褐藻酸和褐藻酸鹽的分離提取及應(yīng)用研究進(jìn)展

張楠，魏琦峰，任秀蓮

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209）

褐藻酸（alginic acid），又名褐藻膠，分子式（C6H8O6）n，是由 β-D-甘露糖醛酸（M）和 α-L-古羅糖醛酸（G）通過1，4-糖苷鍵聚合而成的天然線性高分子多糖，以鈣及鈉鹽的形式存在于褐藻的細(xì)胞壁中[1]。褐藻酸鹽，一般是指褐藻酸與一價(jià)或二價(jià)金屬離子形成的高分子化合物，其中最常見的是褐藻酸鈉、褐藻酸鈣。

褐藻酸和褐藻酸鹽的特殊結(jié)構(gòu)決定其具有特殊的凝膠能力，結(jié)構(gòu)中的G、M單體以3種方式組合：GG、MM和GM，G、M單體和3種鏈段的含量都會(huì)影響褐藻酸鹽的性能[2]。褐藻酸鹽中，M含量高的硬度小、柔韌性好；G含量高的硬度大但易碎[3]。通過調(diào)整其中兩種單體的比例可以生產(chǎn)出強(qiáng)度不同的凝膠[4]，以便應(yīng)用于不同行業(yè)中。

褐藻酸和褐藻酸鹽能在人體中發(fā)生陽離子的交換，吸收體內(nèi)某些重金屬離子，從而調(diào)節(jié)人體的新陳代謝；它們還具有良好的生物相容性、抗氧化性、凝膠性等性能，因此被廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)學(xué)、日用化工品、紡織印染及廢水處理等領(lǐng)域[5-7]，并且在醫(yī)療衛(wèi)生、食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用占據(jù)了它們?nèi)蚴袌?chǎng)的絕大部分。目前，工業(yè)上主要采用碳酸鈉消化褐藻的方式提取褐藻酸/褐藻酸鹽，此方法相對(duì)成熟，但仍然存在很多問題，如：工藝繁瑣，產(chǎn)品質(zhì)量易受多方面因素影響等。因此，探索出一種能夠選擇性浸出褐藻酸鹽的堿性試劑對(duì)工藝優(yōu)化有著重要意義。

1 海藻中褐藻酸和褐藻酸鹽的提取工藝

褐藻酸和褐藻酸鹽主要存在于各種褐藻類植物中。目前提取工藝中常用的原材料有泡葉藻、海帶、馬尾藻和墨角藻。FOUREST E等[8]的研究結(jié)果顯示，4種褐藻中褐藻酸鹽的分子量順序?yàn)槟窃澹寂萑~藻＜馬尾藻＜海帶，且其黏度隨著分子量的增大而逐漸增大。其中，海帶中的褐藻酸鹽分子量大、含量高、較易被提取，因此國(guó)內(nèi)主要使用海帶來提取褐藻酸鹽。褐藻酸和褐藻酸鹽常用的提取方法包括熱水浸提法、化學(xué)法和酶解法，此外還有物理法和非等溫自水解法兩種新型的提取方法。

1.1 熱水浸提法

作為一種傳統(tǒng)的褐藻酸和褐藻酸鹽提取方法，熱水浸提法是利用多糖溶于熱水的性質(zhì)[9]，在熱力作用下，海藻的細(xì)胞原生質(zhì)發(fā)生質(zhì)壁分離，水與細(xì)胞質(zhì)充分接觸，從而溶解液泡內(nèi)的多糖到浸出液中。Kim Ga-Yeong等[10]以海帶為原料，比較水和碳酸鈉提取褐藻酸鹽的效果。在溫度較低的情況下，2%的碳酸鈉溶液提取褐藻酸鹽的得率為21.06%，較水提法提高56.58%，效果更好。水提法中，中性的浸出環(huán)境可減少多糖的水解，得到完整的多糖分子[11]，但也降低了得率、產(chǎn)生了大量不易處理的廢液，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，國(guó)內(nèi)外研究者提出了非等溫自水解法、化學(xué)法、酶解法和物理法，通過使用生化試劑或增強(qiáng)外部能量的方式破壞細(xì)胞壁，以提高多糖的提取率。

1.2 非等溫自水解法

非等溫自水解法是一種新型的提取方法，其原理是在傳統(tǒng)水提法的基礎(chǔ)上增大壓力，在一定的溫度范圍內(nèi)用熱壓縮水對(duì)海藻進(jìn)行自動(dòng)水解處理，以加大褐藻酸鹽的溶出。Noelia Flórez-Fernández等[12]以海藻為原料，將水與海藻按照質(zhì)量比30∶1混合在加壓反應(yīng)器中，在7.5個(gè)大氣壓、120℃～220℃條件下反應(yīng)，最終在160℃獲得褐藻酸鹽。一系列表征顯示所提取的褐藻酸鹽與商業(yè)褐藻酸鹽的性質(zhì)相當(dāng)，是高質(zhì)量的褐藻酸鹽。

1.3 化學(xué)法

化學(xué)法即酸堿法，通過酸堿試劑的加入破壞植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，促進(jìn)褐藻膠的溶出，是工業(yè)上提取褐藻膠的主要方法。提取工藝主要包括脫色、酸凝和消化3個(gè)步驟[13]，其中碳酸鈉是常用的堿性試劑，雖然該方法有著操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單且耗能低等特點(diǎn)，但會(huì)產(chǎn)生大量酸堿廢液，對(duì)環(huán)境造成一定的負(fù)擔(dān)。Mohammed Akeem等[14]以馬尾藻為原料，探究多階段提取褐藻酸鈉的最佳條件。用0.5 mol/L硫酸在40℃下對(duì)馬尾藻進(jìn)行預(yù)處理，硫酸與海藻體積比為15∶1；再用5%的碳酸鈉溶液在65℃條件下將其浸泡2 h，溶液與海藻體積比仍為15∶1，則褐藻酸鈉的得率可達(dá)到19%。試驗(yàn)過程中酸或堿的濃度過高，都會(huì)導(dǎo)致褐藻酸鈉的提取率降低。Mohamed Fertah等[15]為研究溫度對(duì)提取率的影響，以海藻L.digitata為原料，用2%碳酸鈉溶液提取5 h，結(jié)果表明在40℃下得率最高，為44.01%；Vauchel P等[16]同樣以海藻L.digitata為原料，取固液比為1∶20（g/mL），在20℃下用4%的碳酸鈉溶液提取褐藻酸鈉，得率達(dá)到38%?？梢娀瘜W(xué)法是提取褐藻膠的較佳選擇。

1.4 酶解法

酶解法由于高效、專一且條件溫和等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取[17-18]。酶能夠分解細(xì)胞壁，使細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間液溶解出來，浸出液再經(jīng)分離純化可得到褐藻酸。陳宏等[19]使用纖維素酶處理海帶，之后加入碳酸鈉溶液浸出褐藻酸鈉，得率可以達(dá)到42.46%。李曉等[20]用酶解法提取銅藻中的褐藻酸鈉，與傳統(tǒng)工藝對(duì)比，提取率提高了46.7%，且物質(zhì)消耗和廢水排放量都優(yōu)于傳統(tǒng)法。田洪蕓等[21]以海帶為原料，首先使用纖維素酶和果膠酶，在pH 4.5、55℃環(huán)境下進(jìn)行2 h水解，再加入同等質(zhì)量的木瓜蛋白酶，在pH 8.5、85℃條件下水解2 h，最后煮沸10 min以鈍化酶活性，所得褐藻酸鈉的得率為24.67%，雖然得率較高，但也存在一定的局限性——試驗(yàn)過程中的溫度、pH值都會(huì)影響酶的活性，加大了試驗(yàn)難度。除了對(duì)試驗(yàn)條件要求苛刻外，高成本也使得酶解法不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)褐藻酸鹽的提取需要復(fù)合酶的作用，加大了研究難度。因此，還需進(jìn)一步研究開發(fā)高活性、高純度的酶制劑，以達(dá)到提高提取效率、降低成本的目的。

1.5 物理法

除了以上通過加入化學(xué)試劑和酶的方法，物理法也常用來提取植物多糖。常用的兩種方法是超聲輔助提取法和微波輔助提取法，原理是借助外力的作用震碎植物的細(xì)胞壁，使得多糖進(jìn)入浸出液中。

1.5.1 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法是利用超聲波的空化作用震碎植物的細(xì)胞壁[22]，加速褐藻膠溶出的一種新型方法。Flórez-Fernández N 等[23]使用超聲輔助法提取鈍馬尾藻中的褐藻酸鈉，超聲設(shè)定條件為1.5 A、150 W、40 Hz，在25℃下用水提取5 min～30 min，再通過離心、酸浸出等方式可制備得到褐藻酸鈉凝膠?？梢钥闯龃朔椒ǖ奶崛r(shí)間明顯減少，且經(jīng)檢測(cè)得知，此凝膠具有穩(wěn)定和熱可逆的特性。Youssouf Latufa等[24]以海藻為原料，取固液比為10 g/L，在pH 11條件下提取30 min，以確定試驗(yàn)最佳的溫度和超聲功率。試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度90℃、超聲功率50 W時(shí)，褐藻酸鈉的得率達(dá)到27%。該方法減少了化學(xué)物質(zhì)的使用，同時(shí)可縮短反應(yīng)時(shí)間，且提取率與傳統(tǒng)酸堿法相當(dāng)，但對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用。

1.5.2 微波輔助提取法

微波法作為一種更快、更有效的生物質(zhì)處理方法，它是通過微波誘導(dǎo)使植物中水分子產(chǎn)生振動(dòng)，導(dǎo)致溫度升高、細(xì)胞壁破裂、胞內(nèi)物質(zhì)釋放到浸出液中[25]，從而達(dá)到提取褐藻酸鹽的目的。YUAN Y等[26]使用0.1 mol/L碳酸鈉溶液提取巨藻Ascophyllum nodosum中的褐藻酸鹽，用100℃微波輻射10 min，使褐藻酸鹽的得率達(dá)到18.24%。相比于其他方法，時(shí)間短、效率高。鑒于傳統(tǒng)水提法溫度高、時(shí)間長(zhǎng)，陳以勇等[27]使用微波輔助提取法提取紫菜中的多糖，提取時(shí)間大幅度降低，從原來的6 h縮短到14 min。該方法相比其他熱溶劑萃取法具有很多優(yōu)點(diǎn)，但至今未工業(yè)化，主要是工廠難以達(dá)到其生產(chǎn)所需的條件[28]。因此，采用微波法分離提取褐藻酸和褐藻酸鹽的研究還有待加強(qiáng)。

超聲法和微波法除了單獨(dú)使用外，還可以同時(shí)用于海藻中褐藻酸/褐藻酸鹽的提取。田洪蕓等[29]利用超聲-微波協(xié)同處理海帶，碳酸鈉消化得到其中褐藻酸鈉，提取率達(dá)到88.6%，可見其協(xié)同作用的效果明顯。

幾種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。

表1 褐藻酸和褐藻酸鹽提取方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of algin acid and alginate extraction methods

通過表1的比較，可以看出熱水浸提法的得率較低且資源消耗大，在工業(yè)生產(chǎn)中很少被使用；非等溫自水解法提取的褐藻酸鹽純度高，但成本較高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；超聲輔助提取法和微波輔助提取法提取效率高、時(shí)間短，但振動(dòng)頻率過高會(huì)導(dǎo)致褐藻膠發(fā)生降解，黏度降低，影響其后續(xù)應(yīng)用，所以還需進(jìn)一步探究超聲/微波條件對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響；酶解法得率高且環(huán)境污染小，但其成本較高，需研究開發(fā)高效的酶制劑以降低成本，使其在工業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用；化學(xué)法成本低、操作簡(jiǎn)單且得率高，工業(yè)上應(yīng)用更為廣泛，但工藝步驟繁瑣且產(chǎn)生大量廢液廢渣，給環(huán)境帶來一定的負(fù)擔(dān)，所以若能找到選擇性浸出褐藻膠的堿性試劑，則能夠簡(jiǎn)化工藝步驟，避免資源的浪費(fèi)。

2 褐藻酸和褐藻酸鹽的應(yīng)用研究

褐藻酸和褐藻酸鹽作為一種從褐藻中提取的天然高分子多糖，具有止血、抗氧化[30]、抗病毒、降血脂[31]和免疫調(diào)節(jié)等生物活性，其結(jié)構(gòu)中特有的G、M單體的比例決定了褐藻酸鹽的性能。由于其良好的生物相容性，還被用作抗癌藥物的輸送載體。下面對(duì)褐藻酸和褐藻酸鹽在食品、生物醫(yī)藥及其他領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的介紹。

2.1 在食品行業(yè)的應(yīng)用

2.1.1 食品添加劑

褐藻酸和褐藻酸鹽具有獨(dú)特的凝膠性能及增稠作用，可以作為食品添加劑應(yīng)用于不同類型的食品中[32]。相比于傳統(tǒng)的添加劑，褐藻酸鹽具有更廣泛的用途，如用作冰淇淋，混合飲料中的穩(wěn)定劑；果醬、布丁等中的增稠劑和乳化劑；掛面、糕點(diǎn)等中的水合劑；冷凍食品中的膠凝劑；寵物食品中的粘合劑。具體的用量及用途見表2[33]。

表2 褐藻酸和褐藻酸鹽在各種食品中的主要作用及用量Table 2 The main role and dosage of alginic acid and alginate in various foods

2.1.2 功能食品

褐藻酸和褐藻酸鹽是一種可食用且不被人體消化的天然大分子多糖，在腸胃中起到吸附、潤(rùn)滑[34]和凝膠過濾等作用，從而調(diào)節(jié)人體的新陳代謝。它還具備以下保健功能：降血糖[35]、降血壓、增強(qiáng)免疫力、增強(qiáng)飽腹感、調(diào)節(jié)腸胃功能[36]等，在功能食品市場(chǎng)有巨大的潛力。

2.1.3 保鮮涂膜和包裝膜

褐藻酸鈉安全性高，具有良好的抗菌性、保濕性、成膜性和透氣性等特點(diǎn)[37]，能夠減弱食物的呼吸作用和褐變反應(yīng)，延長(zhǎng)食物的保鮮期，是很好的涂膜劑，被廣泛應(yīng)用于蔬菜瓜果的保鮮中[38]。它易溶于水，能夠形成均勻而黏稠的液體進(jìn)一步加工成透明的薄膜用于食品的包裝中，該包裝膜強(qiáng)度高、隔離性好、可食用，且具有一定的保健功能，可用于開發(fā)多種可食用性包裝膜。

2.2 在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

2.2.1 醫(yī)藥制劑

褐藻酸鹽具有良好的生物相容性和特殊的黏性，不同的分子量和聚合度使它能夠形成不同黏度的產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于各種醫(yī)藥制劑[39]，如：片劑制作過程中的黏合劑、增稠劑、乳化劑、助懸劑和凝膠形成劑；緩釋制劑的載體材料[40]；涂膜劑的成膜材料等[41]。此外，以褐藻酸為原料開發(fā)的藥品藻酸雙酯鈉（poly saccharide sulphate，PSS）[42]等已被臨床醫(yī)學(xué)廣泛使用。

2.2.2 醫(yī)用敷料

醫(yī)用敷料是用來覆蓋皮膚創(chuàng)面的醫(yī)用材料[43]。早在20世紀(jì)80年代，褐藻酸鹽就作為醫(yī)用敷料用于傷口的護(hù)理[44]。醫(yī)用敷料中使用最多的離子多糖是褐藻酸鹽，它具有無毒、止血、高吸濕、高透氧、生物相容等性質(zhì)，與常規(guī)的醫(yī)用敷料相比更容易從傷口部位去除，可減少病人的疼痛感[45]。研究表明M含量高的褐藻酸鹽能促使人的單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而促進(jìn)慢性傷口的愈合[46]。山本大冢等[47]研究褐藻酸鹽水凝膠用作外科手術(shù)密封材料的功效，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)縫合傷口對(duì)比，凝膠覆蓋的傷口愈合速度更快且愈合效果更好，說明該凝膠能夠有效地密封出血口并促進(jìn)組織再生，因此在外科手術(shù)方面有著更廣泛的應(yīng)用前景。

2.2.3 藥物遞送載體

藥物遞送系統(tǒng)（drug delivery system，DDS）是利用載體負(fù)載藥物，將藥物輸送到人體組織的特定位置并最大化發(fā)揮藥效的系統(tǒng)[48]，其中藥物遞送載體的選擇最為重要。良好的載體材料要具備以下條件：一是有生物相容性和穩(wěn)定性，二是在可接受的時(shí)間內(nèi)以預(yù)定方式釋放藥物，褐藻酸/褐藻酸鹽作為藥物遞送載體具有無毒、良好的血液相容性、體內(nèi)降解清除[49]的優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)這方面有廣泛的研究，Diego S.Lima等[50]研究用于蛋白質(zhì)輸送的pH值響應(yīng)型的藻酸鹽基水凝膠，通過各種表征顯示該水凝膠能夠很好地與活細(xì)胞相容，說明其作為藥物遞送載體具有巨大的藥理潛力。此外，褐藻酸鹽與殼聚糖復(fù)合物在溫和條件下?lián)饺胨幬锴也灰鹱冃?，所以是口服遞送蛋白質(zhì)藥物的優(yōu)異包封材料[51]。

2.2.4 生物技術(shù)中的應(yīng)用

褐藻酸和褐藻酸鹽具有十分優(yōu)異的生物活性，在生物技術(shù)中應(yīng)用廣泛。其中，在固定化技術(shù)、組織工程和微囊技術(shù)中的應(yīng)用比較成熟。

固定化技術(shù)是指用化學(xué)或物理的方法將微生物、細(xì)胞或酶定位在固定的區(qū)域內(nèi)，同時(shí)保證被固定的物質(zhì)保持活性并能反復(fù)使用[52]由于褐藻酸鈉、褐藻酸鈣相比其他材料具有毒性低、耐分解、容易固定且成本低的特點(diǎn)，多用作固定化技術(shù)中的載體。王靜等[53]用褐藻酸鈉作載體、戊二醛作交聯(lián)劑固定化L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，固定化酶與游離酶相比顯示出良好的操作穩(wěn)定性。Preethi Jampala等[54]研究用于固定木聚糖酶的載體，結(jié)果表明褐藻酸鈉固定化效果明顯優(yōu)于其他載體，經(jīng)褐藻酸鈉固定化的木聚糖酶熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性有顯著提高，擴(kuò)大了該催化系統(tǒng)在食品和制藥行業(yè)的應(yīng)用。

由于褐藻酸鹽具有成本低、可塑性高、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，還能夠負(fù)載生物活性分子[55]，被廣泛用于組織工程領(lǐng)域，其中骨組織和軟骨組織工程中應(yīng)用最多。在骨組織工程中，褐藻酸鹽具有骨生成能力且促進(jìn)干細(xì)胞增殖[56]，還對(duì)成骨細(xì)胞有足夠的黏附性，從而加快骨組織的愈合速度；軟骨組織工程中，它能夠提供軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境[57]，維持細(xì)胞的表型及其表達(dá)，使軟骨組織愈合速度加快。此外，褐藻酸鹽也逐漸應(yīng)用于肝臟、心肌、神經(jīng)等組織器官再生工程中。

褐藻酸鹽作為微囊技術(shù)中應(yīng)用最多的天然材料，能夠封裝具有不同性質(zhì)的大分子和小分子化合物[58]，包括細(xì)菌、細(xì)胞、蛋白質(zhì)和微生物等。此外，還能夠封裝熱不穩(wěn)定性材料，所以褐藻酸是微囊化材料的最佳選擇。

2.3 在其他方面的應(yīng)用

在日化行業(yè)中，由于褐藻酸和褐藻酸鹽具有良好的凝膠性、成膜性和增稠性，且對(duì)人體無毒無刺激，被用作乳液中的增稠劑、水合劑和穩(wěn)定劑[59]，牙膏中的黏合劑[60]；在紡織行業(yè)中，褐藻酸鈉是優(yōu)良的印染糊料，經(jīng)它處理的織物具有高的得色量、滲透性好[61]；在廢水處理領(lǐng)域，褐藻酸鹽可以作為吸附劑分離廢水中的重金屬離子，還可以通過固定化細(xì)胞、細(xì)菌、微生物等處理各種有機(jī)廢水，從而降低廢水中雜質(zhì)的含量，達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

食品工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的多糖是褐藻酸和褐藻酸鹽，兩種領(lǐng)域的快速發(fā)展使得高純度褐藻酸鹽的需求量增加。所以如何減少工藝流程中的雜質(zhì)，并提高得率是值得關(guān)注的問題。目前，國(guó)內(nèi)外提取褐藻酸/褐藻酸鹽的主要方法是化學(xué)法。其工藝技術(shù)成熟，已廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中，但生產(chǎn)過程中使用的酸堿可能會(huì)導(dǎo)致褐藻酸和褐藻酸鹽結(jié)構(gòu)的變化，影響其生理活性，并且加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量廢液廢渣帶來環(huán)境問題。因此，研究開發(fā)一種能夠選擇性浸出褐藻酸和褐藻酸鹽的高效安全的堿性提取劑，以減少?gòu)U液的產(chǎn)生，是日后褐藻酸/褐藻酸鹽分離提取的新方向。

褐藻酸工業(yè)作為目前國(guó)內(nèi)規(guī)模最大的海藻加工業(yè)，近年來發(fā)展迅速，但仍存在產(chǎn)品質(zhì)量低、種類單一、效率低的問題。對(duì)此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)褐藻酸/褐藻酸鹽的應(yīng)用研究，提高褐藻酸和褐藻酸鹽的生產(chǎn)技術(shù)水平，為社會(huì)創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益。