動物實驗周圍神經損傷模型的研究進展*

孔亞敏，嚴雋陶，李華偉

（1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 鄭州450000；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院 推拿科，上海200437）

周圍神經損傷（peripheral nerve injury,PNI）是致殘率較高的常見疾病，會引起該神經支配區(qū)域功能出現(xiàn)部分缺失，造成運動、感覺等功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。因此PNI修復一直是國內外學者研究的熱門問題[1]。神經外科醫(yī)生SUNDERLAND[2]在Seddon提出的神經損傷Ⅲ度分類法的基礎上進一步細化，將神經損傷分為V度。不同程度損傷所展示的病理表現(xiàn)各有特點，由于神經結構的復雜性，在體外研究PNI及再生的條件非常有限，因此根據(jù)實驗目的選擇恰當?shù)膭游飺p傷模型及正確的模型復制方法是研究PNI的關鍵。本文就現(xiàn)階段動物實驗中PNI模型做歸納總結，對模型復制過程中存在的優(yōu)點和不足進行分析討論，以便進一步指導PNI動物模型的復制。

1 手術器械性損傷模型

手術器械性損傷是PNI模型復制的主要方式，并被廣泛應用于動物實驗。目前手術器械性損傷模型以橫斷傷、鉗夾傷等為主，常作用于神經中較為粗大的神經干，如坐骨神經。

1.1 橫斷傷模型

橫斷傷模型即神經干橫斷損傷，僅有部分外膜相連，或神經干完全斷裂，符合Sunderland神經損傷分類法中Ⅳ或V度損傷。1973年REUCK[3]通過坐骨神經橫斷傷模型對大鼠失神經與再神經支配后腓腸肌肌纖維變化進行觀察探討，為該模型提供方法，后不斷有學者在此基礎上進行完善總結。

DEDKOV等[4]通過對SD大鼠行右側坐骨神經橫斷傷后的骨骼肌微循環(huán)研究發(fā)現(xiàn)：骨骼肌內血管發(fā)生明顯改變，管壁變硬，管腔畸形，微循環(huán)床的毛細血管及細胞發(fā)生顯著的結構重塑，肌肉萎縮程度與毛細血管網的減少及結締組織內的纖維增生有關，為臨床研究PNI后骨骼肌萎縮微循環(huán)方向提供了理論依據(jù)。ISAACS等[5]切除2/3左側脛神經后將神經游離端縫入相鄰肌肉，并擠壓剩余1/3神經5 s，對肌肉重量和收縮強度進行評估發(fā)現(xiàn)：8周后腓腸肌收縮力與對照組比較有差異，但肌肉質量差異不明顯。馬書杰等[6]充分暴露坐骨神經后于梨狀肌下緣1 cm處橫斷，在10倍顯微鏡下立即縫合，用坐骨神經橫斷傷立即縫合模型探討推拿聯(lián)合跑臺訓練與坐骨神經再生之間的關系，發(fā)現(xiàn)推拿聯(lián)合跑臺能夠促進施萬細胞增殖，軸絲增加，軸突計數(shù)升高，提示推拿手法能夠促進神經再生，對臨床促進神經生長療效方面有一定意義。

在組織工程方面，復制神經缺損模型也是研究的熱點。張偉才[7]通過手術橫斷切除坐骨神經8 mm長度，在10倍顯微鏡下待游離端自然回縮至12 mm后植入神經導管內，對生物活性人工神經修復周圍神經缺損進行研究?，F(xiàn)階段在組織工程方面，常通過對生物聚合物、神經導管等材料進行移植研究，該研究為臨床促進PNI后神經再生以及尋求更合適的替代療法方面提供了新的方法[8-9]。

該模型在造模過程中重復性較好，且模型損傷級別較為一致，利于實驗定量定性分析。該模型不僅能夠模擬臨床中失神經后發(fā)生的一系列病理變化，而且在研究失神經肌萎縮及功能恢復方面也提供新的思路和方法[10-12]，尤其為針灸推拿治療PNI的長期觀察提供了依據(jù)[13-14]。但由于神經切斷后軸漿外滲，為顯微鏡下神經對位吻合修復增加了難度；另一方面來講，神經修復過程中的瘢痕組織的增生，對神經的再生及功能的恢復也有很大影響。

1.2 鉗夾傷模型

鉗夾傷模型即使用止血鉗或持針器給予坐骨神經一定的壓力，使坐骨神經形成相應程度損傷的模型。該模型無需顯微鏡下行斷端吻合手術，一定程度上保持了神經干的連續(xù)性，神經外膜的完整性，使損傷部位的近端和遠端一定程度上保持連接，為軸突的再生實現(xiàn)對靶器官的再支配提供了條件[15]。1943年GUTMANN等[16]在兔腓總神經分別施以鉗夾、銳器橫斷及神經移植縫合3種不同模型復制方法，比較三者之間病理學變化，對鉗夾傷進行系統(tǒng)的概述，為坐骨神經損傷模型的復制及應用開創(chuàng)了新的方向。

PAN等[17]于大鼠右側坐骨神經行30 s擠壓損傷復制大鼠擠壓傷模型，探討促進PNI的機制，發(fā)現(xiàn)推拿能夠促進神經生長因子及其受體TrkA的表達，加速坐骨神經軸漿運輸，減少tPA及PAI-1的分泌，從而促進損傷后神經再生。但是該實驗并沒有清楚表明使用儀器的型號、壓力的大小、擠壓的損傷程度以及具體位置，無法進行實驗重復，具有一定的缺陷。KARASAWA等[18]通過不同時間間隔對大鼠右側坐骨神經行2重或3重鉗夾傷，探討不同時間間隔反復神經損傷對功能恢復及神經再支配的影響，發(fā)現(xiàn)重復損傷之間的時間間隔可能與功能恢復無關，但是重復損傷次數(shù)會影響運動功能的恢復。該模型在實驗中對擠壓儀器以及加壓時間做出明確定論，但是關于首次擠壓的具體位置尚未闡述。在組織生物學方面，MIRZAKHANI等[19]通過使用小型止血鉗在坐骨神經分叉上2 cm處進行擠壓，擠壓60 s，觀察神經擠壓至透明后的縫合肌肉和皮膚，揭示坐骨神經擠壓傷后抑制了抗氧化酶活性，誘導坐骨神經的組織學和超微結構發(fā)生改變，產生骨骼肌萎縮，進而導致運動功能障礙。對肌肽對坐骨神經的再生以及功能恢復的的作用機理進行探討，發(fā)現(xiàn)肌肽是骨骼肌收縮作用中不可或缺的細胞質二肽，自神經釋放并參與神經肌肉傳導過程，可能在神經與肌肉相互營養(yǎng)作用方面扮演重要角色。該模型確定了擠壓時間、損傷位置以及損傷程度，但是壓力大小以及止血鉗型號尚未指明。

該模型產生的瘢痕組織較少，操作簡便，由于保持了神經干的連續(xù)性，因此有較好的恢復性，避免了對神經切斷縫合技術的嚴格要求，常用于觀察坐骨神經功能恢復，尤其在對PNI恢復的短期觀察中應用極為廣泛[20-22]。然而關于該模型的大多數(shù)研究對擠壓的損傷程度都沒有做定性定量分析，不能明確符合Sunderland損傷程度，關于擠壓的壓力、擠壓的部位、擠壓的損傷面積以及擠壓的時長等都尚未明確定論，操作時具有一定主觀性，加大了實驗誤差。

2 物理因素損傷模型

物理因素損傷模型是通過一些物理方法（液氮、電等）對坐骨神經造成一定程度損害復制符合臨床需求的損傷模型，實驗中常見的物理因素損傷模型有冰凍損傷，電燒傷以及卡壓傷等。

2.1 冰凍損傷模型

冰凍損傷模型是通過低溫的方法對周圍神經造成一定程度損傷的模型。早在1991年，KERNS等[23]就對大鼠坐骨神經冰凍損傷與鉗夾傷后運動及感覺功能的恢復做出比較。同年，DELEO等[24]通過右側坐骨神經凍融—冷凍循環(huán)的方式復制坐骨神經冰凍損傷模型，探討周圍神經低溫損傷后對脊髓背角P物質含量的影響。復制大鼠周圍神經病理性疼痛冰凍模型[25]，但由于該模型術后大鼠足部缺乏神經支配易出現(xiàn)自發(fā)痛導致自殘情況發(fā)生。

JIA等[26]復制非凍結性神經冰凍損傷模型并對發(fā)病機制進行探討，李浩等[27]對該模型進行完善，通過應用實驗設備使大鼠坐骨神經保持在3～5℃，維持2 h，發(fā)現(xiàn)周圍神經冰凍損傷與血神經屏障有密切關系，對神經內膜、神經纖維等也有一定的影響。該模型避免了機械損傷，適用于病理機制方向的相關研究，但病理機制是一個復雜的共同作用的結果，研究方法仍需完善。趙曙光等[28]對大鼠坐骨神經分別采取-60℃、-80℃、-100℃及-120℃復制模型，72 h后發(fā)現(xiàn)-60℃、-80℃組神經內膜、基底膜以及外膜均完整，神經功能能夠完全恢復，該實驗對不同溫度下周圍神經恢復情況進行探討，并確定了周圍神經冰凍損傷后能夠完全恢復的溫度區(qū)間，但在實驗過程中要時刻觀察大鼠生存狀態(tài)。

冰凍損傷模型一定程度上保證了神經的完整性，避免了機械損傷，能夠模擬臨床神經損傷引起的神經傳導阻滯，適用于臨床研究病理機制以及功能恢復，尤其是感覺功能方面，是較好的選擇。但是周圍神經的恢復是一個復雜的過程，是多因素共同作用的結果，所以該模型在研究單一PNI因素方面并不適用。由于實驗過程中低溫的要求，死亡率較高，要對大鼠實行實時監(jiān)測，以確保實驗的存活率。

2.2 卡壓傷模型

卡壓傷模型是利用硅膠管、尼龍線等方式對神經進行結扎或者持續(xù)卡壓，使坐骨神經受到持續(xù)損傷的模型。臨床常見的卡壓傷模型有管卡壓模型、神經結扎模型等。

1984年MACKINNON[29]將SD大鼠的坐骨神經與不同內徑1 cm長的管道進行套合，使坐骨神經受到持續(xù)性壓迫，復制慢性神經卡壓傷模型。ZHENG等[30]對MACKINNON設計的卡壓模型進行優(yōu)化總結，用與坐骨神經直徑相一致的硅膠管縱向切開后套在坐骨神經上，并用2根5-0手術線固定打結，研究慢性卡壓傷對坐骨神經的影響。在形態(tài)學方面發(fā)現(xiàn)6周時硅膠管與神經粘黏，卡壓處神經明顯細化，硅膠管近遠端明顯變粗，8周時卡壓處神經出現(xiàn)硬化，硅膠管近遠端出現(xiàn)瘤樣改變；組織學觀察發(fā)現(xiàn)，8周時髓鞘畸形，軸索扭曲，髓鞘板層密度不均，為臨床研究神經性疼痛提供了參考。該模型可以看到神經卡壓之后慢性變化的過程，避免了二次手術或多次手術造成的損傷，但是卡壓硅膠管的重量、卡壓的壓力、卡壓后神經的損傷程度以及排異反應等均不明確，仍需后期實驗完善。

1988年BENNETT等[31]使用結扎線對大鼠坐骨神經進行復制模型，模仿臨床外周單神經病變，為臨床研究奠定了基礎。KHANGURA等[32]游離出約10 mm長坐骨神經后在神經上使用鉻腸線進行結扎，雙結之間間隔1 mm，共4個結，后立即縫合肌肉皮膚，發(fā)現(xiàn)吡侖帕奈能減少神經性疼痛相關的機械性痛覺過敏及冷異常性疼痛，其原因可能是由于其抑制了AMPA誘導的細胞內Ca2+、增加了突出傳遞的能力，該模型能較好的模擬臨床神經性疼痛，產生自發(fā)痛行為，在研究藥物治療神經性疼痛及其作用機理方面具有較好的選擇，但是該模型沒有明確結扎線的型號以及結扎的松緊程度，一定程度上增大了模型的誤差。XU等[33]鈍性分離并充分暴露坐骨神經后，用3根4-0的線結扎于坐骨神經，結與結之間相距1.0～1.5 mm，對熱痛敏及機械性痛敏進行評估，探討神經性疼痛的病理變化。該模型有利于對神經疼痛障礙的神經機制進行探索，能產生熱痛敏、冷痛敏等反應，可確定結扎線的型號。但是結扎仍具有一定的主觀性，無法確定對神經纖維的損傷程度，存在一定的不足。

3 其他損傷模型

PNI模型方法繁多，除上述提出的造模方法外，還有一些其他損傷模型，例如藥物損傷、內源性神經病變及超聲定位損傷等。

臨床很多常用藥對神經具有一定損害，當損及神經時，常會引起該神經所支配區(qū)域出現(xiàn)運動及感覺功能異常。YU等[34]以股骨大轉子為標志，剝離并充分暴露坐骨神經干，在坐骨神經干外膜處注射20萬u（0.5ml）青霉素鈉，復制坐骨神經藥物損傷模型，觀察治療周圍神經藥物損傷后的功能恢復，為臨床研究藥物對PNI及治療提供依據(jù)，但是造模過程中因注意枕頭刺入的深度以及藥物的吸收，避免藥物外泄及刺入過深。黃晶等[35]實驗探討低頻超聲對大鼠坐骨神經的影響，充分暴露坐骨神經干后在把超聲設備（直徑2 mm，頻率34 KHz，連續(xù)波）的導管末端安放于其上方約2 mm處，以8 w/cm2、18 w/cm2及32 w/cm2的聲強作用于神經干，發(fā)現(xiàn)當聲強為32 w/cm2作用于坐骨神經后，神經纖維出現(xiàn)斷裂、腫脹，低頻超聲則可使坐骨神經傳導速度降低。該模型定位準確，易于操作，保持了外膜的完整性，利于神經損傷后恢復，但是該模型對儀器的要求過高，且并不能體現(xiàn)臨床神經損傷后一系列的病理變化，故臨床應用較少。

4 討論與展望

正如本文所述，大多數(shù)PNI的研究是誘導坐骨神經損傷建立的。現(xiàn)階段鉗夾傷、橫斷傷模型因損傷程度較好控制、操作簡便而被廣泛應用，但是在實驗過程中，由于神經損傷后運動、感覺等功能障礙以及神經營養(yǎng)物質的支持喪失，往往伴隨動物自噬、潰瘍等現(xiàn)象，因此應即時處理傷口，避免動物脫落對實驗結果產生不利影響。PNI后修復是一個復雜的相互作用的結果，隨著臨床需求，其他實驗模型也逐漸被提出。2009年RONCHI等[36]對大鼠正中神經擠壓傷進行標準化研究，并對損傷后功能及形態(tài)學進行評估。支配上肢單束存在的正中神經，不同于多束的坐骨神經，更利于行為學、形態(tài)學的觀察，因此逐漸應用于實驗研究中[37-38]，但是也存在神經較細小，對顯微技術要求較高的缺點。由于PNI后損傷程度評價技術（例如肌電圖、彌散張量成像技術等）仍不足夠明確，無法為PNI程度的統(tǒng)一性提供可靠的依據(jù)，一定程度上加大了PNI模型復制的誤差，對動物實驗中的損傷難以做到準確評定，操作人員實驗過程中的操作習慣、技術熟練程度等也是模型復制的影響因素。

由此可見，PNI模型的復制仍有較大的發(fā)展空間，損傷程度、損傷范圍等都應不斷完備，減少實驗中的差異性，為后續(xù)PNI后修復機制的研究提供可靠依據(jù)。不同的實驗模型具有不同的應用范圍，比如橫斷傷更適合于失神經后肌肉萎縮及神經再生的長期觀察[39-40]，而鉗夾傷則更傾向于PNI后運動、感覺等功能的短期修復[41-42]，卡壓傷則更方便于研究神經長期壓迫后引起的神經性疼痛[43-44]。因此，在模型復制過程中，應了解各模型的優(yōu)點和不足，根據(jù)實驗的需求復制合適的模型，取之所長，避之所短；另一方面，PNI模型仍需不斷完善，確保模型的一致性以便于定量定性分析，從而為臨床研究提供更多簡單易操作、評價指標客觀、重復性好的PNI模型。