類風濕性關(guān)節(jié)炎大小鼠動物模型的研究進展

李愛民李曉娟李瑞生

(1.青島市第五人民醫(yī)院,風濕病科,山東 青島 266002； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心,臨床研究管理中心,北京 100039)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性自身免疫性疾病,主要以炎性滑膜炎為主,多見于多關(guān)節(jié)性和對稱性地侵襲手足小關(guān)節(jié),可造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞,出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形及功能喪失[1]。同時RA 還常累及關(guān)節(jié)外其他器官,血清中類風濕因子呈陽性及各種細胞因子和抗體均會發(fā)生變化,還會出現(xiàn)滑膜細胞增生及纖維化、血翳形成、骨和軟骨損害等一系列病理損傷過程[2]。 國內(nèi)RA 其成人的患病率為0.32%～0.36%,女性患者為男性患者的2～4 倍[3]。 該病程較長,如不及時治療,致殘率也較高,將會嚴重影響患者的生活質(zhì)量。 目前,對于RA 的發(fā)病原因和發(fā)病機制尚未完全明確,還沒有十分有效地靶向治療藥物。 為了能夠更好地了解RA 的發(fā)病機制,來建立與人類相似的RA 動物模型進行藥物篩選研究是非常關(guān)鍵的。 因此許多學者對RA 的動物模型進行了不斷地探討和研究,本文就目前比較成熟和穩(wěn)定的RA 大小鼠動物模型作以簡介,為今后進一步研究RA 疾病提供新的思路。

1 小鼠

1.1 誘導型小鼠模型

1.1.1 膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)

CIA 模型是最廣泛使用的RA 小鼠模型之一。膠原蛋白是一類具有活躍生物功能的細胞外間質(zhì)成分,其中Ⅱ型膠原(CⅡ)可誘導體內(nèi)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎性質(zhì)的自身免疫性反應(yīng)[4]。 建模方法是將牛CⅡ和完全弗氏佐劑(CFA)乳化后,在小鼠尾根部進行免疫注射后會出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹現(xiàn)象,一個多月后會達到高峰。 最常用的小鼠為DBA/1,張引紅等[5]采用DBA/1J 小鼠,利用牛CⅡ誘導構(gòu)建RA 模型,發(fā)現(xiàn)補骨脂素通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 細胞平衡及抑制TNFα、IL-6 和IL-1β 起到免疫調(diào)節(jié)作用,從而緩解RA進程。 而C57BL/6 小鼠對牛CⅡ誘導的關(guān)節(jié)炎具有抵抗性,如果改用雞的膠原蛋白即可。 王寧等[6]利用雞CⅡ誘導構(gòu)建RA 模型,便證實了濾泡輔助T細胞(Tfh 細胞)與RA 的發(fā)生和病情進展有密切關(guān)系。 但此類模型與RA 之間最顯著的差異是不存在類風濕因子。

1.1.2 抗原誘導的關(guān)節(jié)炎( antigen-induced arthritis,AIA)

AIA 模型首次在1977 年構(gòu)建,以研究誘導和持續(xù)性疾病中的體液和細胞免疫應(yīng)答[7]。 目前基本是在此基礎(chǔ)上進行了適當?shù)母牧肌?其造模方法是在股骨頭對應(yīng)的外部皮膚皮內(nèi)注射100 μg 甲基化牛血清白蛋白(mBSA)和CFA 混合液,并注入小鼠尾部和膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),從第1 天開始就會出現(xiàn)嚴重的關(guān)節(jié)炎癥狀,但持續(xù)3 d 后癥狀會逐漸減輕。 范凱健等[8]利用C57BL/6 小鼠將CIA 和AIA 造模情況進行了比較,發(fā)現(xiàn)CIA 造模成功率不高且嚴重程度差異較大,AIA 造模成功率高但維持時間較短。

1.1.3 膠原抗體誘導的關(guān)節(jié)炎(collagen antibody induced arthritis,CAIA)

CAIA 模型是給予內(nèi)毒素(LPS)和單克隆抗體混合物誘導而成,廣泛用于研究自身免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制和評估治療[9]。 采用的單克隆抗體混合物主要是由3 個IgG2a(A2-10、F10-21、D8-6)和IgG2b(D1-2G)組成,通過識別位于CⅡ的CB11 片段(CⅡ124-402)來誘導CAIA 的產(chǎn)生[10]。 研究表明CAIA 的易感性與MHC 不相關(guān),但其發(fā)病率和嚴重程度均較低[11]。 此模型易感品系為C57BL/6 小鼠,需用濃度為10 mg/mL 的小鼠抗CⅡ誘導,可以在幾天內(nèi)誘導持續(xù)嚴重的關(guān)節(jié)炎[12]。 Hutamekalin等[13]發(fā)現(xiàn),LPS 劑量降低,既能引發(fā)關(guān)節(jié)炎,又能降低LPS 的毒性作用。 該模型成模時間短且發(fā)病率高而被研究者廣泛應(yīng)用。

1.1.4 蛋白聚糖誘導的關(guān)節(jié)炎(proteoglycaninduced arthritis,PGIA)

PGIA 模型是將蛋白聚糖(PG)腹腔注射于遺傳易感性小鼠誘導產(chǎn)生嚴重的慢性關(guān)節(jié)炎[14]。 造模方法：采用佐劑將軟骨蛋白多糖乳化后,分別在0 d,21 d,42 d 對小鼠進行腹腔注射,4 周以后可誘導糜爛性關(guān)節(jié)炎[14]。 對于人PG 易感的小鼠有BALB/c、C3H 和C57BL/6J 小鼠,雌性更敏感。 雖然首選人PG,但其提取和純化過程比較復(fù)雜,還涉及倫理問題。 因此Ishikawa 等[15]采用牛PG 評估發(fā)現(xiàn)在雌性BALB/c 小鼠中的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率最高,但其發(fā)生率仍然低于人PG 誘導的RA 模型。

1.1.5 遲發(fā)性過敏性關(guān)節(jié)炎( delayed-type hypersensitivity arthritis,DTHA)

DTHA 為近年來發(fā)展的關(guān)節(jié)炎模型,在C57BL/6 小 鼠 中 其發(fā) 病率 為100%。 Atkinson 等[16]將mBSA 與CFA 的混合物和CⅡ抗體注射C57BL/6小鼠尾部,在第4 天靜脈注射CⅡ抗體和第7 天皮下注射含有mBSA 的PBS 于右腳底部,再過3～7 d,小鼠足爪迅速出現(xiàn)嚴重關(guān)節(jié)炎癥狀,約14 d 后炎癥消退。 Tanaka 等[17]將mBSA 與低劑量的CⅡ聯(lián)合皮下注射于BALB/c 小鼠尾部,再用mBSA 在足爪局部加強。 具有發(fā)病率高和差異性小等優(yōu)點,但DTHA 模型屬于自限性,與RA 的慢性進展性特點不相符。

1.1.6 葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase,GPI)誘導關(guān)節(jié)炎

2001 年SchaHer 等[18]首次報道了GPI 與RA有關(guān)。 韓曉芳等[19]在DBA/1 小鼠體內(nèi)使用GPI 誘導RA 模型,從第35 天開始,足趾出現(xiàn)輕微的腫脹,關(guān)節(jié)紅腫、畸形,并伴有活動障礙,為深入研究GPI在RA 發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了實驗平臺。

1.1.7 萊姆病螺旋體誘導的關(guān)節(jié)炎

研究者從萊姆病螺旋體中分離出來的細菌經(jīng)背部皮下注射于敏感的C3H、C57BL/6 和BALB/c小鼠背部給予免疫,也可以建立RA 小鼠動物模型。

1.1.8 鏈球菌細胞壁誘導的關(guān)節(jié)炎(streptococcal cell wall-induced arthritis,SCWA)

SCW 可誘導急性的小鼠關(guān)節(jié)炎模型,一般注射幾小時后,炎性因子就會出現(xiàn)高表達。 在此基礎(chǔ)上,研究者通過改進在小鼠關(guān)節(jié)腔進行一次或多次注射SCW 片段(n≥3),可誘導出慢性小鼠的關(guān)節(jié)炎[20]。 易感品系有：BALB/c、DBA/1 和C3H 小鼠。而C57BL/6 是抵抗品系。

1.2 轉(zhuǎn)基因型小鼠

研究報道白介素和TNF(腫瘤壞死因子)家族中的部分成員在RA 炎癥因子中發(fā)揮著重要的作用。 因此除了誘導型小鼠RA 模型,轉(zhuǎn)基因型小鼠RA 模型也多有報道。

1.2.1 K/BxN 小鼠(K/BxN TCR-tg)模型

K/BxN 小鼠是一種自發(fā)性關(guān)節(jié)炎,該小鼠在出生后3～5 周即能自發(fā)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎[20]。 由于該小鼠具有與人類RA 相似性高、發(fā)病率高和重復(fù)性好的特點,有望成為研究RA 發(fā)病機制很好的動物模型[21]。 近年來研究者利用K/BxN 小鼠誘導出K/BxN STA 模型以研究RA 發(fā)生的免疫機制。 建模方法：在正常小鼠體內(nèi)可注射K/BxN 小鼠血清,就會出現(xiàn)一過性的關(guān)節(jié)炎臨床癥狀,一般在10 ～14 d 后會達到峰值,隨后在幾周內(nèi)逐漸減退,可重復(fù)注射血清來維持模型的持久性和穩(wěn)定性[21]。

1.2.2 TNF-α 轉(zhuǎn)基因小鼠模型

TNF-α 轉(zhuǎn)基因小鼠是植入人的TNF-α 的動物模型,在正常小鼠體內(nèi)如植入從轉(zhuǎn)基因小鼠提取的成纖維樣滑膜,可高表達出人的TNF-α,呈現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的臨床特征。 該小鼠模型開始先用C57BL/6×CBA雜交,再與DBA/1 回交,呈現(xiàn)出更明顯的臨床特征,說明DBA/1 與TNF-α 聯(lián)合作用可加重RA[22-23]。該模型從3 ～4 周齡開始便伴有踝關(guān)節(jié)腫脹,9 周左右出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞。 該小鼠優(yōu)點：具有遺傳因素、病程進展呈慢性炎癥、病情穩(wěn)定。 研究者利用本小鼠開展了中醫(yī)藥對關(guān)節(jié)炎的治療以及比較本小鼠與CIA 模型之間的差異等研究[24-25]。

1.2.3 SKG 小鼠模型

SKG 小鼠依賴于BALB/c 背景,其ZAP-70 基因位點發(fā)生突變而培育出來的,是高度依賴IL-17 及其它細胞因子的表達、具有隱形突變基因的自發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型[26]。 模型特點：與人類的RA 相似、小關(guān)節(jié)對稱性炎癥、類風濕性因子升高和進行性關(guān)節(jié)破壞等特點。 該模型還呈現(xiàn)關(guān)節(jié)外病變?nèi)绶窝?、皮炎?而被廣泛用來評估藥物對RA 中骨骼變化的作用。

1.2.4 IL-1 受體拮抗劑敲除小鼠模型

該小鼠一般在出生后5 ～8 周會自發(fā)發(fā)展為關(guān)節(jié)炎。 臨床上常出現(xiàn)炎性浸潤和生成血管翳等特點。 該模型動物必須選用BALB/c 小鼠,對于其他品系的小鼠復(fù)制不出來。

2 大鼠

RA 大鼠動物模型分為西醫(yī)大鼠疾病動物模型和中醫(yī)病證結(jié)合模型兩大類。

2.1 RA 西醫(yī)大鼠疾病動物模型

2.1.1 膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)CIA 是構(gòu)建大鼠RA 模型中最常用的方法之一。 造模方法：先用異種或同種CⅡ與IFA 多部位皮內(nèi)注射,1 周后腹腔注射加強免疫[27]。 在致敏7 d 后,踝關(guān)節(jié)會輕度腫脹和皮膚發(fā)紅,3 周后癥狀加重,甚至皮膚發(fā)生潰瘍；5 ～6 周后病理改變進一步加重,關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)均受血管翳的侵蝕和破壞[28]。 易感動物有BB、DA、DR 和LEW 大鼠。關(guān)麗等[29]通過不同劑量阿司匹林預(yù)處理后再使用牛CⅡ誘導RA,發(fā)現(xiàn)高劑量阿司匹林處理后的大鼠腸道通透性比低劑量的高,且高劑量處理后更能誘發(fā)形成RA。 吳菁等[30]同樣使用牛CⅡ建立的CIA模型,驗證了無論在體內(nèi)還是體外DMY 均對脾臟中免疫相關(guān)T 淋巴細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用,進而對全身性炎癥反應(yīng)起到抑制作用。

2.1.2 佐劑誘導的關(guān)節(jié)炎(adjuvant Arthritis,AA)AA 模型是最廣泛使用的大鼠RA 模型,有IFA和CFA 兩種類型。 首先對液體石蠟與無水羊毛脂按一定比例混合成的混合液進行高壓滅菌,如果不加卡介苗的即為IFA,加卡介苗的為CFA[31]。 模型特點：造模方法簡單易行,模型一般于致炎后10～20 d 出現(xiàn)續(xù)發(fā)炎性癥狀,約在20 d 達到高峰。 炎癥表現(xiàn)以踝關(guān)節(jié)為重,可侵及足墊和全足。 該模型的關(guān)節(jié)腫脹癥狀與臨床RA 患者具有相似性,但會出現(xiàn)免疫功能紊亂現(xiàn)象。 AA 大鼠模型在我國被廣泛用于RA 的臨床藥物和治療研究。 田時志等[32]用Wistar 大鼠構(gòu)建AA 模型,驗證了溫針灸可有效減輕炎性反應(yīng),緩解大鼠后肢腫脹,可能與IL-1、TNF-α和血清免疫球蛋白水平下降有關(guān)。 王建等[33]建立SD 大鼠AA 模型,驗證了蓍草總倍半萜內(nèi)酯具有較好的治療大鼠RA 作用,這可能與下調(diào)炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平有關(guān)。

2.1.3 二甲基雙十八烷基銨(DDA)誘導的關(guān)節(jié)炎(DDA induced arthritis,DIA)

該模型多采用Lewis 和DA 大鼠,皮下注射2 mg 溶于磷酸緩沖液的DDA 溴化物時,可誘導輕度多關(guān)節(jié)炎；如混合IFA 后注射,可復(fù)制重癥關(guān)節(jié)炎。主要表現(xiàn)為發(fā)病關(guān)節(jié)滑膜充血、細胞浸潤和軟骨破壞等癥狀[28]。 此模型具有發(fā)病率低和炎癥較輕的特點。

2.1.4 鏈球菌細胞壁誘導的關(guān)節(jié)炎(SCWA)

SCWA 是將A 群鏈球菌與其他細菌的肽聚糖-多聚糖混合液,注射于大鼠腹腔內(nèi),24 h 后即可出現(xiàn)明顯的急性關(guān)節(jié)炎癥狀[34]。 常用雌性的Lewis(LEW/N)大鼠,誘導后期可演變成長期慢性關(guān)節(jié)炎[34]。

2.1.5 礦物油誘導的關(guān)節(jié)炎(oil induced arthritis,OIA)

OIA 是一種基因限制性、獨特的大鼠關(guān)節(jié)炎。選擇較敏感的DA 大鼠于尾部皮下注射IFA 形成的動物模型。 一般于注射后14 d 出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀,關(guān)節(jié)腫脹較其他類型的關(guān)節(jié)炎輕[35]。 OIA 與CIA 表現(xiàn)幾乎相同,但不產(chǎn)生CII 的抗體。 同時還出現(xiàn)IL-2、IFN-γ 及TNF-α 高表達[36]。

2.1.6 輔劑誘導的關(guān)節(jié)炎

誘導方法：將IFA 結(jié)合滅活Mtb 進行敏感大鼠尾部皮下注射,連續(xù)14 d,一般在免疫后8 ～12 d 出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀,幾周后疾病進展迅速,可發(fā)展為破壞性關(guān)節(jié)炎。 最易感大鼠品系為DA 或LEW 大鼠。該模型與人類的RA 比較相似。

2.1.7 Avridine 誘導的關(guān)節(jié)炎

研究者是將Avridine 注射于LEW 大鼠尾部所建立的大鼠關(guān)節(jié)炎模型。 雌性大鼠較雄性的癥狀更明顯更嚴重。 研究表明裸鼠對Avridine 誘導的關(guān)節(jié)炎有所抵抗[37]。 該模型主要用于輔劑或先天免疫方面的研究。

2.1.8 軟骨低聚體基質(zhì)蛋白(COMP)誘導的關(guān)節(jié)炎

COMP 可誘導嚴重的關(guān)節(jié)炎并出現(xiàn)對稱性外周關(guān)節(jié)受累。 造模方式：主要將等體積的COMP 溶液與完全佐劑混合乳化后,皮內(nèi)注射于敏感大鼠尾巴根部。 易感品系有DA 和LEW 大鼠。 但該模型缺點是穩(wěn)定性差[38]。

2.1.9 樸日斯烷誘導的關(guān)節(jié)炎(pristante-induced arthritis,PIA)

該模型是將樸日斯烷(pristane)300 μL 皮下單獨注射于敏感大鼠尾部,注射2 ～3 周后,產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎癥狀,該模型可持續(xù)數(shù)個月。 易感大鼠為DA 和LEW 大鼠。 疾病的發(fā)展可通過大體觀察每個關(guān)節(jié)的腫脹程度來監(jiān)測分析[39]。

2.2 中醫(yī)病證結(jié)合RA 動物模型

中醫(yī)稱RA 為“痹證”“歷節(jié)”或“鶴膝風”[40]。隨著國內(nèi)中醫(yī)中藥研究的不斷發(fā)展,單純西醫(yī)疾病動物模型不能很好地模擬RA 與中醫(yī)證候間的關(guān)系,因此研究者在CIA 和AA 模型的基礎(chǔ)上,加入中醫(yī)致病因素,模擬RA 的中醫(yī)證候進行模型復(fù)制[41]。 這樣可以彌補單純西醫(yī)疾病動物模型不能模擬中醫(yī)證候與RA 之間關(guān)系的缺點。

2.2.1 風濕熱郁和風寒濕痹RA 動物模型

中醫(yī)認為RA 發(fā)病的主要原因是外邪(風熱與風寒),而易侵襲人體。 熊艷杰等[42]通過冷水冷風外加注射CFA 建立風濕寒癥型RA 動物模型,發(fā)現(xiàn)滑膜區(qū)域有T 淋巴細胞和巨噬細胞浸潤,其中T 淋巴細胞是主要免疫細胞,淋巴細胞與RA 局部滑膜組織的損傷無關(guān)。

2.2.2 瘀血痹阻RA 動物模型

瘀血痹阻是臨床上RA 患者的常見中醫(yī)證型之一,血瘀常貫穿于RA 發(fā)生發(fā)展的整個過程,患者常因血脈瘀阻、血行不暢而表現(xiàn)出疼痛位置固定、疼痛如針刺狀、皮下見瘀點瘀斑,舌下絡(luò)脈曲張等特點。 研究者通過改變外在環(huán)境因素構(gòu)建出血瘀證動物模型。 李茜等[43]選取Wistar 大鼠經(jīng)5℃～7℃水中游泳處理,同時在大鼠不同部位皮下注射CⅡ醋酸和弗氏完全佐劑混合液,可建立血瘀證大鼠RA 模型。 李征等[44]的大鼠模型實驗證實了加CPP的佐劑混合組比不加CPP 單純組其自身抗體的含量會更高。

2.2.3 腎虛RA 大鼠模型

該大鼠模型在臨床上主要表現(xiàn)為骨骼和關(guān)節(jié)的損傷,該模型主要應(yīng)用于以中醫(yī)為主方式來探討RA 疾病的藥物評價。 王燕等[45]通過實驗證實了SD 大鼠是最適合來制作腎虛型RA 大鼠模型的動物。 陶黎等[46]采用去卵巢和CII 免疫誘導的方法也建立了腎虛關(guān)節(jié)炎模型,證明了腎虛可加重關(guān)節(jié)炎從而引起骨質(zhì)疏松,使用中藥益腎蠲痹丸可相應(yīng)減輕關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)破壞程度。

2.2.4 脾虛RA 大鼠模型

脾是人體中非常重要的器官之一,脾虛則會出現(xiàn)氣血不足,加重體內(nèi)濕氣,建立脾虛RA 大鼠模型模擬人的脾虛癥侯來研究探討其發(fā)病機制。 杜中平等[47]利用利血平和CII 混合物所復(fù)制的脾虛RA大鼠模型,結(jié)果證實該模型可反映出脾虛證RA 病人的發(fā)病特點,具有一定的可行性。

以上不同證型的RA 中醫(yī)動物模型是病證結(jié)合動物模型的探索和進步,既考慮了西醫(yī)病因又具有中醫(yī)癥候和臨床表現(xiàn),在RA 中西醫(yī)結(jié)合研究和治療過程中發(fā)揮著重要的作用[48]。

3 總結(jié)與展望

近年來所建立的各種大小鼠RA 動物模型,通過不斷地優(yōu)化和篩選也趨于穩(wěn)定,其中以CIA 小鼠模型和AA 大鼠模型應(yīng)用最為廣泛。 CIA 小鼠模型主要應(yīng)用于RA 治療機制及免疫反應(yīng)方面的研究,但縱觀上述介紹的RA 動物模型,均存在一定局限性,不能完全模擬人類的臨床癥狀。 中醫(yī)病證結(jié)合動物模型也僅僅實現(xiàn)了“病”與“證”的簡單疊加,無法復(fù)制出中醫(yī)證候的復(fù)雜程度和具體特點,模型的可靠性和成功率極其不穩(wěn)定[49]。 因此到目前為止還未有一種動物模型可以囊括人類RA 發(fā)病的所有特征。

理想的RA 模型應(yīng)具有易操作性、穩(wěn)定性、創(chuàng)傷性小、病死率低、模型成功率高以及術(shù)后不影響動物的運動功能等優(yōu)點[50]。 研究者在探究RA 發(fā)病相關(guān)機制和臨床癥狀的同時,更需對RA 模型從病理和免疫學方面進行全方位的評估,同時還應(yīng)借助現(xiàn)代醫(yī)學影像技術(shù),提高觀察的準確性和可靠性,為今后的RA 動物模型的進一步探討以及RA 的臨床治療藥物研究提供堅實的理論依據(jù)。