脊髓損傷對血-脊髓屏障水代謝機制的影響

郭鐵峰 鄧強 杜凱然 柳樹英 張彥軍 楊志華 李中鋒 楊鎮(zhèn)源 彭冉東 李軍杰 徐浩軍

(1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué))

脊髓損傷(SCI)是脊柱外科常見的嚴重疾病之一,屬中醫(yī)學(xué)外傷瘀血所致“腰痛”“痿證”“癃閉”等范疇，常伴隨損傷節(jié)斷以下肢體功能障礙，是國內(nèi)外脊柱外科領(lǐng)域亟待解決的重大醫(yī)學(xué)問題之一。繼發(fā)性SCI(SSCI)為傷后幾小時至幾天發(fā)生的一系列激活的自身破壞過程，所產(chǎn)生的脊髓損害并不亞于原發(fā)損傷，對繼發(fā)性損傷的預(yù)防及治療，往往決定了后期脊髓神經(jīng)再生及功能的恢復(fù)與重建，而“血-脊髓屏障”(BSCB)損害所引起的水腫、椎管內(nèi)壓力增高，組織灌注降低則是繼發(fā)性損傷中最主要的病理過程，所以在SSCI早期保護BSCB功能、逆轉(zhuǎn)脊髓水腫對SCI預(yù)后具有重要的意義。隨著該病診療發(fā)展的需要，SSCI防治的相關(guān)研究仍存在亟待解決的關(guān)鍵問題：①目前研究尚不能完全闡述SSCI中BSCB功能異常的分子生物學(xué)機制，以致在該病治療方面缺乏明確的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)；②激素沖擊療法作為SSCI主要治療手段之一，但常引起一過性高血壓、高血糖、心動過速、電解質(zhì)紊亂、嚴重感染、甚至死亡等嚴重并發(fā)癥，臨床應(yīng)用具有一定局限性。因此，研究并闡明SSCI中BBSC功能異常的相關(guān)基因調(diào)控機制，并尋找一種有效、快速且不良反應(yīng)低的治療方法一直是脊柱外科領(lǐng)域的研究熱點之一。本文就SCI對BSCB水代謝機制影響研究進行綜述。

1 SSCI中BSCB水代謝異常機理

SCI通常與BSCB破壞具有直接關(guān)系，導(dǎo)致血管源性脊髓水腫，主要是細胞外空間過量的水積累〔1〕。SCI分為原發(fā)性SCI和SSCI。其中，SSCI 產(chǎn)生的一系列繼發(fā)性損害，大多由于損傷節(jié)段缺血缺氧，BSCB連續(xù)毛細血管內(nèi)皮炎性改變，通透性增加等原因所引起，包括水腫、炎性反應(yīng)、局部缺血-再灌注損傷、Ca2+溢出及過氧化基團等，這些異常變化會進一步加重原發(fā)病灶周圍神經(jīng)組織的破壞性病變，導(dǎo)致神經(jīng)功能損害持續(xù)發(fā)展并加重，其對脊髓的破壞遠遠超過了原發(fā)性損傷，繼發(fā)性損害的程度直接決定該病預(yù)后。繼發(fā)性損害的病理改變主要是以血管源性水腫與細胞毒性水腫為基礎(chǔ)發(fā)展而來。在急性損傷發(fā)生后，BSCB中連續(xù)性毛細血管內(nèi)皮損壞，內(nèi)皮細胞間隙增寬，血管壁連接松散〔2〕，多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物所帶的負電荷短暫消失，血管外炎癥因子、血漿蛋白逐漸進入脊髓實質(zhì)聚集，引起水腫并加重炎性改變〔3〕。另一方面，創(chuàng)傷所致脊髓微循環(huán)障礙，使損傷節(jié)段缺血缺氧不斷加重，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞營養(yǎng)供給受到抑制，腺苷三磷酸(ATP)合成減少，細胞離子轉(zhuǎn)運受到抑制，細胞內(nèi)滲透壓異常改變，大量組織液進入神經(jīng)細胞內(nèi)，細胞腫大，即出現(xiàn)細胞毒性水腫，水腫導(dǎo)致細胞外間隙變狹窄，在電解質(zhì)異常的同時，進一步壓迫神經(jīng)組織，白質(zhì)水腫及低灌注將促進繼發(fā)組織壞死，此外，水腫致脊髓內(nèi)壓增高，加重髓內(nèi)微循環(huán)障礙，使組織因缺氧、缺血致液化壞死。所以，創(chuàng)傷后若不及時逆轉(zhuǎn)脊髓水腫，則有可能形成水腫-缺血的惡性循環(huán)，而 BSCB 對水調(diào)節(jié)功能的異常改變正是導(dǎo)致這一系列病理連鎖反應(yīng)的根本機制。

2 水通道蛋白(AQPs)在SCI中的表達

AQPs，又稱水孔蛋白，是細胞膜上內(nèi)在膜蛋白，屬于膜通道家族中的一類蛋白，是參與水分子跨膜運輸?shù)闹匾ǖ馈?〕。SCI發(fā)生后，AQP-1在星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元纖維、室管膜細胞表達迅速增加，持續(xù)表達上調(diào)可持續(xù)11個月，AQP-1長時間持續(xù)表達上調(diào)不僅會導(dǎo)致神經(jīng)元及軸突水腫而發(fā)生腫脹，而且會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞向損傷區(qū)域移動變相促使瘢痕組織形成〔5〕。國外有研究顯示，SCI后細胞中的AQP-9表達上調(diào)后可減少SCI對AQP-9的誘導(dǎo)，側(cè)面減少脊髓水腫，減少神經(jīng)元凋亡〔6〕。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)有3個AQPs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)表達較高，其中AQP-4隸屬于水通道家族，大量分布在腦-脊髓屏障的星形膠質(zhì)細胞之中，主要作用是水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運，在中樞神經(jīng)組織水分調(diào)節(jié)代謝方面發(fā)揮出至關(guān)重要的作用〔2〕。隨著對其研究的深入發(fā)現(xiàn)，SCI造成星形膠質(zhì)細胞膜上AQP-4的表達變化，是導(dǎo)致脊髓水腫及神經(jīng)細胞毒性水腫重要生物學(xué)機制之一。由此可見SCI后，AQP-4與SCI的病理機制密切相關(guān)，其最為重要的表達在星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、室管膜細胞及內(nèi)皮細胞〔7〕，在SCI整個病理機制的發(fā)展過程中起到重要作用。

3 BSCB調(diào)控水代謝的分子生物學(xué)機制

3.1AQP-4在SSCI中的表達 研究證實 SSCI 中 BSCB 損傷所致連續(xù)毛細血管內(nèi)皮及星形膠質(zhì)細胞胞膜上AQP-4的表達變化，是發(fā)生血管源性水腫、細胞毒性水腫的主要分子生物學(xué)機制之一。AQP-4 由美國科學(xué)家在1988年研究人類紅細胞時發(fā)現(xiàn)〔8〕。其作為調(diào)控水分子平衡的重要信號蛋白在 SSCI 脊髓水腫的形成和消退中起重要作用〔9〕。BSCB 與“血-腦屏障”相似，基本結(jié)構(gòu)包括毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接(TJ)、基膜、周細胞和星形膠質(zhì)細胞終足。AQP-4 主要在星形膠質(zhì)細胞上表達，分布于包繞血管周圍的星形膠質(zhì)細胞足突上，當(dāng)發(fā)生脊髓損傷時，其在與血管直接接觸的足突上呈極性分布，同時其也沿著神經(jīng)纖維網(wǎng)的突起廣泛分布，參與形成與腦脊液接觸的軟腦膜和室管膜表面屏障〔10〕，AQP-4 的極性分布主要是指其在毛細血管、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜等與星形膠質(zhì)細胞及其終足直接接觸的部位上具有高表達、高活性的特點，說明 AQP-4 作為膠質(zhì)細胞與腦脊液和血管間的水調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)運的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平衡中起了至關(guān)重要的作用〔11〕。研究認為〔12〕，AQP 參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)水腫的發(fā)生發(fā)展過程，在缺血再灌注損傷皮層區(qū)域的 AQP-4 表達增加，說明 AQP-4 在缺血導(dǎo)致的腦水腫中起重要作用，而在小鼠腦缺血模型中，AQP-4 敲除可使細胞毒性腦水腫減輕且神經(jīng)功能得到改善。 Li等〔13〕證實腦水腫的減輕伴隨著 AQP-4 表達下降，AQP-4 的表達與脊髓水腫呈正相關(guān)。在脊髓損傷后的急性水腫過程中，AQP-4 表達迅速升高〔14〕，損傷后1 d，出現(xiàn)血管源性水腫，AQP-4及其 mRNA 表達開始增加，3 d達高峰并出現(xiàn)細胞毒性水腫〔15〕。此外，鈉鉀泵作用于 AQP-4的K27和W30位點，病理狀態(tài)下鈉鉀泵的失調(diào)對 AQP-4的水通透性產(chǎn)生影響，說明 AQP-4 參與了從血管源性水腫到細胞毒性水腫的整個病理過程。雖然目前已經(jīng)證實 AQP-4 與脊髓損傷后的水、離子失衡的相關(guān)性及重要性。但AQP-4作為 BSCB 水代謝的重要調(diào)控蛋白，對其調(diào)控機制卻知之甚少，所以明確調(diào)節(jié)AQP-4表達變化的分子機制將為 SSCI 脊髓水腫的治療提供新的思路與靶點。

目前，研究表明 AQP-4 存在多種蛋白的調(diào)控位點，其中 Ser180 和 Ser111 是參與AQP-4動態(tài)調(diào)節(jié)的主要位點，作用于該位點的蛋白包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)〔16〕、蛋白激酶(PK)C〔17〕、鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶(CaMK)Ⅱ、 酪蛋白激酶(CK)Ⅱ、PKA磷酸化位點〔18〕。當(dāng)脊髓髓損傷時絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路被激活，抑制該通路中蛋白的表達后，AQP-4 的表達亦隨之發(fā)生改變，說明 AQP-4 有可能受到 MAPK 通路的調(diào)控〔19〕。有研究顯示〔20〕鈣調(diào)蛋白、PKC、PKG、PKA 等均可在催化AQPs上的特定的絲氨酸殘基(Ser111)或 Ser180 磷酸化從而使 AQP的活性上升，增加膜對水的通透性。同時有脊髓損傷的相關(guān)研究顯示AQP-4表達受 MAPKs 信號通路的控制，當(dāng)阻斷 MAPKs 信號通路后，AQP-4在 BSCB 中血管周圍的星形膠質(zhì)細胞及毛細血管內(nèi)皮上的表達及脊髓水腫程度均發(fā)生明顯變化〔21，22〕。證實 MAPKs 通路確實通過調(diào)控 BSCB 中AQP-4的表達，干預(yù)了脊髓損傷后水腫的形成與消退。深入研究發(fā)現(xiàn)，PKC 抑制劑可抑制磷酸化表達，PKC發(fā)揮作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在AQP-4表達的轉(zhuǎn)錄水平而不涉及蛋白質(zhì)的從頭合成〔23〕，提示相關(guān)信號通路調(diào)控 AQP-4 mRNA 的表達變化可能是通過轉(zhuǎn)錄因子進行的，而這種轉(zhuǎn)錄因子有可能是一個新的“神經(jīng)保護用因子”，在 SCI 早期脊髓水腫的防治中發(fā)揮作用。

3.2長鏈非編碼RNA(lncRNA)MALAT1對AQP-4調(diào)控防治SSCI lncRNA作為非編碼蛋白質(zhì)的新型基因表達調(diào)控因子，參與生物體的各種生理及病理過程。MALAT1是張海天等〔24〕發(fā)現(xiàn)的一個反義 lncRNA，位于 11 號染色體，是有絲分裂進程所必須的基因。其在促進癌細胞侵襲和增殖方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn) MALAT1 在血管內(nèi)皮細胞的生理病理變化中起關(guān)鍵調(diào)控作用，通過抑制 MALAT1 的表達，可增加內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)出芽和促進細胞遷移，反之 MALAT1 過表達可抑制內(nèi)皮細胞出芽。并且運用 GapmeR(lncRNA 的抑制劑)、siRNA 分別干擾 MALAT1 表達后，再用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)刺激血管內(nèi)皮細胞，均可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞不連續(xù)的出芽生長，影響細胞周期進程，使細胞分裂期 S 期減少〔25〕。研究表明〔26〕MALAT1可通過調(diào)控 VEGF 的表達促進間充質(zhì)干細胞的血管新生，說明在體外實驗中，MALAT1 可影響內(nèi)皮細胞出芽、遷移和增殖。在小鼠單側(cè)下肢缺血模型中，抑制MALAT1可減少血流的恢復(fù)和后肢局部缺血后毛細血管的密度〔27〕。由此證實MALAT1促進血管內(nèi)皮細胞增殖、新生血管化、促進損傷后血流恢復(fù)和毛細血管密度的作用。同時，在神經(jīng)再生的研究中發(fā)現(xiàn)MALAT1可通過介導(dǎo)PKC增加腦損傷中神經(jīng)元的成活率〔28〕，且可通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK)/MAPK 信號通路，在神經(jīng)生長早期發(fā)揮關(guān)鍵作用〔29〕，說明lncRNA MALAT1 可能是 MAPK 家族信號通路的上游調(diào)控因子，參與了神經(jīng)損傷后的修復(fù)與重建，加之其在毛細血管內(nèi)皮調(diào)控方面發(fā)揮的重要作用，推測MALAT1 可能是脊髓損傷后調(diào)控 AQP-4 的表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

綜上，SCI疾病病理機制具有可變化性，治療方案復(fù)雜多樣。盡管SCI發(fā)生生理、病理機制已逐漸被掌握，但是針對該疾病的治療目前仍只能治其表，未能達到治本的效果〔30〕。對于SSCI的防治，是目前仍需首要解決的問題，其直接影響后期神經(jīng)軸突的再生及肢體感覺功能的恢復(fù)及重建。如何減輕脊髓水腫、降低椎管內(nèi)壓力、提高血液的再灌注是治療SCI首要解決的問題。目前已有研究表明AQP-4參與水分可進出在BSCB或神經(jīng)興奮、SCI后星形膠質(zhì)細胞的遷移、軸突再生等功能，已作為調(diào)控水分再平衡及參與SSCI后脊髓水腫及消退的重要信號蛋白〔31〕。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性脊髓損傷初期，AQP-4表達下降相對伴隨腦水腫的減輕，脊髓損傷后水腫的嚴重程度與AQP-4表達的呈正相關(guān)。如何調(diào)控AQP-4的表達是減輕神經(jīng)細胞凋、減輕脊髓水腫、促進軸再生的首要關(guān)鍵問題。實驗研究表明lncRNA是高度異變并且具有高度的功能多樣性，其主要功能依賴于RNA分子符合不同結(jié)構(gòu)和分子相互作用的能力。此外lncRNAs表達還與人類許多疾病密切相關(guān)，包括癌癥和心血管和神經(jīng)變性疾病〔32〕。lncRNA參與SSCI主要的表達基因為MALAT1，此因子為lncRNA的反義因子〔33〕，促進內(nèi)皮細胞的生長、間充質(zhì)干細胞的血管新生及SCI后血流的恢復(fù)等方面均發(fā)揮著重要的作用。同時，MALAT1能增加腦損傷中神經(jīng)元的成活率，并且通過ERK/MAPKs 信號通路的調(diào)節(jié)，促進神經(jīng)細胞的生長。因此推測其與AQP-4之間或許存在一定關(guān)聯(lián)。ERK/MAPKs 信號通路的調(diào)節(jié)、AQP-4 的表達與 BSCB 損傷后的水代謝及神經(jīng)修復(fù)密切相關(guān)，但具體基因調(diào)控機制尚不明確。目前，國內(nèi)有學(xué)者采用中醫(yī)辨證論治的理念對 SSCI 的防治展開相關(guān)研究，但對該病的中醫(yī)病因病機認識不同，治療側(cè)重點不同，未形成統(tǒng)一的、行業(yè)內(nèi)認可的辯證標(biāo)準(zhǔn)，阻礙了中醫(yī)藥防治本病的進一步發(fā)展，影響了中醫(yī)藥結(jié)合中醫(yī)辨證論治理論優(yōu)勢的發(fā)揮和學(xué)術(shù)交流。