胸腺上皮細(xì)胞發(fā)育分化的信號(hào)通路研究進(jìn)展①

陳昌蓉 宋銀宏（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原與免疫學(xué)系，感染與炎癥損傷研究所，宜昌443002）

胸腺屬于上皮-間質(zhì)組織，分為皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)，內(nèi)含基質(zhì)細(xì)胞和胸腺細(xì)胞［1］。胸腺微環(huán)境為T淋巴細(xì)胞增殖、分化和選擇性發(fā)育提供了場(chǎng)所。胸腺上皮細(xì)胞（thymus epithelial cells，TECs）是胸腺微環(huán)境最主要成分。根據(jù)表型和定位，TECs可分為皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞（cortical thymic epithelial cells，cTECs）和髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞（medullary thymic epithelial cells，mTECs）［2］。隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺在青春期以后會(huì)出現(xiàn)退化，而TECs數(shù)量減少、功能紊亂是胸腺退化的重要因素之一，可導(dǎo)致胸腺細(xì)胞發(fā)育、增殖缺陷以及外周T細(xì)胞功能障礙［3］。T細(xì)胞衰老使老年人更容易受到感染和癌癥的影響，若能重建T細(xì)胞，將防止或逆轉(zhuǎn)與老化相關(guān)的T細(xì)胞衰竭［4］。T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中與TECs相互作用，并涉及許多信號(hào)通路［5］。在細(xì)胞水平上可以將與TECs發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路分為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子核因子-κB（nuclear fac?tor kappa B，NF-κB）及其信號(hào)通路、細(xì)胞外信號(hào)分子骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，Bmp）、Wnt蛋白、音猬因子（sonic hedgehog，Shh）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）等及其相應(yīng)通路、其他類信號(hào)通路如視黃酸（retinoic ac?id，RA）、缺刻分子（notch）及相應(yīng)通路。研究TECs發(fā)育分化過(guò)程中涉及的重要信號(hào)通路將有助于更加全面理解胸腺微環(huán)境，為對(duì)抗胸腺退化和提高機(jī)體免疫力提供研究基礎(chǔ)。

1 調(diào)控TECs發(fā)育分化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路

1.1 轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子是高度保守的能識(shí)別DNA序列進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)［6］。在胚胎發(fā)育第11～12天，源自骨髓的淋巴樣祖細(xì)胞定植到胸腺組織，隨后進(jìn)行TECs的發(fā)育及分化［7］。第三咽囊TECs發(fā)育早期受到1組轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，其中主要包含同源盒基因3（homeotic genes 3，Hoxa3）、配對(duì)盒基因1/9（paired box genes 1/9，Pax1/9）、眼缺失基因（eyes absent gene，Eya1）、Six1/4（six gene 1/4）和T-盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子1（T-box transcription factor，Tbx1）［8-10］。在胚胎或出生后個(gè)體的胸腺中，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box）家族成員中的Foxn1在TECs發(fā)育階段中最為重要［11］。各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控Foxn1的表達(dá)及TECs的增殖、發(fā)育及分化。

1.2 NF-κB NF-κB家族包括NF-κB1（p105）、NFκB2（p100）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒致癌基因同源物A（reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，Re?lA）、RelB和c-Rel，這些轉(zhuǎn)錄因子形成同源和異源NF-κB/Rel二聚體，參與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、淋巴器官發(fā)育等不同的生物學(xué)過(guò)程［12］。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，κB抑制性蛋白（inhibitor of kappa-B，IκB）與NFκB/Rel二聚體結(jié)合組成異源多聚體，以無(wú)活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。在經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路中，多種刺激物可以激活I(lǐng)κB激酶（inhibitor of kappa B kinas?es，IKKs），使IκB磷酸化，并通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解，引起NF-κB1/RelA和NF-κB1/c-Rel異源二聚體的核易位以啟動(dòng)靶基因表達(dá)。而腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路能共同激活非經(jīng)典NF-κB通路。TNFR家族成員包括淋巴毒素β受體（lymphotoxinβ receptor，LTβR）、CD40和核因子κB受體活化子（re?ceptor activator of nuclear factor-κB，RANK）。當(dāng)這些受體分子接受相應(yīng)信號(hào)分子時(shí)，可以將信號(hào)轉(zhuǎn)給接頭蛋白TNF受體相關(guān)因子（TNF receptor associated factor，TRAF），TRAF隨后激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（nu?clear factor kappa Binducing kinase，NIK），活化后的NIK可以激活I(lǐng)KKα二聚體［13］。IKKα二聚體將NFκB2（p100）的羧基端殘基磷酸化后導(dǎo)致NF-κB2（p100）泛素化，進(jìn)而通過(guò)蛋白酶體加工成NF-κB2/p52并轉(zhuǎn)運(yùn)入胞核，啟動(dòng)細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、原癌基因（c-myc）等目的基因表達(dá)。

mTECs發(fā)育依賴于經(jīng)典NF-κB途徑，RelA、c-Rel激活后能直接調(diào)控RelB的表達(dá)，并最終調(diào)控mTECs分化；若TECs中的RelB完全失活，則導(dǎo)致機(jī)體的自身免疫疾?。?］。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，mTECs祖細(xì)胞接受LTβR信號(hào)傳導(dǎo)，激活非經(jīng)典NF-κB途徑 后RANK表 達(dá) 上 調(diào)［11，14］。RANK與 其 配 體（RANK ligand，RANKL）結(jié)合后，能刺激TECs增殖［15］。RIEMANN等人［16］揭示了經(jīng)典和非經(jīng)典NFκB通路之間建立mTECs自身免疫耐受的串?dāng)_機(jī)制，主要是通過(guò)誘導(dǎo)RelB的表達(dá)，共同作用并調(diào)控TECs的發(fā)育成熟，確保誘導(dǎo)T細(xì)胞的自身耐受。

1.3 組蛋白去乙?；? 組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 3，HDAC3）屬于Ⅰ類組蛋白去乙?；?，具有調(diào)控染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)的作用［17］。mTECs分化需要HDAC3的參與。GOLD?FARB等人［18］通過(guò)RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TECs及各個(gè)亞群都高表達(dá)HDAC3，當(dāng)條件性敲除TECs中的HDAC3后，mTECs幾乎完全消失。根據(jù)qPCR結(jié)果，依賴于HDAC3特異轉(zhuǎn)錄因子包括Pou2f3（pou class 2 ho?meobox 3）、神經(jīng)母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移因子（achaetescute complex homologue 1，AscL1）、FEZ家族鋅指蛋白2（FEZ family zinc finger 2，F(xiàn)ezf2）、Ehf（extended hartree-fock）和SpiB。此研究證實(shí)了HDAC3是調(diào)控TECs分化的強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄因子。

1.4 轉(zhuǎn)錄激活子3 新生鼠的胸腺髓質(zhì)區(qū)形成胰島樣結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，在出生幾周后融合成1個(gè)連續(xù)的結(jié)構(gòu)。除上述NF-κB信號(hào)參與mTECs發(fā)育以外，SATOH等［19］使用條件基因敲除鼠模型去除TECs中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transduc?er and activator of transcription 3，Stat3），證實(shí)Stat3介導(dǎo)的信號(hào)決定了髓質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而決定了出生后髓質(zhì)區(qū)的大小。

由以上可知，經(jīng)典以及非經(jīng)典NF-κB信號(hào)均能調(diào)控mTECs的發(fā)育。除了NF-κB信號(hào)以外，還有HDAC3和Stat3信號(hào)也能調(diào)控mTECs的發(fā)育。HDAC3是獨(dú)立于NF-κB信號(hào)來(lái)參與mTECs的整個(gè)發(fā)育過(guò)程，此外Stat3信號(hào)是新生鼠mTECs發(fā)育所必需的。

2 調(diào)控TECs發(fā)育分化的細(xì)胞外信號(hào)分子及其通路

2.1 Bmp信號(hào) Bmp是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transform?ing growth factor-β，TGF-β）超家族成員，在多種器官的形成和維持中發(fā)揮重要作用。Bmp信號(hào)通路主要由配體家族、受體以及下游信號(hào)分子Smads蛋白組成［20］。Bmp信號(hào)是由2個(gè)Ⅰ型Bmp受體和2個(gè)Ⅱ型Bmp受體組成的多聚體復(fù)合物傳遞，其中Ⅰ型和Ⅱ型Bmp受體是具有胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的單次跨膜蛋白。配體家族按照發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序分為Bmp、生長(zhǎng)分化因子（growth differentiation factor，GDF）、TGF、激活素（Activins）、Nodal和抗繆勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH），這些分子總稱為TGF-β超家族［21］。Smads是強(qiáng)有力的調(diào)控因子，其本身轉(zhuǎn)錄能力較弱，但卻能通過(guò)染色質(zhì)重塑和組織特異性機(jī)制轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。配體結(jié)合受體后，Ⅱ型Bmp受體磷酸化Ⅰ型受體，激活后的Ⅰ型受體招募并磷酸化受體調(diào)控Smads蛋白（receptor-regulat?ed smads，R-Smads）、Smad2和Smad3，進(jìn) 而通過(guò)Smad蛋白將細(xì)胞表面的信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，從而調(diào)控如Foxn1等靶基因表達(dá)［20］。

Bmp信號(hào)在TECs發(fā)育最早階段起重要作用［22］。體外分析Bmp4對(duì)胎兒胸腺器官培養(yǎng)物（fetal thymic organ culture，F(xiàn)TOC）中胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響，結(jié)果表明Bmp可阻滯胸腺細(xì)胞早期發(fā)育［23］。SWANN等人［24］使用Foxn1：Noggin轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過(guò)去除間質(zhì)區(qū)的Bmp信號(hào)后導(dǎo)致Foxn1在咽上皮細(xì)胞中的表達(dá)缺失，從而減少了胸腺中的功能性TECs的數(shù)量。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了胸腺生成早期階段的復(fù)雜性，并表明了Bmp信號(hào)與Foxn1協(xié)同作用決定了有功能活性的TECs數(shù)量。盡管了解到在胸腺發(fā)育過(guò)程中，Bmp4下游關(guān)鍵靶基因是Foxn1，但對(duì)于如何啟動(dòng)Foxn1以及后續(xù)的TECs發(fā)育過(guò)程還尚無(wú)報(bào)道。

由以上研究可知，Bmp信號(hào)通路不僅在胸腺細(xì)胞發(fā)育早期階段起作用，并且在TECs發(fā)育最早階段也同樣發(fā)揮重要作用。Bmp信號(hào)通路通過(guò)Foxn1靶基因調(diào)控TECs發(fā)育，但對(duì)于信號(hào)通路上下游具體的分子機(jī)制仍有待深入研究。

2.2 Wnt信號(hào) Wnt蛋白是一類分泌型的糖蛋白，在胸腺內(nèi)由TECs分泌，Wnt信號(hào)在動(dòng)物胚胎的器官發(fā)育、組織再生和其他生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［25］。Wnt信號(hào)通路主要成員有分泌蛋白Wnt家族、跨膜受體Frizzled家族、糖原合酶激酶3β（glyco?gen synthase kinase，GSK3β）、軸蛋白（Axin）、結(jié)腸腺瘤性息肉蛋白（adenomaous polyposis coli，APC）、β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）、以及T細(xì)胞因子（T-cell fac?tor，TCF）［26］。研究最多的是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，β-Catenin是此信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白。在沒有Wnt信號(hào)時(shí)，位于胞質(zhì)中的β-Catenin被Axin-APC-GSK3β形成的巨大蛋白復(fù)合體捕獲并被降解。當(dāng)Wnt與受體Frizzled和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6結(jié)合后，引起一系列下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，β-Catenin從Axin-APC-GSK3β降解復(fù)合物中釋放并積累于細(xì)胞質(zhì)中，然后進(jìn)入細(xì)胞核與TCF結(jié)合，從而激活下游Foxn1、c-myc、Cycin D1等靶基因的轉(zhuǎn)錄［27］。

與Bmp信號(hào)不同，Wnt信號(hào)主要促進(jìn)了TECs后期階段的發(fā)育［22］。HEINONEN等人［26］使用常規(guī)和突變小鼠模型，研究了Wnt4信號(hào)如何通過(guò)依賴于TECs機(jī)制調(diào)控胸腺的穩(wěn)態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt4通過(guò)促進(jìn)TECs及胸腺祖細(xì)胞的增殖來(lái)調(diào)控胸腺細(xì)胞的組成。LIANG、OSADA等［28-29］也報(bào)道，條件性基因敲除TECs中的β-Catenin或者過(guò)表達(dá)Wnt抑制劑都會(huì)導(dǎo)致胸腺萎縮。

由以上研究可知，Wnt信號(hào)通路在TECs發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如果阻斷該信號(hào)通路中關(guān)鍵的靶基因，那么胸腺的發(fā)育將受損。

2.3 Shh信號(hào) 哺乳動(dòng)物刺猬因子（hedgehog，Hh）家族成員包括Shh、印度刺猬因子（indian hedgehog，Ihh）和沙漠刺猬因子（desert hedgehog，Dhh），它們共享同1個(gè)信號(hào)通路，廣泛參與胚胎發(fā)育分化多個(gè)過(guò)程［30］。Shh信號(hào)主要由分泌型Shh配體、補(bǔ)綴同源物1（patched homolog，Ptch1）、平滑同源物（smoothened homolog，Smo）及下游的轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)聯(lián)癌基因同源物（glioma associated oncogene homolog，Gli）組成［31］。當(dāng)Hh蛋白與其細(xì)胞表面受體Ptch1結(jié)合后，即可解除正常情況下Ptch1對(duì)Smo的抑制，隨后，Smo進(jìn)入細(xì)胞，信號(hào)通路的末端是Gli1、Gli2和Gli3轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Hh信號(hào)通路激活時(shí)，Gli2和Gli3能激活靶基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)Hh信號(hào)通路失活時(shí)，Gli2和Gli3則阻止靶基因轉(zhuǎn)錄。

Shh信號(hào)在胸腺中表達(dá)后能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育，但對(duì)TECs的發(fā)育分化作用不明確。SALDNA等人［31］用Gli-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠模型，探討了胎兒和成年期胸腺中的Shh信號(hào)通路對(duì)TECs發(fā)育分化的影響。結(jié)果表明，Hh信號(hào)通路在胎兒和成年胸腺的TEC中均有表達(dá)并且轉(zhuǎn)錄活躍；如果胎兒胸腺的TECs缺失Shh信號(hào)，則TECs數(shù)量減少、mTECs相對(duì)于cTECs數(shù)量也明顯減少，并且cTECs和mTECs中的主要組織相容性復(fù)合物（major histo?compatibility complex，MHC）的表達(dá)均增加；Shh-/-、ShhcoKO以及Gli3-/-小鼠突變體條件性敲除成年小鼠TECs中的Shh也會(huì)引起TEC分化發(fā)生改變以及T細(xì)胞發(fā)育的變化，導(dǎo)致TECs數(shù)量、表達(dá)自身免疫調(diào)節(jié)因子的mTECs的比例減少［31］。

由以上研究可知，Shh信號(hào)通路在TECs內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)活躍、調(diào)控TECs尤其是mTECs的分化過(guò)程，以及調(diào)節(jié)cTECs和mTECs表面的MHCⅡ的表達(dá)。如果TECs缺失Shh，那么將引起TECs分化改變，進(jìn)而使胸腺發(fā)育不良。

2.4 FGF信號(hào) FGF在哺乳動(dòng)物中包括22種多肽，能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞遷移、增殖、分化、代謝以及神經(jīng)發(fā)育過(guò)程。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，F(xiàn)GF家族在小鼠和人類中存在7個(gè)亞家族，分別為FGF1、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF19亞家族［32］。除了FGF11亞類是作用于細(xì)胞內(nèi)以外，F(xiàn)GF能結(jié)合并激活4種跨膜酪氨酸激酶受體（FGFR1～FGFR4），引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而上皮細(xì)胞中主要表達(dá)FGFIIIb［33］。一旦FGF高親和力結(jié)合受體后，可激活不同信號(hào)通路，其中最為重要的信號(hào)通路為Ras-ERK 1/2信號(hào)通路［34］。此外，F(xiàn)GF可與其他信號(hào)分子相互作用，特別是Wnt信號(hào)，可共同參與組織再生過(guò)程。Shh和BMP同樣能和FGF相互作用控制肢體再生的過(guò)程［34］。

TECs發(fā)育分化后需要擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，這有利于形成完整的胸腺微環(huán)境。FGF又稱為角質(zhì)細(xì)胞形成因 子（keratinocyte growth factor，KGF）。FGF7、FGF10由胸腺成纖維細(xì)胞分泌，它們的共同受體為FGFR2IIIb，其可促進(jìn)TECs擴(kuò)增而不是分化過(guò)程。ERICKSON等［35］發(fā)現(xiàn)在重組激活基因（recombina?tion activating gene，RAG）敲除的小鼠中體內(nèi)注射重組KGF可以擴(kuò)大發(fā)育不良的髓質(zhì)小室，因此KGF和FGFR2IIIb信號(hào)傳導(dǎo)可以影響TECs發(fā)育和功能。另外，所有上述的BMP、Wnt、Hh和FGF細(xì)胞外信號(hào)還能在體外促進(jìn)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)胚層向表達(dá)Foxn1的TECs祖細(xì)胞方向分化［36-37］。

由上述可知，F(xiàn)GF主要是能使發(fā)育分化后的TECs數(shù)量擴(kuò)增，從而有利于形成穩(wěn)定的胸腺微環(huán)境。但是目前對(duì)于FGF信號(hào)通路的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

3 其他信號(hào)通路

除了上述細(xì)胞外分子和細(xì)胞內(nèi)分子及相關(guān)信號(hào)以外，非上皮組織中的其他外部信號(hào)也參與調(diào)控胚胎時(shí)期或出生后TECs發(fā)育過(guò)程。RA是調(diào)控TECs功能和胸腺生成的重要調(diào)節(jié)因子，去除TECs中RA信號(hào)后，cTEC和CD80loMHCⅡlomTECs中與上皮細(xì)胞增殖、發(fā)育與分化相關(guān)的基因表現(xiàn)出亞群特異性的改變；而且cTEC有明顯的增殖，這些改變導(dǎo)致胸腺細(xì)胞減少，幼年和成年小鼠的CD4、CD8單陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少［38］。同樣，Notch信號(hào)對(duì)于各種上皮細(xì)胞類型的分化至關(guān)重要，TECs表達(dá)各種Notch受體及下游的發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子（hairy/en?hancer-of-split related with YRPW motif 1，Hey1）和Hey2靶基因，這表明激活了未成熟TECs中的Notch信號(hào)，抑制TECs分化，當(dāng)依賴于Foxn1過(guò)度激活Notch1后會(huì)嚴(yán)重?fù)p害TECs發(fā)育，并使胸腺發(fā)育異常和萎縮［18，39］。研究表明通過(guò)Foxn1.Cre介導(dǎo)經(jīng)典Notch信號(hào)通路激活Rbpj（recombining binding pro?tein suppressor of hairless）的缺失發(fā)現(xiàn)TECs數(shù)量變化不明顯，表明TECs發(fā)育后期不需要Notch信號(hào)的參與［5］。與Wnt、BMP、Shh信號(hào)不同的是，Notch信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞間通訊發(fā)生的［40］。

由上可知，TECs發(fā)育分化需要細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外以及其他類信號(hào)分子的參與，它們相互協(xié)調(diào)并調(diào)控TECs發(fā)育和分化，最終促進(jìn)胸腺和T細(xì)胞的發(fā)育。

4 結(jié)語(yǔ)

TECs在胸腺微環(huán)境中扮演重要角色，cTECs能提供抗原對(duì)胸腺細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性選擇獲得MHC限制性識(shí)別能力，并且mTECs表達(dá)自身抗原對(duì)胸腺細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行陰性選擇，使其獲得中樞免疫耐受。與年齡相關(guān)的胸腺退化主要是由TECs缺陷引起的。因此，TECs可作為細(xì)胞治療的潛在有效靶點(diǎn)，糾正免疫紊亂及治療自身免疫性疾病，促進(jìn)TECs增殖，也是恢復(fù)衰老個(gè)體的胸腺微環(huán)境、促進(jìn)胸腺T細(xì)胞再生的最主要的驅(qū)動(dòng)因素。盡管TECs對(duì)T細(xì)胞發(fā)育不可忽視，但是TECs及亞群的發(fā)育分化的信號(hào)通路及串?dāng)_機(jī)制還有待更深入研究。TECs發(fā)育分化的研究，也必將對(duì)臨床中胸腺再生及自身免疫病提供更多有效的治療策略。