炎癥微環(huán)境下低強(qiáng)度高頻振動對牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響

白坤宏 向婷 趙敏越 卜雯卿 程政 王菲

[關(guān)鍵詞]炎癥環(huán)境;振動;牙周膜干細(xì)胞;成骨分化;牙周病;蛋白水平

牙周病是我國發(fā)病率最高的口腔慢性疾病之一，長期的牙周病可以造成牙周支持組織的損傷、缺失，包括牙齦紅腫出血、牙齦退縮、牙槽骨吸收等，最終導(dǎo)致牙齒松動、脫落[1]。牙周支持組織的自身修復(fù)能力較弱，并且持續(xù)處于炎癥微環(huán)境之中，使得喪失的牙周支持組織難以再生。牙周組織工程技術(shù)為牙周缺損開辟了新的治療途徑。牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）相較其他干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的牙槽骨、牙周韌帶重建能力，被認(rèn)為是最理想的牙周組織工程種子細(xì)胞[2]。

低強(qiáng)度高頻振動（Low magnitude high frequencyvibration，LMHFV）是一種新穎的機(jī)械力學(xué)輔助療法，以其非藥物性、非侵入性的優(yōu)勢，被應(yīng)用于肥胖、骨質(zhì)疏松、肌肉疲勞、骨折等疾病的臨床研究與康復(fù)治療之中，并且取得了不錯的效果[ 3 - 5 ];在干細(xì)胞研究領(lǐng)域也有學(xué)者證實(shí)LMHFV對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone m a r r o wmesenchymal stem cells，BMSCs）、PDLSCs的增殖、分化有相應(yīng)的作用[6-7]。目前尚無LMHFV在炎性條件下對PDLSCs成骨性能影響的相關(guān)報(bào)道，所以本課題組就LMHFV在炎性條件下對PDLSCs成骨分化能力的作用展開探索，為今后將LMHFV應(yīng)用于牙周組織工程技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：αMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國）;胎牛血清（Gibco，美國）;Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液（索萊寶，北京）;重組人TNF-α、重組人IL-1β（PeproTech，美國）;β甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、Trizol Regent（Invitrogen，美國）;PrimeScriptTM RT-PCR kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本）;Z45CT垂直振動機(jī)（廣州美亦豐試驗(yàn)設(shè)備有限公司）;CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo，美國）;RealTime PCR儀（Biosytems 7500，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養(yǎng)：選取年齡為12～18歲正畸治療需要拔除的前磨牙，用含1%三抗的PBS將離體牙牙根沖洗干凈，用解剖刀片搔刮牙根根中1/3獲得牙周膜碎片，離心后，在牙周膜沉淀中加入3mg/ml Ⅰ型膠原酶和4mg/ml中性蛋白酶各500μl，37℃消化30min。等體積含10%胎牛血清（FBS）的αMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000r/min離心5min，棄上清。加入含10% FBS的αMEM培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、5% CO2條件孵箱培養(yǎng)。原代細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測：取P3代的PDLSCs，以1×106個/毫升并移入1.5ml EP管，每管200μl;依次向EP管中加入2μl熒光標(biāo)記的抗體（CD34、CD45、CD90、CD146、STRO-1），4℃避光孵育1h，PBS沖洗3次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.2.3 構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境與體外LMHFV模型：通過參考同研究領(lǐng)域?qū)W者的實(shí)驗(yàn)方法[8-9]，選擇在常規(guī)培養(yǎng)液（含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液）中添加TNF-α（10ng/ml）與I L - 1 β （ 5 n g / m l ） 配制成炎性培養(yǎng)液， 以此構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境。采用廣州美亦豐Z 4 5 C T 垂直振動機(jī)（見圖1），該裝置由控制臺與振動臺構(gòu)成，可以產(chǎn)生5～500Hz正弦振動波。進(jìn)行細(xì)胞加力實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過控制臺設(shè)置振動參數(shù)，將細(xì)胞培養(yǎng)板固定于振動臺，進(jìn)行細(xì)胞加力。根據(jù)本課題組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整振動參數(shù)為：加速度=0.3g，頻率=40Hz，時(shí)間=15min/d時(shí)，P D L S C s 的成骨分化能力提高最為明顯（ 見圖2 ） ， 因此選擇這一參數(shù)構(gòu)建LMHFV環(huán)境。實(shí)驗(yàn)分組：Control組（0 H z，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)）;LMHFV組（40Hz，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)）;Inflammation Microenvironment（IM）組（0Hz，炎性培養(yǎng)液培養(yǎng)）;IM+LMHFV組（40Hz，炎性培養(yǎng)液培養(yǎng)）。

1.2.4 Rea l t i m e RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá);取第4代細(xì)胞，以1×105個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞匯合至6 0 %，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組更換成骨誘導(dǎo)液（含10% F B S 的α-MEM培養(yǎng)基，加β甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸5 0 g / m l、地塞米松1×1 0 m o l / L）進(jìn)行成骨誘導(dǎo);炎性成骨培養(yǎng)液需在常規(guī)成骨培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加1 0 n g / m lT N F - α 與5 n g / m l IL-1β）。換液后2h將6孔板固定于Z45CT垂直振動機(jī)振動臺上，根據(jù)分組設(shè)置振動參數(shù)，每組均加力15min/d（0Hz組在振動臺上靜置15min/d），連續(xù)加力7d;期間每3d換液，每次2ml;在最后一次振動結(jié)束后2h終止培養(yǎng)，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA;控制RNA濃度在300～500ng/μl，A260/A280為1.8～2.0。使用PrimeScriptTM RT-PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用Syber Green熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR檢測。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1所示。

1.2.5 Western-Blot檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)：取P4代的PDLSCs，以1×105個/孔接種于6孔板，待PDLSCs匯合至70%左右，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組更換成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo);換液后2h將6孔板固定于Z45CT垂直振動機(jī)振動臺上，根據(jù)分組設(shè)置振動參數(shù)，每組均加力15min/d（0Hz組在振動臺上靜置15min/d），連續(xù)加力7d;期間每3d換液，每次2ml;在最后一次加力后12h終止培養(yǎng)，提取總蛋白，經(jīng)BAC蛋白定量試劑盒對樣品進(jìn)行檢測定量，按30μg/20μl體系加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10min，置于-80℃冰箱待用。制備SDS-PAGE膠，依照蛋白分子量大小進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，洗膜后加入一抗，4℃靜置過夜。次日洗膜后加入二抗，于室溫?fù)u床孵育2h，洗膜后于暗室中將ECL熒光劑均勻浸濕膜表面，最后進(jìn)行顯影定影及曝光。

1.2.6 茜素紅染色檢測：連續(xù)加載LMHFV并成骨誘導(dǎo)21d進(jìn)行茜素紅染色（茜素紅染液：1g茜素紅溶于100ml蒸餾水，pH=4.3），棄6孔板培養(yǎng)液，蒸餾水沖洗2遍，60%異丙醇固定，茜素紅染液染色5min，蒸餾水沖洗，觀察并采用酶標(biāo)儀檢測450nm波長的吸光度（A）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P <0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物鑒定：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，PDLSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD146、STRO-1，陰性表達(dá)造血系來源細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45。見圖3。

2.2 成骨相關(guān)基因表達(dá)情況：Realtime RT-PCR結(jié)果顯示：與IM組相比，IM+LMHFV組的RUNX-2、ALP、COL-1相對表達(dá)量均有上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而OCN的相對表達(dá)量雖然有升高趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）;上述兩組與Control組相比，成骨基因相對表達(dá)量均有明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見圖4。

2.3 成骨相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果：Western-blot結(jié)果表明：與IM組相比，IM+LMHFV組ALP、COL-1、OCN的蛋白表達(dá)量均有提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;而RUNX-2雖然有增高的趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）;上述兩組與Control組相比，成骨標(biāo)志物的蛋白表達(dá)量均有顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見圖5。

2.4 茜素紅染色結(jié)果：I M組幾乎觀察不到有鈣結(jié)節(jié)生成， 而I M + L M H F V 組有少量紅染的鈣結(jié)節(jié); 與C o n t r o l組比較， I M 組和I M + L M H F V 組的鈣結(jié)節(jié)生成量顯著減少;通過對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，提示IM+LMHFV組細(xì)胞基質(zhì)鈣含量較IM有所增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見圖6。

3 討論

慢性牙周炎患者接受牙周基礎(chǔ)治療之后炎癥反應(yīng)雖然得到控制，但是缺損區(qū)域的牙周組織仍然處于炎癥微環(huán)境之中，并且相較健康人群，這些患者對牙周致病菌具有更強(qiáng)的易感性，炎癥反復(fù)幾率大大增加，而炎性環(huán)境會削弱牙周各組織的修復(fù)再生能力。根據(jù)慢性牙周炎的形成機(jī)制，學(xué)者們主要通過三種方法在體外模擬牙周炎癥微環(huán)境，即：培養(yǎng)液中添加Pg.LPS[10-11]、培養(yǎng)液中添加炎性細(xì)胞因子[9，12]、直接從牙周病離體牙的牙根獲取炎性來源牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs from periodontitis tissue，pPDLSCs）[13]。Park等[14]的研究已證實(shí)pPDLSCs與健康組織來源的牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs from healthy periodontaltissue，hPDLSCs）相比表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)刺激后的細(xì)胞特性的變化，包括增殖、多向分化等能力的改變;但是提供pPDLSCs的志愿者年齡一般較大，并且?guī)缀醪荒芡瑫r(shí)提供hPDLSCs，這影響了實(shí)驗(yàn)的可行性;如果使用不同年齡、不同個體來源的兩種PDLSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，又增加了實(shí)驗(yàn)的干擾因素，所以這種體外炎癥模型的構(gòu)建方法還存在爭議。通過應(yīng)用Pg.LPS模擬炎癥模型也是常用的體外建模方法，其效果獲得一些學(xué)者的認(rèn)可，但是受到Pg.LPS刺激后所產(chǎn)生的細(xì)胞反應(yīng)十分復(fù)雜，涉及到的信號通路較多，這可能會影響到實(shí)驗(yàn)后續(xù)的機(jī)械力學(xué)刺激。IL-1β與TNF-α是牙周病進(jìn)展過程中發(fā)揮主要作用的炎癥介質(zhì)，兩者均會促進(jìn)膠原酶等基質(zhì)溶解酶的分泌，加速牙周纖維組織降解，造成附著喪失;與此同時(shí)IL-1β與TNF-α還是破骨細(xì)胞增殖、活化的刺激因子，可以激活破骨細(xì)胞，造成牙槽骨吸收;所以本實(shí)驗(yàn)選用IL-1β與TNF-α構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境，旨在更為準(zhǔn)確地模擬牙周炎癥反應(yīng)。

LMHFV已經(jīng)被證實(shí)可以提高BMSCs的成骨分化能力[15]，而且在本實(shí)驗(yàn)前期的研究當(dāng)中也證實(shí)其可以促進(jìn)PDLSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)，但尚未有報(bào)道證實(shí)在炎性條件下LMHFV是否會增強(qiáng)或阻礙PDLSCs的成骨分化能力。因此，本實(shí)驗(yàn)通過炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α模擬體外炎癥微環(huán)境，并應(yīng)用前期實(shí)驗(yàn)摸索的最適振動參數(shù)對PDLSCs施加LMHFV刺激，探究炎性條件下LMHFV對PDLSCs成骨分化能力的作用。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（runt-related transcriptionfactor-2，RUNX-2）是Runt（Runt domain）轉(zhuǎn)錄因子家族中的一份子，是骨組織成熟過程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子[16]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是骨組織形成、代謝過程中重要的礦化調(diào)節(jié)物，其主要的作用是在骨形成過程中水解磷酸酯和破壞礦化阻斷劑從而促進(jìn)基質(zhì)礦化反應(yīng)，并且ALP可同時(shí)作為鈣結(jié)合蛋白和磷酸基轉(zhuǎn)運(yùn)子促進(jìn)礦化[17-18]。Ⅰ型膠原（Collagen typeⅠ，COL-1）是人和動物體內(nèi)骨組織與纖維組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在礦化的骨組織中COL-1是僅有的膠原成分，具有維持骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用;并且有研究證實(shí)COL-1可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[19-20]。骨鈣素（Osteocalcin，OCN）是一種非膠原蛋白，只有分化成熟的成骨細(xì)胞可以特異性的合成并分泌OCN。本實(shí)驗(yàn)在炎癥微環(huán)境下對PDLSCs施加LMHFV刺激，7d后通過Realtime RT-PCR與Western-blot對成骨相關(guān)標(biāo)志物RUNX-2、ALP、COL-1、OCN的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果均表明LMHFV能夠在炎性條件下增強(qiáng)PDLSCs的成骨分化能力。這一結(jié)果與Kim等的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，該實(shí)驗(yàn)對Balb/C小鼠注射LPS建立炎癥骨吸收動物模型，并讓其中一部分小鼠接受全身振動刺激（加速度=0.4g，頻率=45Hz），結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受振動刺激小鼠的脛骨、腓骨的骨量與骨密度明顯高于單純注射LPS的小鼠;在進(jìn)行機(jī)制研究時(shí)還發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的炎性環(huán)境下，微振動可以降低BMSCs對破骨相關(guān)基因IL-1β、TNF-α以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage Colony stimulating Factor，M-CSF）的表達(dá)[21]。茜素紅染色結(jié)果顯示：炎癥微環(huán)境下LMHFV刺激后PDLSCs生成的鈣結(jié)節(jié)略有增多;而對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析后發(fā)現(xiàn)，炎癥微環(huán)境下LMHFV并未顯著增加PDLSCs的鈣結(jié)節(jié)合成量，僅有略微增多的趨勢。茜素紅染色的結(jié)果與染液的pH值、細(xì)胞固定的時(shí)間、水化的時(shí)間等因素均有關(guān)聯(lián)，其中任何一項(xiàng)的偏差均會影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因此成骨染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

炎性條件下，PDLSCs的多向分化潛能受到影響，成骨分化能力會遭到抑制。在本實(shí)驗(yàn)中，炎癥微環(huán)境下培養(yǎng)的PDLSCs成骨相關(guān)標(biāo)志物的檢測結(jié)果相較常規(guī)培養(yǎng)者均有顯著降低;雖然經(jīng)過LMHFV刺激后，成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)量會有不同程度的升高，但是與常規(guī)培養(yǎng)者相比，RUNX-2、ALP、COL-1、OCN的表達(dá)仍然不及正常培養(yǎng)的PDLSCs，茜素紅染色的結(jié)果與此相一致。這一結(jié)果與Kim等的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也接近，雖然微振動刺激可以修復(fù)LPS造成的骨量和骨密度降低，但相較空白對照組的小鼠仍有明顯不足。這說明，在炎癥微環(huán)境下LMHFV刺激雖然可以一定程度上提高PDLSCs的成骨分化能力，但是并不能完全抵消炎癥對成骨分化的抑制作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)著重探討了炎癥微環(huán)境下LMHFV對牙周組織工程種子細(xì)胞成骨分化能力的影響，這只是將LMHFV應(yīng)用于牙周組織工程的最初期探索，在后續(xù)的動物實(shí)驗(yàn)中，還需要研究不同的生物支架材料對振動的傳導(dǎo)性，以及LMHFV是否會使生物支架材料自身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。此外，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，牙周炎癥環(huán)境周圍可能會有破骨細(xì)胞的存在，而LMHFV對破骨細(xì)胞的作用尚未可知，也需要開展相關(guān)的研究。而且生物支架材料包裹種子細(xì)胞植入動物體內(nèi)后，PDLSCs受到的振動頻率、振幅等可能會與局部振動裝置的參數(shù)不同，所以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的振動參數(shù)包括加速度、頻率、時(shí)間等均需要進(jìn)一步探索。