeding and inflammatory exudation圖10 小鼠腎主要病理組織學(xué)變化(HE染色)Fig.10 Histopathological changes of kidney in mice(HE staining)

2.6.2 脾病理變化 脾病理組織學(xué)觀察如圖8所示，攻毒后2 d免疫組小鼠可見脾出血，炎性細(xì)胞增多(圖B、C和D)，3種蛋白免疫組小鼠脾出血較少，聯(lián)合免疫組的脾病變最小(圖E)。

2.6.3 肺病理變化 肺病理組織學(xué)觀察如圖9所示，攻毒后2 d PBS對照組小鼠可見肺間質(zhì)增寬、斷裂，炎性細(xì)胞浸潤，各免疫組小鼠肺病理損傷有減輕(圖9B～D)，聯(lián)合免疫組肺病理損傷明顯減輕(圖9E)。

2.6.4 腎病理變化 腎病理組織學(xué)觀察如圖10所示，攻毒后各重組蛋白免疫組對該菌引起的小鼠腎間質(zhì)充血，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，腎小球嚢腔腫脹變大，空泡變性等病理損傷有明顯改善，3種蛋白聯(lián)合免疫組腎病理損傷最小。

3 討 論

馬腺疫俗稱“槽結(jié)”，高度傳染馬、騾和驢等馬屬動物，受到國內(nèi)外的普遍重視[14]。因馬腺疫弱毒菌苗和滅活菌苗在免疫效果、安全性和價(jià)格方面還存在安全隱患、交叉保護(hù)性差等問題，迫切需要研制新型、高效、安全、價(jià)廉的疫苗。

S.equi毒力因子眾多，近年來隨著對細(xì)菌基因組及亞單位結(jié)構(gòu)的深入了解，研制多價(jià)亞單位疫苗已成為可能。當(dāng)前對亞單位疫苗的研究已顯示出良好的發(fā)展?jié)摿6, 8]，研究證明EAG、SclC及CNE免疫可以提供部分保護(hù)力[19-21]。類M蛋白(SeM)可抵抗吞噬細(xì)胞對該菌的吞噬作用，誘發(fā)高度保護(hù)性調(diào)理抗體[22-23]。EAG為該菌表面可與IgG 結(jié)合的毒力蛋白，可參與該菌的黏附、吞噬調(diào)理和免疫逃避[24]。本研究選擇了這兩種蛋白作為抗原組成成分，結(jié)果表明這兩種免疫原在免疫保護(hù)力和誘發(fā)抗體方面可以顯示出較佳的效果。

除了SeM 和EAG外，本研究中還選擇分選酶SrtA作為抗原成分之一。該酶是存在于多種革蘭陽性菌表面的轉(zhuǎn)肽酶，保守性好，主要參與該類病原菌的致病和黏附過程[25]，目前被認(rèn)為是非常有潛力的新型抗菌靶標(biāo)。有關(guān)SrtA的研究國外主要集中在金黃色葡萄球菌[14]，國內(nèi)對該酶相關(guān)的研究較少，且主要集中在SrtA抑制劑的篩選方面[25]。Fan等[26]對A群鏈球菌的研究表明SrtA經(jīng)黏膜免疫小鼠可誘導(dǎo)Th17介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，對A群鏈球菌的交叉保護(hù)具有重要價(jià)值。Chen等[27]將A群鏈球菌SrtA與該菌毒力因子SCPA聯(lián)合免疫小鼠，攻毒后存活率較每種蛋白單獨(dú)免疫高，且能有效清除該菌的感染。為進(jìn)一步探索具有Th17型細(xì)胞免疫誘導(dǎo)能力SrtA的聯(lián)合免疫效果，本研究中將S.equi的SrtA與保護(hù)性抗原EAG與SeM的聯(lián)合免疫小鼠，綜合分析證明該種免疫原可以與其他抗原聯(lián)合對S.equi感染產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果。

SrtA與S.equi毒力因子SeM 和EAG聯(lián)合免疫小鼠，攻毒后組織荷菌量和免疫保護(hù)率得到顯著改善，3種蛋白聯(lián)合免疫較單獨(dú)免疫可顯著降低S.equi在肺、肝、脾及腎的定植及減輕這些組織的病理損傷，優(yōu)于于每種蛋白單獨(dú)免疫。這些結(jié)果表明這3種蛋白抗原在免疫效果和保護(hù)力方面可以發(fā)揮免疫協(xié)同作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)這3種抗原蛋白在誘導(dǎo)免疫相關(guān)分子的表達(dá)方面也顯示出優(yōu)勢。以往研究表明MHCⅠ類分子可遞呈內(nèi)源性抗原肽，還可通過充當(dāng)NK細(xì)胞和某些T細(xì)胞表面受體的配體，參與天然免疫應(yīng)答過程[28]。本研究結(jié)果表明，SrtA蛋白單獨(dú)免疫可誘導(dǎo)MHCⅠ的表達(dá)，在聯(lián)合免疫中也表現(xiàn)出該誘導(dǎo)作用，推測SrtA可能通過MHCⅠ參與及誘導(dǎo)天然免疫。T 細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的靶向性作用[29]。本研究結(jié)果表明，SrtA分子單獨(dú)免疫可有效誘導(dǎo)TCR的表達(dá)，3種蛋白的聯(lián)合免疫結(jié)果也表明，SrtA可在聯(lián)合免疫過程中發(fā)揮對細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類跨膜糖蛋白模式識別受體，可在機(jī)體抵御病原菌的入侵中發(fā)揮重要作用[30]。Lecours等[31]發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌感染豬樹突狀細(xì)胞后，TLR2和TLR6的表達(dá)表現(xiàn)上調(diào)，而TLR1和TLR4的表達(dá)水平?jīng)]有變化，提示了TLRS可能參與豬鏈球菌感染宿主細(xì)胞后炎癥反應(yīng)的發(fā)生。R?nnberg等[32]用S.equi攻擊TLR2缺失小鼠，發(fā)現(xiàn)TLR2 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平顯著下降，證明了S.equi可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，可能與TLR2信號通路有關(guān)。國內(nèi)杜潤慈等[33]的研究證明S.equi在感染后24 h，能顯著上調(diào) RAW264.7 細(xì)胞TLR1、TLR2 及TLR6 mRNA 的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，SrtA可誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞中TLR2、TLR3及TLR4的轉(zhuǎn)錄，推測其在S.equi感染過程中是一個(gè)重要的免疫信號調(diào)節(jié)分子。

IL-10是Th2細(xì)胞分泌的一種抗炎細(xì)胞因子，參與炎癥抑制反應(yīng)，還可刺激抗體的產(chǎn)生。杜潤慈等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，S.equi感染小鼠后IL-10的mRNA水平顯著升高。但這種誘導(dǎo)效果具體由該菌的哪些分子引起的還不明確。本研究結(jié)果表明，EAG免疫組IL-10表達(dá)水平顯著升高，且明顯高于其他2種蛋白和，該結(jié)果表明，S.equi的EAG蛋白在感染過程中可以發(fā)揮重要的抗炎作用。

Guss等[17]用S.equi的7種不同抗原蛋白免疫馬駒并攻毒，證明這7種蛋白聯(lián)合免疫保護(hù)率得到有效的提高，但這種多價(jià)亞單位疫苗仍存在著生產(chǎn)成本高的問題。本研究選擇了EAG、SeM及SrtA3種抗原免疫小鼠模型并攻毒，取得了良好的免疫效果。除了EAG外，本研究所選擇的免疫原與Guss等選擇的免疫原均不同，且免疫原數(shù)量少，有助于解決亞單位疫苗抗原成分過多生產(chǎn)成本過高的問題，未來還需要繼續(xù)開展本動物免疫試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

采用3種不同抗原蛋白EAG、SeM及SrtA單獨(dú)及聯(lián)合免疫小鼠，有效誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，其中抗體亞型以IgG1和IgG2b為主，與單個(gè)抗原免疫相比，3種抗原蛋白聯(lián)合免疫可顯著降低S.equi在各臟器中的定植及對小鼠產(chǎn)生有效的攻毒保護(hù)。該結(jié)果可為馬腺疫亞單位疫苗的研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。此外本研究還探索了抗原分子免疫對免疫分子表達(dá)水平的影響。