莜麥谷蛋白-1酶解物螯合亞鐵離子影響因素的研究

鄭亞軍，王賢，侯雅馨，李艷，史攀琪，吳曉潔，朱玲芳

（1.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2.北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

缺鐵性貧血嚴(yán)重影響嬰幼兒生長發(fā)育、青少年智力發(fā)育和孕婦胎兒健康。由于常規(guī)飲食中鐵主要以三價(jià)鐵形式存在，被攝入人體胃腸道后容易被植酸等其他食物成分影響，易形成難溶性鹽類；同時食物中鐵主要經(jīng)離子吸收途徑進(jìn)入人體小腸刷狀緣處的吸收細(xì)胞，耗能高、途徑復(fù)雜，最終導(dǎo)致鐵的消化吸收率較低[1]。肽-亞鐵螯合物作為目前最理想的鐵營養(yǎng)強(qiáng)化劑，蛋白質(zhì)或多肽將亞鐵離子螯合于肽鏈結(jié)構(gòu)中，被攝入人體時，既可以避免胃腸道中其他食物成分的干擾，使鐵保持在二價(jià)狀態(tài)；同時，肽-亞鐵離子螯合物經(jīng)寡肽的吸收途徑通過小腸吸收細(xì)胞而進(jìn)入體內(nèi)，具有快速、能耗低、簡捷等優(yōu)點(diǎn)[2]。隨著人們生活水平的提高和綠色消費(fèi)理念的深入，以食源性蛋白質(zhì)制備肽-亞鐵螯合物，從飲食上預(yù)防和治療鐵營養(yǎng)缺乏，具有廣闊的市場前景。莜麥（naked oat）學(xué)名裸燕麥，是一種耐寒、耐旱和高產(chǎn)作物，在山西、河北北部地區(qū)、內(nèi)蒙古等地區(qū)廣泛種植。莜麥?zhǔn)巧轿魇∽罹咛厣珒?yōu)勢的雜糧作物之一[3]。莜麥蛋白質(zhì)的含量較高（15%～18%），除了優(yōu)良的營養(yǎng)功能外，還有降血脂、抑制血管緊張素酶、抗癌細(xì)胞等功能，開發(fā)潛力巨大[4～6]。組分蛋白一般指同一原料蛋白質(zhì)中，因溶解性差異而分類的不同蛋白質(zhì)，包括水溶性清蛋白、稀鹽溶解的球蛋白、堿溶性谷蛋白和酸溶性谷蛋白等。由于氨基酸組成和溶解性存在較大差異，各組分蛋白表現(xiàn)出不同的功能特性和應(yīng)用前景[4]。例如只溶解于稀酸溶液中的谷蛋白-1（酸溶性谷蛋白）和只溶解于稀堿溶液中的谷蛋白-2（堿溶性谷蛋白）的乳化性和起泡性就存在著較大差異，二者在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍也不同[7]。目前關(guān)于莜麥分離蛋白和貯藏蛋白的研究報(bào)道較多，但對莜麥組分蛋白的研究報(bào)道較少，對莜麥蛋白鐵營養(yǎng)強(qiáng)化劑及相關(guān)產(chǎn)品的研究報(bào)道就更少。本試驗(yàn)以莜麥為原料，采用分步提取法提取各組分蛋白，以亞鐵離子螯合率為評價(jià)指標(biāo)，篩選出適宜制備螯合物的組分蛋白。然后采用復(fù)合酶法水解該莜麥組分蛋白，并分析水解度、溫度、pH值等因素對螯合率的影響，以期為莜麥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莜麥：朔州市老農(nóng)民食品公司。堿性蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（200 U/mg）、胃蛋白酶（100U/mg）、胰蛋白酶（2500U/mg）、維生素C：上海素培生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)、鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、乙酸鈉：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UV-1800PC）：上海申光科學(xué)儀器公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（D-78532）：德國Hettich公司廠；真空冷凍干燥器（Thermal-20）：美國thermal公司；數(shù)顯水浴振蕩儀（HSA-D）：蘇州瑞天儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 莜麥組分蛋白的制備

將莜麥粉100 g與400 mL石油醚混勻于錐形瓶中，20℃下振蕩2 h后過濾，重復(fù)提取3次后在40℃下烘干，得到脫脂莜麥粉。各組分蛋白的提取采取連續(xù)提取法[8]，根據(jù)各蛋白質(zhì)溶解度的差異，清蛋白使用蒸餾水提取、球蛋白使用稀鹽溶液提取，而谷蛋白-1和谷蛋白-2分別采用稀酸溶液和稀堿溶液提取。各組分蛋白的濃度測定采用Bradford法[9]。

1.3.1.1 莜麥清蛋白的提取

取40 g脫脂莜麥加入200 mL蒸餾水（dH2O），35℃下攪拌提取2 h，過濾，收集濾液，在濾渣中再加入等體積dH2O，重復(fù)提取3次，合并濾液，在12 000 g下離心15 min，收集上清液，冷凍真空干燥，得到莜麥清蛋白（naked oat albumin，NOA）。

1.3.1.2 莜麥球蛋白的提取

在1.3.1.1提取過清蛋白的濾渣中，每次加入200 mL NaCl（0.2 mol/L），35℃下攪拌提取2 h，過濾，重復(fù)提取3次，將合并的濾液在12 000 g下離心20 min，收集上清液，裝入透析袋（MW 3 500 Da）中，4℃下透析24 h，每隔2 h換一次dH2O。將透析后的蛋白液冷凍干燥，得到莜麥球蛋白（naked oat globulin，NOG）。

1.3.1.3 莜麥谷蛋白-1的提取

在1.3.1.2提取了清蛋白和球蛋白的濾渣中，加入150 mL冰乙酸（體積分?jǐn)?shù)50%），反復(fù)提取3次，收集并合并濾液，12 000 g下離心15 min。將上清液在4℃下透析24 h，每隔2 h換一次dH2O。透析后冷凍干燥，得到莜麥谷蛋白-1（naked oat glutelin-1，NOG-1）。

1.3.1.4 莜麥谷蛋白-2的提取

在1.3.1.3提取了清蛋白、球蛋白和谷蛋白-1的濾渣中，加入150 mL NaOH（0.1 mol/L），反復(fù)提取3次，收集并合并濾液，12000g下離心15min。將上清液在4℃下透析24 h，每隔2 h換一次dH2O。透析后冷凍干燥，得到莜麥谷蛋白-2（naked oat glutelin-2，NOG-2）。

1.3.2 亞鐵離子螯合率的測定

亞鐵離子螯合率的測定采用鄰菲洛林法[10]。測定方法：取0.5 mL樣品，加入9.5 mL dH2O，0.01 g維生素C和1 mg/mL氯化亞鐵溶液0.1 mL，在一定水浴溫度下螯合 60 min。將螯合液稀釋500倍，取1 mL，依次加入1 mol/L鹽酸1 mL、10%鹽酸羥胺1 mL、0.12%鄰菲啰啉1mL、10%乙酸鈉5mL，然后定容至50mL，于510nm處比色?？瞻捉M用dH2O代替樣品。計(jì)算公式如下。

螯合率/%=（1-A1/A0）× 100

式中：A1為樣品組吸光值；A0為空白對照吸光值。

1.3.3 不同酶對莜麥谷蛋白-1的水解度和亞鐵離子螯合率的影響

分別采用不同酶對莜麥谷蛋白-1（NOG-1）進(jìn)行水解。包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶（堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶），各酶的用量均為0.01 g/100 g，水解時間為2 h，而各自的pH值分別為7.0、2.0、7.5、9.0和7.5。分別采用甲醛滴定法[11]和鄰菲洛林法[10]測定各莜麥谷蛋白-1水解物（naked oat glutelin-1 hydrolysates，NOG-1H）的水解度和亞鐵離子螯合率。以螯合率最高的NOG-1H制備亞鐵螯合物，并分析各影響因素。

1.3.4 不同溫度對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響

取等份的 NOG-1H 溶液（0.5 mL、2 g/100 mL），分別加入9.5 mL蒸餾水，0.01 g維生素C和1 mg/mL氯化亞鐵溶液0.1mL，調(diào)節(jié)pH2.0，使其分別在不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）下進(jìn)行螯合 60 min，測定螯合率。

1.3.5 不同pH值對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響

取等份的 NOG-1H 溶液（0.5 mL、2 g/100 mL），分別加入9.5 mL蒸餾水，0.01 g維生素C和1 mg/mL氯化亞鐵溶液 0.1 mL，調(diào)節(jié) pH 值至 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，在30℃下反應(yīng)60 min，測定螯合率。

1.3.6 亞鐵離子濃度對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響

取等份的 NOG-1H 溶液（0.5 mL、2 g/100 mL），分別加入9.5 mL蒸餾水，0.01 g維生素C和不同濃度的氯化亞鐵溶液（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mg/mL）0.1mL，調(diào)節(jié) pH2.0，在 30℃下反應(yīng) 60 min，測定螯合率。

1.3.7 不同時間對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響

取等份的 NOG-1H 溶液（0.5 mL、2 g/100 mL），分別加入9.5 mL蒸餾水，0.01 g維生素C和氯化亞鐵溶液（1 mg/mL）0.1 mL，pH 2.0、30℃下反應(yīng)不同時間（30、60、90、120、150 min），測定螯合率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各莜麥組分蛋白的亞鐵離子螯合率

莜麥各組分蛋白的含量與亞鐵離子螯合能力見表1。

從表1可以看出，莜麥組分蛋白的含量從高到低依次為球蛋白、清蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2，這與Sterna等的結(jié)果一致[5]。而NOG-1表現(xiàn)出最高的亞鐵離子螯合能力，這可能與其特殊的氨基酸組成有關(guān)。段秀[10]研究表明，蛋白質(zhì)中谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸含量較高時，由于具有大量的側(cè)鏈羧基，容易螯合金屬離子。Sterna等[5]的研究表明，NOG-1中酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）的含量較高，這是其具有較高亞鐵離子螯合和獨(dú)特溶解性的主要原因。

表1 莜麥各組分蛋白的含量與亞鐵離子螯合能力Table1 Ferrous chelating capacity of naked oat protein fractions

2.2 酶對莜麥谷蛋白-1水解度的影響

酶對莜麥谷蛋白-1水解度的影響如圖1所示。

圖1 酶對莜麥谷蛋白-1水解度和亞鐵離子螯合能力的影響Fig.1 Effect of different enzymes on hydrolysis degree and ion chelating capacity of NOG-1

圖1表明，NOG-1經(jīng)堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶降解后，水解度和螯合率均最高。可能是由于這兩種蛋白酶分屬內(nèi)肽酶和外切酶，可以同時從多肽鏈的兩端和中部位點(diǎn)水解NOG-1，釋放出更多的活性肽段和氨基酸側(cè)鏈，使NOG-1H表現(xiàn)出較高的亞鐵離子螯合率。而對于木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶來說，可能是它們最佳的水解溫度、pH值對NOG-1的溶解度不利。

2.3 不同溫度對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響

溫度對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響如圖2所示。

由圖2可知，20℃～30℃內(nèi)，溫度上升，NOG-1H對Fe2+的螯合率上升，在30°C時達(dá)到最大值（52%）；但隨著溫度的進(jìn)一步升高，螯合率反而下降?？梢钥闯觯瑴囟冗m當(dāng)提高，可能使NOG-1H的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步舒展，反應(yīng)液中各分子的運(yùn)動加劇，促進(jìn)了NOG-1H與亞鐵離子的螯合；而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時，維系亞鐵離子價(jià)態(tài)穩(wěn)定的重要物質(zhì)維生素C被破壞[10，12]，使Fe2+被氧化為Fe3+，螯合率下降。

圖2 溫度對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響Fig.2 Effect of temperature on ferrous-chelating rate of NOG-1H

2.4 不同pH值對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響

pH值對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響見圖3。

圖3 pH值對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響Fig.3 Effect of pH on ferrous-chelating rate of NOG-1H

圖3中結(jié)果表明，NOG-1H在pH2.0時對Fe2+的螯合率最高；當(dāng)pH 4.0時，NOG-1H對亞鐵離子的螯合率最?。辉趐H6.0～pH10.0時，隨pH值增大，NOG-1H與亞鐵離子的螯合率略有下降。其原因可能有兩個：1）pH值變化對NOG-1H溶解度的影響；2）pH值對反應(yīng)體系重要穩(wěn)定劑VC的影響。NOG-1H為稀酸溶解蛋白，因此在pH2.0時其溶解性較高，有更多的蛋白質(zhì)分子參與對亞鐵離子的螯合反應(yīng)中，表現(xiàn)出更高的螯合率；而在pH 4.0，接近其等電點(diǎn)，溶解度最小，反應(yīng)體系中參與螯合的蛋白質(zhì)分子最少，表現(xiàn)出最低的螯合率；而在pH6.0～pH10.0時，隨pH值增大，NOG-1H的溶解度也會逐漸下降，降低了NOG-1H的螯合能力。同時，VC在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，而高pH值會使其降低或喪失維系亞鐵離子穩(wěn)定的能力[10，12-13]，從而使NOG-1H的螯合能力下降。

2.5 不同亞鐵離子濃度對NOG-1H螯合率的影響

亞鐵離子濃度對NOG-1H螯合率的影響如圖4所示。

圖4 不同亞鐵離子濃度下NOG-1H的螯合率Fig.4 Effect of ion concentration on ferrous-chelating rate of NOG-1H

圖4中結(jié)果顯示，亞鐵離子濃度在0.25 mg/mL～1.25 mg/mL，NOG-1H的螯合能力隨亞鐵離子濃度增大而升高；亞鐵離子濃度進(jìn)一步增加，NOG-1H的螯合能力反而下降。濃度增加，意味著更多的亞鐵離子加入反應(yīng)體系而被NOG-1H所螯合；而當(dāng)濃度增大到一定程度時，多肽結(jié)構(gòu)中的螯合位點(diǎn)趨于飽和，螯合率相對下降[11，14]。本試驗(yàn)螯合體系中，VC主要用來發(fā)揮抗氧化性，使亞鐵離子避免被氧化為三價(jià)鐵離子（Fe3+）。在VC濃度一定時，過量亞鐵離子的加入意味著反應(yīng)體系中沒有足夠VC來維持其亞鐵離子狀態(tài)，這會導(dǎo)致Fe3+的增加，并使反應(yīng)體系的pH值升高，降低VC的活性，最終降低螯合率[12-13]。

2.6 不同時間對NOG-1H螯合率的影響

時間對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響如圖5所示。

圖5 時間對NOG-1H亞鐵離子螯合率的影響Fig.5 Effect of time on ferrous-chelating rate of NOG-1H

由圖5可知，時間從30 min到90 min，NOG-1H對亞鐵離子的螯合率從32%上升至56%；在90 min～150 min內(nèi)，NOG-1H的螯合率隨時間延長而逐漸下降。部分原來被絡(luò)合在多肽結(jié)構(gòu)中的亞鐵離子可能由于體系pH值的變化或螯合物穩(wěn)定性較差而被釋放到多肽結(jié)構(gòu)外部，重新成為游離狀態(tài)，最終使螯合率降低[12]。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，水解度、溫度、pH值等因素可以顯著影響NOG-1H的螯合能力。當(dāng)螯合時間為90 min，pH 2.0、溫度為30℃、亞鐵離子濃度為1.25 mg/mL時，NOG-1H的亞鐵離子螯合率均較高。在蛋白質(zhì)多肽與亞鐵離子的螯合反應(yīng)中，決定螯合率的主要因素是多肽鏈的氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)。特殊的氨基酸基團(tuán)如谷氨酸、谷氨酰胺和組氨酸等，由于含有較多的羧基、亞氨基，可以與亞鐵離子形成氫鍵或化學(xué)鍵，表現(xiàn)出更高的螯合能力；同時，更加舒展的肽鏈結(jié)構(gòu)，也意味著更多的活性基團(tuán)被暴露，更多的亞鐵離子可能被螯合[14-15]。此外，亞鐵離子的價(jià)態(tài)是否穩(wěn)定也是影響螯合率的重要因素。例如，VC具有還原性，可以使Fe2+不被氧化而保持在二價(jià)狀態(tài)。溫度、pH值等外部因素可以通過影響蛋白質(zhì)在反應(yīng)體系中的濃度、溶解度甚至結(jié)合位點(diǎn)的空間構(gòu)象來影響其螯合能力。值得注意的是，在螯合反應(yīng)中，維系Fe2+十分重要，pH值等外部因素可以通過改變穩(wěn)定劑——VC的活性來影響螯合率。