循環(huán)腫瘤DNA的研究進展與應(yīng)用前景*

雷容，劉楊文易，張克，顏汝平

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 泌尿外科，云南 昆明650101）

2015年腫瘤患者的病死率較1991年下降了26%，這與對腫瘤的認識日益加深密不可分[1]。腫瘤的精確診療能挑選出從治療方案中獲益的患者，避免過度診療。目前組織穿刺活檢是了解患者腫瘤的金標準，但穿刺的損傷、偏倚、不連續(xù)性卻限制著其發(fā)展。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）來源于腫瘤細胞攜帶信息，且ctDNA分析結(jié)果與組織穿刺結(jié)果具有很高的一致率，因此ctDNA被作為了解腫瘤的新方法而廣為研究。

1 ctDNA

ctDNA是游離于細胞外的腫瘤DNA片段，最早在循環(huán)DNA（cfDNA）中發(fā)現(xiàn)。cfDNA廣泛存在于各種體液中，包括血液、尿液、腦脊液、唾液等，平均長度120～160 bp，其來源與細胞的凋亡及壞死緊密相關(guān)，細胞的活動性分泌也參與其中[2]。在健康個體中，血清cfDNA常維持在較低水平，為1～10 ng/ml[3]，但在急性損傷、腦梗死、器官移植、感染等生理狀況和疾病過程中cfDNA會出現(xiàn)明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)cfDNA常常出現(xiàn)升高，其中有部分cfDNA經(jīng)證實其來源于腫瘤細胞，故被稱為ctDNA[4]。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，ctDNA的濃度與腫瘤的分期[5]、大小[6]密切相關(guān)，并且ctDNA能很好的反映腫瘤的異質(zhì)性以及腫瘤的動態(tài)變化。在臨床的診斷、治療、預(yù)后都具有實際意義，因此作為液體活檢的熱點被廣泛研究。

2 ctDNA檢測方法

ctDNA的檢測是一個不斷發(fā)展與探索的過程，伴隨著基礎(chǔ)科學(xué)的發(fā)展ctDNA檢測從定性發(fā)展到了定量，從最早的凝膠電泳到現(xiàn)如今的全基因測序。目前ctDNA檢測按內(nèi)容可分為特異性位點檢測、靶向序列測序、全基因檢測；按原理則可分為靶向檢測和非靶向檢測。各種檢測方法各有優(yōu)勢與不足，可用于不同的檢測背景與要求。特異性位點檢測主要針對于熱點突變，常采用等位特異性PCR及微流體技術(shù)，可以實現(xiàn)特定基因位點的定量與定性檢測，現(xiàn)已應(yīng)用于腫瘤的熱點基因診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測[7-9]。特異性位點檢測的范圍有限，為了彌補這一不足，靶向序列測序應(yīng)運而生。靶向序列測序的范圍10～50 Mb，可以覆蓋單個外顯子到整個外顯子區(qū)域。通過PCR擴增子[10]及基因雜交[11]技術(shù)實現(xiàn)對外顯子基因的橫斷面分析、新的抗性基因的發(fā)現(xiàn)、腫瘤放化療后的基因改變及腫瘤負荷的監(jiān)測。全基因檢測其范圍更廣，包含全部的基因組，還可以發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的變異和染色體異常[12]。雖然ctDNA的檢測已經(jīng)取得不錯的進展，但復(fù)雜的操作步驟、較長的周轉(zhuǎn)時間、高昂的價格任然阻礙著其臨床應(yīng)用的腳步。令人欣慰的是材料科學(xué)、電化學(xué)及高通量測序等的的發(fā)展又給ctDNA的檢測帶來新的靈感，例如CHU等[13]利用水熱法和超聲法將DNA探針與二硫化鉬及石墨烯組合成電化學(xué)傳感器，該電化學(xué)傳感器可以更加經(jīng)濟、快速、靈敏的檢測ctDNA。

3 ctDNA應(yīng)用現(xiàn)狀及前景

ctDNA來源于腫瘤細胞，其包含的遺傳學(xué)信息能充分反映腫瘤的異質(zhì)性，甚至能發(fā)現(xiàn)一些組織活檢遺漏的基因突變[14]。此外ctDNA會隨腫瘤的進展發(fā)生相應(yīng)的變化，能動態(tài)反映病情的變化，對解釋腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遺傳進化及藥物耐藥具有重要作用。而且ctDNA與傳統(tǒng)的穿刺活檢相比，還具有微侵入、樣本獲取簡單、可連續(xù)觀察等諸多優(yōu)勢，是腫瘤診治中的新幫手。ctDNA研究火熱，目前主要集中在腫瘤診斷、治療方案挑選與評估及預(yù)后評估與復(fù)發(fā)監(jiān)測。

3.1 腫瘤診斷

腫瘤的診斷目前主要采用影像學(xué)聯(lián)合組織活檢以及腫瘤標志物的方法，這些方法在腫瘤診斷中的確取得不錯的成就，但輻射暴露、穿刺并發(fā)癥以及低診斷效力仍是困擾醫(yī)務(wù)人員與患者的難題。此外隨著人類對腫瘤的認識日益深刻，腫瘤精確診斷成為未來的趨勢，精確的腫瘤診斷能為后續(xù)的腫瘤管理提供重要的依據(jù)。在這一趨勢下，ctDNA優(yōu)秀的精確診斷能力、微侵入性、實時性、連續(xù)性等特點展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。

自1994年SORENSON等[15]從胰腺癌患者的血液中檢測到KRAS基因突變，并且血液中檢測到的突變與腫瘤組織中的突變相一致，證實血液中的突變基因為腫瘤來源。自此之后ctDNA就被作為腫瘤診斷指標廣為研究，SACHER等[16]采用液滴數(shù)字PCR技術(shù)對180例高級別非小細胞肺癌的EGFR、KRAS基因進行檢測，結(jié)果表明其檢測時間明顯短于組織穿刺活檢，且此方法對EGFR 19缺失檢測的敏感性為82%（95% CI：0.69，0.91），對T790M的敏感性為77%（95% CI：0.60，0.90）。除卻對腫瘤熱點基因的檢測，ctDNA甲基化狀態(tài)以及微衛(wèi)星狀態(tài)的分析也可以反映腫瘤的信息。XU等[17]構(gòu)建了一個包含10個甲基化標志物的診斷預(yù)測模型（AUC為0.969），該模型可以很好的區(qū)分肝癌和正常對照，與傳統(tǒng)的甲胎蛋白（AUC為0.816）相比擁有更高的檢測效力。相似的NESVET等[18]結(jié)合甲基化特異性PCR與熔點曲線分析對黑色素瘤細胞的甲基化進行分析，能檢測低至0.1%的甲基化DNA，但此研究還需進一步的臨床標本驗證。腫瘤發(fā)生過程中由于DNA錯配修復(fù)的缺陷，可導(dǎo)致微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)的異常增多或減少，因此腫瘤患者常常出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的發(fā)生。MONTAGUT等[19]檢測了5 930個腫瘤樣本中的微衛(wèi)星狀態(tài)，14種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)合ctDNA微衛(wèi)星的分析，也能了解腫瘤的情況。

其實ctDNA在腫瘤中的診斷已從臨床研究走向了臨床應(yīng)用，2016年美國食品藥物管理局就批準了一項針對非小細胞肺癌EGFR突變的檢測應(yīng)用[20]。此外還有更令人興奮的發(fā)現(xiàn)，GORMALLY等[21]的一項健康人群中的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)被診斷出腫瘤的測試者在2年之前就從血液樣本中發(fā)現(xiàn)KRAS2和TP53基因的突變，提示了ctDNA具有腫瘤早期診斷的潛能。腫瘤的早期診斷在腫瘤管理中極具現(xiàn)實意義，如果能夠早期診斷進而實施早期干預(yù)，將大大提高患者的生存率。但在一項針對幾種癌癥的研究中，82%的Ⅳ期患者檢測到ctDNA，而Ⅰ期患者檢出率只有47%[5]。其原因除了與技術(shù)限制之外，還可能是由于早期的腫瘤體積小，入血的ctDNA有限，所以檢出率低。因此ctDNA運用于早期診斷還需要進一步的探索和論證，不過最近有研究發(fā)現(xiàn)ctDNA用于腫瘤的篩查倒是有不錯的表現(xiàn)[22]。

3.2 治療方案挑選與評估

雖然人類對腫瘤的認識越來越深入，甚至已研制出針對宮頸癌的疫苗，但腫瘤的治療仍是一個棘手的難題。近年來免疫治療、靶向治療給腫瘤的治療帶來了新的思路，但這些方法都需要基于腫瘤基因信息的支持[23]。傳統(tǒng)的組織穿刺活檢對患者損傷大，并且由于穿刺偏倚可能使穿刺出現(xiàn)假陰性。ctDNA由腫瘤細胞釋放，因此可以彌補由穿刺不準導(dǎo)致的偏倚，同時ctDNA相比于傳統(tǒng)的穿刺活檢擁有更短的周轉(zhuǎn)時間[24]。通過ctDNA去了解腫瘤，根據(jù)基因信息去制定精確有效的治療方案將使患者從中獲益。

KIM等[25]對61例轉(zhuǎn)移性胃癌患者進行腫瘤組織分子表征分析與ctDNA檢測，分析了微衛(wèi)星不穩(wěn)定高含量與EB病毒陽性的患者對派姆單抗的總緩解率（overall response rate,ORR），發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定高含量與EB病毒陽性患者對派姆單抗的ORR分別為85.7%和100%。KIM等[25]還進一步證實使用ctDNA檢測可以有效的識別出對派姆單抗有效的患者，因此認為ctDNA檢測用于治療方案挑選可行。一項利用新一代測序技術(shù)（NGS）在多種腫瘤患者進行的ctDNA分析，發(fā)現(xiàn)有71.4%的患者包含≥1個藥物靶點，更加證實了ctDNA的臨床應(yīng)用潛能[26]。我國亦有通過ctDNA的檢測指導(dǎo)臨床治療的報道，張萍等[27]在1例肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的腦脊液ctDNA檢測中發(fā)現(xiàn)TPM3-ROS1基因融合，患者據(jù)此使用色瑞替尼治療后獲益。WANG等[28]的多中心臨床研究也表明ctDNA分析能有效識別出能從吉非替尼治療中獲益的晚期肺腺癌患者，進一步的動態(tài)監(jiān)測還可以提前發(fā)現(xiàn)藥物的耐藥。

腫瘤的耐藥是腫瘤治療中的另一個棘手的問題，及時的發(fā)現(xiàn)耐藥可以盡早調(diào)整后續(xù)治療。穿刺活檢可以了解腫瘤的耐藥遺傳信息，但反復(fù)的穿刺在臨床上是不可行的，而此時連續(xù)的ctDNA檢測則是一個不錯的選擇。ctDNA可以動態(tài)的反映患者對藥物的反應(yīng)，便于及時的評估與調(diào)整治療方案?？笶GFR藥物（西妥昔單抗和帕尼單抗）作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌經(jīng)典治療方案，在用藥后期大多數(shù)都會進展成藥物耐藥，且大約50%的耐藥與RAS突變的出現(xiàn)相關(guān)[29]。VIDAL等[30]的一項轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌抗EGFR藥物應(yīng)用研究，對患者進行ctDNA進行縱向連續(xù)監(jiān)測和組織基線突變水平檢測，ctDNA與組織分析結(jié)果一致率高達93%，此外連續(xù)的ctDNA檢測能發(fā)現(xiàn)RAS突變的出現(xiàn)以及評估藥物的療效。同樣CREMOLINI等[31]的一項轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌抗EGFR耐藥后的二期單臂臨床試驗，通過ctDNA去評估患者用藥后的情況，表明ctDNA可以在影像學(xué)發(fā)現(xiàn)之前預(yù)測對吉非替尼的耐藥。

3.3 預(yù)后評估與復(fù)發(fā)監(jiān)測

目前對腫瘤患者的預(yù)后評估與復(fù)發(fā)監(jiān)測大多采用影像學(xué)聯(lián)合生化標志物的方法，ctDNA與傳統(tǒng)方法相比既避免了輻射暴露又有優(yōu)秀的檢測能力。并且有研究證明ctDNA比傳統(tǒng)的方法更具預(yù)見性，能提前數(shù)月發(fā)現(xiàn)腫瘤的進展[32]。ctDNA在評估患者預(yù)后展現(xiàn)出強大的能力，TIE等[33]在230例結(jié)直腸癌患者腫瘤切除術(shù)后第1次隨訪時進行ctDNA評估，結(jié)果顯示ctDNA陽性組3年無復(fù)發(fā)生存率為0%，而ctDNA陰性組為90%。相似的一項對膀胱癌和肺癌患者運用免疫療法后的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，早期出現(xiàn)ctDNA含量下降的患者較晚期出現(xiàn)ctDNA下降的患者擁有更大的腫瘤體積縮小比例以及更長的無進展生存和總生存[34]。同樣CHEN等[35]的一項納入18項研究包含1 243例胰腺癌患者的Meta分析，指出高cfDNA濃度預(yù)示著較差的預(yù)后。

手術(shù)后腫瘤微小殘留病是引起腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因，多項研究表明術(shù)后即刻或連續(xù)ctDNA檢測能很好的預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)，對微小殘留病具有提示作用[36]。CHAUDHURI等[37]通過深度測序技術(shù)對接受過有效治療的肺癌患者ctDNA進行分析，ctDNA與影像學(xué)檢查相比能提前5.2個月發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)，同時還在53%的患者中發(fā)現(xiàn)對酪氨酸激酶抑制劑或免疫檢查點抑制劑敏感的治療靶點。CHRISTENSEN等[38]檢測了膀胱癌術(shù)后的FGFR3和PIK3CA熱點突變，結(jié)果ctDNA陽性患者中89%出現(xiàn)復(fù)發(fā)而陰性患者僅有33%出現(xiàn)復(fù)發(fā)。ctDNA同時還能提供腫瘤是否轉(zhuǎn)移的信息，IKEDA等[39]對多種腫瘤患者的ctDNA分析，發(fā)現(xiàn)MET基因突變與骨轉(zhuǎn)移強烈相關(guān)并伴隨著較差的預(yù)后。同樣的OLSSON等[40]對20例原位乳腺癌患者進行長期連續(xù)ctDNA檢測，ctDNA的方法能提前11個月發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

4 未來與挑戰(zhàn)

ctDNA能很好的反映腫瘤的信息，雖然目前無法取代組織活檢這一金標準，但可作為了解腫瘤的補充手段。盡管ctDNA與現(xiàn)有的腫瘤標志物相比擁有更高的敏感性和特異性，然而ctDNA并不能提供全部的腫瘤信息，一些研究發(fā)現(xiàn)ctDNA與組織活檢結(jié)果存在不一致，在一些健康個體中也有ctDNA的檢出[41-42]。聯(lián)合多方法、多指標可以互相取長補短，便于更全面的認識腫瘤，GIROTTI等[43]就結(jié)合全基因測序、ctDNA分析、患者腫瘤來源的動物模型以及循環(huán)腫瘤細胞移植的動物模型等多種方法，構(gòu)建了一個黑色素瘤臨床管理平臺用于腫瘤精確治療。此外ctDNA檢測方法多樣，尚缺乏統(tǒng)一標準。再者ctDNA花費較高，靶向ctDNA分析單人累計花費高達1 750美元，但新技術(shù)的研發(fā)必將大大減少花費加速ctDNA走向臨床運用[44-45]。在腫瘤早期ctDNA含量有限，參考循環(huán)腫瘤細胞的富集方法利用能和ctDNA結(jié)合的材料制成可植入設(shè)備，在不需要抽血的基礎(chǔ)上就能實現(xiàn)ctDNA的富集。ctDNA檢測流程繁復(fù)耗時，KIM等[46]構(gòu)建一個快速檢測系統(tǒng)，30 min就能從全血中提取ctDNA。ctDNA還可以促進新藥的研發(fā)，ctDNA能發(fā)新的藥物靶點，對新靶點的研究將促進新藥的開發(fā)。近年來研究還發(fā)現(xiàn)cfDNA、ctRNA、外泌體相關(guān)ctDNA在了解腫瘤中同樣具有積極意義，這些研究將進一步推動腫瘤精準醫(yī)療的發(fā)展。

近年來ctDNA被國內(nèi)外廣為研究，眾多研究都表明ctDNA具有臨床運用的潛能。ctDNA來源于腫瘤細胞，能詳細反映腫瘤的基因信息，協(xié)助醫(yī)生做出精確診斷；較短的半衰期及隨治療措施動態(tài)改變的特性，能指導(dǎo)醫(yī)生更好的進行精準治療和個體化治療；其與腫瘤預(yù)后相關(guān)的特性，能幫助醫(yī)生預(yù)測腫瘤患者預(yù)后以及進行復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移監(jiān)測。但相對高昂的花費、較長的檢測時間、復(fù)雜的流程等仍限制著ctDNA的運用，相信隨著這些難題的解決腫瘤患者必將從中獲益，腫瘤的精準治療時代正迎面而來。