雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

戴 巍，宋瑞龍，張遠浩，鄒 輝， 顧建紅，袁 燕，卞建春，劉學忠*

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009； 2. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚州 225009； 3. 揚州大學 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009)

骨骼肌衛(wèi)星細胞(muscle satellite cell，MSC)又稱為肌源性干細胞，位于肌纖維肌膜和周圍細胞外基質(zhì)之間，即基底膜(ECM)處[1]。細胞呈扁平紡錘形或梭形，在正常條件下，肌肉衛(wèi)星細胞處于靜止的待激活狀態(tài)，當受到外界各類刺激后被激活，修復損傷。因此，肌肉衛(wèi)星細胞對骨骼肌再生和生長起著至關(guān)重要的作用。

骨骼肌衛(wèi)星細胞起源尚不完全清楚，目前有兩種假說：第一種為體節(jié)來源假說，即衛(wèi)星細胞起源于胚層內(nèi)體節(jié)來源的細胞中，這種假說被證實于鵪鶉胚胎試驗[2]；第二種為非生肌來源假說，De Angelis等[3]將分離胚胎背部主動脈得到的細胞移植到小鼠中，可參與肌肉再生。但成熟骨骼肌衛(wèi)星細胞可以同時表達出兩種標記物, 且骨骼肌衛(wèi)星細胞存在異質(zhì)性，表明兩種起源可能都是存在的[4]。

骨骼肌衛(wèi)星細胞移植作為一種治療多種再生性疾病(肌營養(yǎng)不良、心力衰竭等)的手段，目前已被廣泛研究[5]。因此，高純度骨骼肌衛(wèi)星細胞作為移植細胞及基因治療工程細胞在臨床上具有良好的應用前景。然而，由于其干細胞的特性，MSC含量僅占總肌細胞的2%～5%，且目前，MSC分離純化往往需要使用細胞分選儀，操作復雜且代價較高[6]，實驗室分離方法一般為組織貼壁法和單雙酶解法，但其耗時長、細胞存活率低、保存性差。因此，建立一個快速、簡便、高效的骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)的方法尤為重要。鑒于此，本試驗在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上對提取細胞使用的酶、純化細胞的方法以及后續(xù)的細胞分化方法進行優(yōu)化，以期建立一種高效的骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

12胚齡SPF雞胚來自濟南鑫盛達生物工程有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM-F12高糖培養(yǎng)基(Gbico)；胎牛血清(Gbico)；青鏈霉素混合液(10 000 mg·L-1青霉素、10 000 mg·L-1鏈霉素，索萊寶)；磷酸鹽緩沖液PBS(自配)；自制混合酶溶液(胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶；專利號：201911226803.8)；0.25%胰蛋白酶(新賽美)；CCK-8試劑(上海同仁)；4%多聚甲醛(新賽美)；Pax7抗體、Desmin抗體(ABclonal)；兔抗鼠488標記二抗、DIPI(碧云天)；TRIzol試劑(天根)；反轉(zhuǎn)錄試劑、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)。其他試劑均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純。所有PCR引物均由華大基因有限公司合成。

5810RR型冷凍離心機(Eppendorf)；WYJ-857BR型醫(yī)用凈化工作臺(蘇州金燕凈化設(shè)備廠)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；Sunrise-basic型酶標儀(Tecan)；7500型實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.3 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞分離與培養(yǎng)

取12胚齡SPF雞蛋，取出雞胚；酒精棉擦拭腿部。取髖關(guān)節(jié)以下腿部，棄筋膜、脂肪、骨骼等非肌肉組織，并用PBS緩沖液沖洗；用眼科剪剪至肉糜狀，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，吹打混勻，靜置5 min，棄上清；加入組織塊兩倍體積的自制混合酶溶液(專利號：201911226803.8)，置37 ℃恒溫搖床中消化30 min； 待消化完畢后加入同等體積生長培養(yǎng)基(含15% FBS，1%青鏈霉素混合液的F12-DMEM培養(yǎng)基)終止消化。消化液依次過100目和400目細胞過濾篩。細胞懸液1 500 r·min-1離心10 min；棄上清，生長培養(yǎng)基重懸細胞接種于細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.4 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞純化及傳代培養(yǎng)

細胞沉淀用生長培養(yǎng)基重懸并移入培養(yǎng)板中，置37 ℃培養(yǎng)箱1 h；取未貼壁細胞懸液移入新的培養(yǎng)板中進行第二次貼壁，以此去除成纖維細胞；24～36 h后換液，從而完成對傳統(tǒng)差速貼壁法的優(yōu)化。

由于MSC密度達到70%后會出現(xiàn)融合，因此，在密度達到60%左右便可以進行傳代。棄培養(yǎng)基并用PBS洗兩遍，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶；培養(yǎng)基終止消化；收集細胞懸液，1 500 r·min-1離心5 min；重懸后接種于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

將細胞用0.25%胰蛋白酶消化，滴管吹落細胞，1 500 r·min-1離心5 min，收集細胞沉淀，凍存液重懸后置液氮中保存。

1.5 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞誘導分化

取培養(yǎng)至第二代的細胞，待其分裂生長至70%且開始融合后，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌，用誘導分化培養(yǎng)基(含4% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基)，誘導分化2～3 d，鏡下觀察MSC分化情況。

1.6 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞生長曲線的繪制

取第三代細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞；分為7組，每組5個重復。接種時間記為第0天，之后連續(xù)7 d在固定的時間提前1 h加入10 μL CCK-8，用酶標儀測定450 nm處吸光值；以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.7 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞免疫熒光鑒定

取第三代細胞接種于24孔板上，每孔2×104個細胞。將細胞用PBS洗滌；4%多聚甲醛固定20 min， 0.2%～0.5% Triton X-100透膜處理15 min； 處理完畢后用PBS洗滌；滴加5% BSA封閉1～2 h；棄封閉液，分別加入Pax7、Desmin一抗，4 ℃過夜孵育；回收一抗，PBS洗滌；加入相應的兔抗鼠488標記二抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌；加入DIPI染核15 min；PBS洗滌；封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞RT-PCR鑒定

取第四代細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，采用Trizol 法進行總RNA的提取，試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA； 以cDNA為模板，加入Pax7、MyHC、MyoD1基因上、下游引物進行RT-PCR，引物序列見表1；20 μL體系：10 μL SYBR MIX，上、下游引物各0.4 μL, 2 μL cDNA，無酶水補齊至20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統(tǒng)采集圖像。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計分析

結(jié)果以“平均數(shù)±標準差(Mean±SD)”表示，組間差異性采用SPSS 17.0軟件中兩樣本均數(shù)t檢驗的方法進行分析比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞形態(tài)觀察

用優(yōu)化后的差速貼壁法純化細胞，經(jīng)過24 h后細胞貼壁，圖1A中細胞生長旺盛、排列整齊、雜質(zhì)較少；圖1B中細胞接觸生長相互連接；圖1C中細胞在分化前呈梭形。

細胞生長到70%趨于融合時，誘導分化。由圖2可見，誘導分化12 h時細胞匯集成簇(圖2A)；24 h 時形成肌管(圖2B)；48 h時肌管粗大、排列整齊(圖2C)。

A.4倍鏡下細胞形態(tài)；B.10倍鏡下細胞形態(tài)；C.20倍鏡下細胞形態(tài) A. Cell morphology under ×4 microscope; B. Cell morphology under ×10 microscope; C. Cell morphology under ×20 microscope圖1 顯微鏡下細胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology under microscope

A.誘導分化12 h；B.誘導分化24 h；C.誘導分化48 h A. Induced differentiation for 12 h; B. Induced differentiation for 24 h; C. Induced differentiation for 48 h圖2 誘導分化后顯微鏡下細胞形態(tài)(40×)Fig.2 Cell morphology under microscope after induced differentiation(40×)

2.2 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的生長曲線及存活率

由圖3可見，第三代的MSC生長曲線呈“S”型。其中，第1～3天為潛伏期，細胞增殖緩慢，第3～5天 為對數(shù)增長期，第5天細胞數(shù)達到最大，第5～6天 細胞生長進入平臺期，第6天以后，細胞數(shù)量減少。說明雞骨骼肌衛(wèi)星細胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境下能夠存活、增殖，且生長狀況良好。

將所得雞骨骼肌衛(wèi)星細胞經(jīng)臺盼藍染色并計算，由表2可見，(90.82±1.294)%的細胞不著色，提示優(yōu)化改良后的方法所得的細胞存活率較高。

2.3 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞免疫熒光鑒定

采用免疫熒光對MSC特異性標志基因Pax7、Desmin的表達進行鑒定，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。由圖4可見，Pax7抗體與細胞中蛋白結(jié)合良好(圖4B)，蛋白處于細胞核中，符合衛(wèi)星細胞特性(圖4C)。由圖5可見，Desmin抗體與細胞中蛋白結(jié)合良好(圖5B)，蛋白處于細胞質(zhì)中，符合衛(wèi)星細胞特性(圖5C)。

隨機選取5個視野對照核染位置及明場，計算陽性率，得出其純度可達(90.44±1.264)%。

圖3 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞生長曲線Fig.3 Growth curve of chicken skeletal muscle satellite cells

表2 細胞活率

圖4 Pax7免疫熒光染色鑒定(20×)Fig.4 Pax7 immunofluorescence staining identification (20×)

圖5 Desmin免疫熒光染色鑒定(20×)Fig.5 Desmin immunofluorescence staining identification (20×)

2.4 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞RT-PCR鑒定

采用RT-PCR以及凝膠電泳檢測純化后MSC靜止期、分化期、增殖期的標志性基因Pax7、MyHC、MyoD1的表達量。結(jié)果如圖6顯示，Pax7、MyHC、MyoD1表達陽性；由圖7可見，分化后靜止期標志性基因Pax7表達量極顯著下降(P<0.01)，比分化前降低了1.705倍；分化后標志性基因MyHC表達量極顯著上升(P<0.01),是分化前的13.073倍。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準 M.DNA marker圖6 Pax7、MyHC、MyoD1凝膠電泳鑒定Fig.6 Gel electrophoresis to identify Pax7, MyHC, MyoD1

*.P<0.05；**.P<0.01圖7 分化前后Pax7、MyHC基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Pax7 and MyHC gene transcription levels before and after differentiation

3 討 論

骨骼肌衛(wèi)星細胞作為一種肌源質(zhì)干細胞，在機體正常情況下處于靜止狀態(tài)，當受到一定的刺激時，可瞬時活化進入細胞周期完成修復，對維持機體穩(wěn)態(tài)有非常重要的作用。長期以來，MSC都被認為是只能分化為肌管的單潛能干細胞；但近些年的研究結(jié)果表明，MSC也具備多潛能分化能力[7-8]。Ruiz-ojeda等[9]發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)時添加胰島素、地塞米松和羅格列酮等誘導因子后，細胞形態(tài)會發(fā)生變化并產(chǎn)生大量脂滴；而添加β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松則可以促進鈣質(zhì)形成，從而誘導MSC向成骨分化[10]。這些研究表明，MSC具有可塑性強、多潛能等優(yōu)點，可廣泛應用于損傷修復以及基礎(chǔ)研究中。而高效、便捷的分離方法便成為了后續(xù)研究的基礎(chǔ)，因此，近年來分離純化的方法在不斷改進。

常用分離的方法一般為組織貼壁法[11-12]、兩步消化法[13]和單酶解法[14]。最傳統(tǒng)的為組織貼壁法，但其需要的時間很長，已逐漸被淘汰；兩步消化法常用膠原酶或分散酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化，但其耗時長，過程中易污染；單酶解法常只用膠原酶消化，容易消化不完全。且目前，成功分離的MSC以人、鼠、豬為主，在禽類中尚沒有很好的分離方法。本試驗采用自主研制的混合酶，綜合了膠原酶松散肌肉纖維及胰蛋白酶游離細胞的原理，通過比例篩選，擇出消化效果最優(yōu)、成本最低的配方，最終一步消化完成MSC分離，從而縮短分離時間，最大限度地解決了現(xiàn)有技術(shù)中細胞活率低、數(shù)量少、可保存性差的缺陷和不足。但是，酶消化法分離細胞不可避免地會導致成纖維細胞混雜其中，因此，為了提高MSC的純度，必須進行純化。其中，最高效的方法是采用高通量細胞分選儀器進行精密的分選純化[6]，但需要昂貴的儀器，且分選前還要進行繁瑣的細胞標記處理，因此并不適用于家禽MSC的純化；梯度離心法由于其操作復雜且MSC本身數(shù)量較少，會使細胞在純化過程進一步流失；而傳統(tǒng)差速貼壁法則根據(jù)MSC首次貼壁需要12～24 h這一特性，一般需要進行兩次2 h和一次24 h的兩次更換培養(yǎng)皿[15]。該方法耗時較長，因此，本試驗根據(jù)成纖維細胞在0.5～1 h就能貼壁這一特性，在傳統(tǒng)差速貼壁法的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，也就是每隔1 h將上清轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，連續(xù)重復2～3次，這一改進大大減少了純化細胞的時間和工作量，且純化效果良好。本試驗根據(jù)MSC生長到70%開始融合，并且在外界刺激條件下會定向分化為肌管這一特性，模擬非適宜的生長環(huán)境，通過多次FBS濃度的篩選，開創(chuàng)性地采用低血清濃度分化法，也就是當MSC生長到70%左右時采用含4% FBS的培養(yǎng)基誘導分化MSC，取代了傳統(tǒng)的含2%的馬血清與1%～2%雞胚提取物制成的分化培養(yǎng)基，在保證細胞活率的情況下，更加簡便快捷，提高了在普通實驗室操作的可行性。

目前，對MSC的鑒定公認度最高的是免疫熒光標記法，而Pax7是骨骼肌衛(wèi)星細胞靜止期的特異性標志蛋白，可以作為鑒定細胞的標志物[16]；Desmin是構(gòu)成細胞骨架的成分之一，為肌纖維所特有，是骨骼肌衛(wèi)星細胞的基本標記[17]。因此，本試驗采用Pax7、Desmin雙染，從而初步鑒定分離的細胞為具有分化潛能的骨骼肌衛(wèi)星細胞。同時，采用RT-PCR的方法檢測靜止期、增殖期及分化期特異性基因Pax7、MyoD1、MyHC的表達量，進一步證明本研究分離培養(yǎng)的細胞是具有多潛能分化生物學特性的骨骼肌衛(wèi)星細胞。

4 結(jié) 論

本試驗采用自制混合酶初步建立了雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離方法，并對細胞純化和誘導方法進行了優(yōu)化。同時，在形態(tài)學和基因表達水平上對細胞進行了鑒定。為雞骨骼肌生長發(fā)育、肉質(zhì)改良、藥理毒理試驗、細胞移植及基因治療工程在臨床應用提供了研究基礎(chǔ)。