動物源生物活性肽研究進展

王 爽，劉雪松，徐 馨，吳 憲，張鵬宇，陳 曦，李 莉，江波濤

(黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

生物活性肽(Bioactive peptides，BAP)是一類具有生物學活性、能夠對機體產生一定影響的肽[1]。早期研究認為，蛋白質的消化需要經過消化道各種酶類的水解，從而形成大量的氨基酸而被機體吸收利用。但是，隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)以氨基酸的形式進行吸收只是蛋白質的吸收方式之一，更多的則是以短肽的方式被吸收。因短肽可以直接對生命活動進行調控，其吸收方式要優(yōu)于蛋白質及氨基酸[2]。生物活性肽一般為2～5個氨基酸合成的短肽，也有10～50個氨基酸組成的多肽，隨著研究的深入，開發(fā)了許多具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗疲勞以及免疫調節(jié)等功能的生物活性肽，對機體健康具有良好的調控作用。生物活性肽的來源較為廣泛，包括了動物源以及植物源等。其中動物源的生物活性肽占據(jù)了重要的地位。動物源的生物活性肽一般來自于動物的肉類、血液以及組織等。因動物源的生物活性肽來源較為廣泛、性價比較高，得到了市場的廣泛認可。

1 生物活性肽的提取

1.1 酶解 酶解一般是從動物的血液、蛋、奶以及不同組織中提取生物活性肽的第一步。在蛋白質的氨基酸長鏈中，存在著一些不具備生物活性肽的多肽片段。經過酶解后，許多具有生物學活性的肽才能被釋放出來，發(fā)揮功能[5]。常用的酶包括了胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及木瓜蛋白酶等[6]。一般通過蛋白酶的水解作用，可將蛋白質中的長鏈變?yōu)槎替湣＝涍^水解后的蛋白水解液，相比未經過水解的蛋白質，蛋白條帶會顯著減少，且蛋白大小會顯著下降[7]。相比較于其他的提取方法，酶解具有價格便宜、化學試劑以及毒性物質殘留少的優(yōu)點被廣泛使用在生物活性肽保健品的制備工藝中[8]。Young等通過利用酶解技術從大眼金槍魚的肌肉中提取到了一種抗氧化的活性肽，通過試驗發(fā)現(xiàn)提取的生物活性肽具有優(yōu)良的抗氧化活性[9]。柳慧琴通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復合酶解牛脊髓后，得到了抗氧化的牛脊髓肽[1]。馬利華等采用木瓜蛋白酶和中興蛋白酶的復合酶解方法，從鴨血中分離出來具有優(yōu)良效果的抗氧化肽[10]。酶解因其多種優(yōu)點，被廣泛應用于生物活性肽的制備。

1.2 超濾 超濾是一種壓力驅動的膜分離技術，通過超濾膜的表面微孔截流住大分子的溶質，而小分子的物質可順利通過微孔[11]。通過超濾技術，可以對分子量不同大小的肽進行分離，從而確定不同分子量大小的肽的生物學特性。超濾在超濾膜的使用期限內，可實現(xiàn)長時間穩(wěn)定的分離。在大規(guī)模的制備時，經常使用超濾膜。而在實驗室的試驗階段，可以使用超濾管進行替代；超濾在生物活性肽的制備上應用也較為廣泛。崔學超等采用超濾方法分離鹿血抗氧化肽提取液，得到了4種不同分子質量的鹿血抗氧化肽，通過不同肽段氧化自由基清除能力的測定，得出了分子量小于3 kD的肽段抗氧化性最強[12]。Nadalian等通過超濾的方法從肉雞的雞皮中獲得了一種抗氧化肽，并確認具有良好的自由基清除能力[13]。葉孟亮通過對酶解后的牦牛骨膠原蛋白進行超濾，發(fā)現(xiàn)小于3 kD的組分表現(xiàn)出了較高的促成骨細胞增殖活性[14]。在一般情況下，超濾是為酶解后得到的肽段進行純化的方法?？捎行⒚附夂蟮碾陌凑辗肿恿看笮∵M行分離，被廣泛應用在生物活性肽的純化中。

1.3 凝膠色譜 凝膠色譜法的原理是凝膠能夠形成網狀結構，根據(jù)樣品的分子量以及形狀差異，在網狀結構中儲備的時間不同，進而達到分離的目的[15]。凝膠具有分子篩的作用，不同的組分因分子粒徑的不同，移動路程與洗脫時間不同而得到分離，從而可進行多肽相對分子量的分布以及分級分析[16]。凝膠色譜具有條件溫和、樣品破壞性小、分離效果好等優(yōu)點，但單獨使用往往效果不佳，常與其他分離純化方法聯(lián)合使用。凝膠色譜法中常用的添料為葡聚糖Sephadex G-25、Sephadex G-15以及大孔樹脂等[17]。石菊芬通過凝膠色譜技術將羊胎盤胎通過葡聚糖Sephadex G-15分離后得到了4個組分，經過鑒定后F-2組分的抗氧化能力最強[18]。曾珍等通過凝膠色譜技術利用葡聚糖Sephadex G-25對豬骨中的肽進行了分離純化，得到了豬骨源的免疫活性肽[19]。宋曉光等利用DA201-C大孔樹脂對水蛭活性肽進行了純化，發(fā)現(xiàn)其純化效果優(yōu)良[20]。周自福采用DA201-C大孔樹脂對牡蠣水解物進行凝膠層析，從而獲得了具有抗高血壓的牡蠣生物活性肽[21]。

1.4 反相液相色譜 反相液相色譜法(RP-HPLC)是分離多肽的一種常用方法，其原理是利用多肽分子的疏溶劑或者疏水作用，非極性或弱極性的多肽分子會與非極性的固定相相結合，而這種結合會由于流動相的變化而發(fā)生下降，進而使溶質分子被洗脫分離[22]。液相色譜分為分析液相和制備液相，對生物活性肽進行分離的為制備液相。與凝膠色譜技術一樣，反相液相色譜技術多與其他的技術相結合用于生物活性肽的分離與純化。葉孟亮通過反相液相色譜技術對牦牛骨膠原蛋白肽進行了進一步的純化，獲得了較強的骨細胞增殖活性的肽[15]。劉東陽用反相液相色譜技術對馬鮫魚源的生物活性肽進行純化，得到了抗氧化活性優(yōu)良的活性肽[23]。

1.5 其他方法 除以上方法外，也有一些方法能夠對生物活性肽進行分離純化，如親和層析、雙水相萃取技術以及毛細管電泳等技術。但這些方法因對實驗室設備要求較高以及操作復雜等問題，在生物活性肽的分離純化技術中使用相對較少。

2 結構鑒定

2.1 電泳法 電泳技術是利用多肽的相對分子質量以及等電點的不同對其鑒定的方法，其中，最常用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳法操作簡單、速度快，可以迅速地了解制備的肽的大致信息，但電泳法只能了解肽的相對分子質量以及等電點，無法了解其具體序列[27]。劉麗君通過SDS-PAGE技術確定了酶解后的小于3 kD的駱血生物活性肽具有良好的抗氧化活性[11]。柳慧琴通過SDS-PAGE技術確定了牛脊髓蛋白分子集中分布在了18.5 kD，為接下來的牛脊髓源生物活性肽的分離與制備提供了依據(jù)[1]。電泳技術多用于生物活性肽結構鑒定的第一步，是了解生物活性肽結構的最基礎的一種方法。

2.2 質譜法 質譜法(Mass spectrommetry，MS)是利用質譜儀器將肽轟擊成離子和離子碎片，然后按照質荷比的不同對成分以及結構分析的方法。其中包括了電噴霧電離質譜法(ESI-MS)、基質輔助激光解析電離質譜法(MALDI-MS)以及四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(Q-Exactive)等[28,29]。馬志鷹通過ESI-MS/MS對駝血源降血壓以及降血脂肽進行了測序，確定了其分離純化的生物活性肽的氨基酸序列[30]。張寶林對馬鮫魚魚骨源的降血脂生物活性肽進行了質譜分析，確定了該種肽的氨基酸序列[31]。Wang等利用Q-Exactive質譜技術對鯖魚源生物活性肽進行了分析，確定了具有抗氧化活性肽的具體序列[32]。

2.3 其他方法 對于生物活性肽的結構鑒定常用以上的兩種方法，但是也有一些其他的方法可以進行生物活性肽的結構鑒定，其中包括了紫外/紅外光譜法、核磁共振法以及圓二色譜法等。此類方法除了可以對生物活性肽的氨基酸進行測序以外，也可以對活性肽的二級結構進行測定[16]。

3 功 能

3.1 抗氧化 機體內脂質和蛋白質的氧化可以產生自由基，如果機體內的自由基過多，可能會對蛋白質以及DNA進行破壞，從而引發(fā)疾病[33]。研究表明，體內自由基過多會引發(fā)糖尿病、癌癥以及癡呆等疾病。控制體內自由基在一個穩(wěn)定的數(shù)量對機體的健康具有重要意義[34]。抗氧化生物活性肽可有效清除自由基?？寡趸纳锘钚噪膩碓摧^為廣泛，其中以動物來源較多[35]。一般采用體外化學法驗證提取的活性肽抗氧化活性，其中包括了DPPH自由基清除測定、ABTS自由基清除測定、超氧陰離子自由基清除、羥自由基清除率以及亞鐵離子螯合能力的測定。劉麗君從駝血中分離純化出了具有抗氧化能力的生物活性肽，并通過了DPPH自由基清除試驗以及亞鐵離子螯合試驗驗證了其抗氧化活性[11]。崔雪超等從鹿血中分離出了具有抗氧化的生物活性肽，并通過亞鐵還原能力以及DPPH自由基清除測定等方式，驗證了該種肽的抗氧化能力[12]。

3.2 降血壓 高血壓是常見的慢性疾病，其可以增加心臟病以及中風等疾病的幾率。血管緊張素Ⅰ轉化酶(ACE，EC 3.4.1.5.1)在血壓調節(jié)系統(tǒng)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)中起著重要作用[38]。在RAS中，ACE將血管緊張素Ⅰ裂解為有活性的血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ可以通過血管收縮進而引發(fā)高血壓。在KKS中，ACE在激肽酶的C末端連續(xù)切割兩個氨基酸，導致該血管擴張劑失效。因此，具有ACE抑制活性的生物活性肽可通過降低血管緊張素Ⅱ水平或者增加激肽水平來降低血壓[39]。對于抑制ACE活性肽的考察方法分為體外和體內兩種。體外法最常用的就是測定馬尿酸法，它是基于ACE酶與底物馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(HHL)之間的反映生成馬尿酸的原理，ACE活性與馬尿酸的生成量直接相關，直接通過測定馬尿酸的含量，從而評估ACE的抑制程度[40]。體內試驗是使用動物模型的方式來驗證對ACE抑制的活性。原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和人體高血壓有著相近的病例癥狀，一般用這個動物模型來進行體內的ACE抑制活性考察[41]。馬志鷹在駝血中分離純化出了降血壓活性肽，并通過液相色譜測定馬尿酸含量的方法對其所具有的抑制ACE活性進行考察[30]。張可佳在牡蠣中分離出了ACE抑制肽，并利用了SHR模型驗證了該種肽抑制ACE的活性[42]。

3.3 降血脂 血液中的脂質包括了乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。如果血液中任何一種脂質成分非正常升高，則可能是高脂血癥的前兆[30]。經過流行病學調查以及臨床試驗等都發(fā)現(xiàn)了高脂血癥與心臟疾病的發(fā)生關系緊密。維持血脂含量在一個正常水平對于預防心臟疾病有著重要意義?，F(xiàn)階段，市場上出現(xiàn)的降血脂藥物，價格昂貴并且有可能引發(fā)多種副作用。因此，研究人員逐漸研究開發(fā)降血脂的生物活性肽。對具有降血脂的生物活性肽活性的考察多使用的方法是HMG-CoA還原酶抑制方法。HMG-CoA還原酶是體內催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成二羥甲基戊酸(MVA)的關鍵酶，這一步是體內合成膽固醇的限速步驟，也是目前最主要的高血脂癥臨床藥物的靶點[43]。楊玉英從蠶蛹中分離純化了具有降血脂活性的生物活性肽，并通過HMG-CoA還原酶抑制方法驗證了其降血脂功能[44]。江錕等從鱸魚中分離出了具有降血脂活性的肽，并通過體外試驗驗證了其降血脂活性[45]。

3.4 免疫調節(jié) 免疫活性肽可以調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，調節(jié)自身免疫力，刺激機體的淋巴細胞增殖能力和吞噬細胞的吞噬活性，提高機體對外源有害物質和自身產生的老化凋亡細胞的抵抗清除能力[46]。根據(jù)免疫細胞的分類，免疫調節(jié)肽對免疫細胞的影響可以分為淋巴細胞、吞噬細胞、K淋巴細胞以及NK淋巴細胞。免疫調節(jié)肽也可以對多種細胞因子起作用，其主要調節(jié)TNF-α、IL-10、IL-2以及IL-6等細胞因子的分泌，達到對局部吞噬細胞的調節(jié)作用，從而發(fā)揮其免疫調節(jié)功能。付勱從雞胚中分離出具有免疫調節(jié)作用的活性肽，并且將小鼠巨噬細胞RAW264.7給予活性肽驗證其免疫調節(jié)活性，得出雞胚活性肽具有良好的免疫調節(jié)能力[47]。張東東對中國林蛙皮膚抗菌肽體內免疫調節(jié)作用進行了研究，得出了源于中國林蛙皮膚分泌物的抗菌肽Temproin-CEa和chensinin-1b具有良好的免疫調節(jié)活性[48]。

3.5 其他 除了上述種類的生物活性肽以外，還有抗疲勞肽、降糖肽、神經活性肽、酶調節(jié)及抑制肽以及抗菌肽等。這些肽都能對維持機體健康起到良好的作用。

4 小結與展望

生物活性肽是近些年來研究較為熱門的一個領域，由于其擁有著豐富的功能被廣大研究者們以及市場所接受。動物源生物活性肽對維持機體的穩(wěn)定與健康發(fā)揮著重要的作用。從動物血、骨頭、皮膚以及不同的臟器中分離出來的生物活性肽具有良好的功能，并且具有安全以及高效的優(yōu)點。因此，在食品行業(yè)、養(yǎng)殖行業(yè)以及化妝品行業(yè)中得到了廣泛應用。目前，動物源生物活性肽的研究還有一些不足之處，如大多數(shù)生物活性肽為多肽混合物，未能夠徹底進行分離與純化，相應的機理研究不全，以及相應產品轉化率較低等問題。應針對以上問題開展深入研究，向著高效、快速以及全面的方向發(fā)展，為動物源生物活性肽的研究提供新思路以及新的方向，為維持機體健康提供更多優(yōu)良的產品。