運(yùn)用基因調(diào)控技術(shù)探析膜聯(lián)蛋白A2 的病理作用

賈夢(mèng)真黃巖杰楊曉青韓紅艷張建江

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科,鄭州 450099；3.河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046； 4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科,鄭州 450052)

膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)分子量為36×103,含有三個(gè)不同的功能區(qū)域：N 端區(qū)域,C 端區(qū)域和核心區(qū)域[1]。 核心區(qū)域由四個(gè)重復(fù)的氨基酸序列組成,它們緊密堆積形成一個(gè)具有凹面和凸面的彎曲結(jié)構(gòu),凸面含有膜結(jié)合必需的鈣和磷脂結(jié)合位點(diǎn),N 端結(jié)構(gòu)域位于核心結(jié)構(gòu)的凹面,含有組織型纖溶酶原激活劑(tPA)和p11(S100A10 的片段)結(jié)合位點(diǎn),C 端區(qū)域包含F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白,肝素和纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)[1-2]。 ANXA2 廣泛分布于各種真核細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列與鈣調(diào)蛋白相關(guān)的活動(dòng),包括增殖、分化、凋亡、遷移、膜修復(fù)和炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞進(jìn)程[3]。人ANXA2 是最早實(shí)現(xiàn)克隆的ANX 家族成員之一,在人類疾病學(xué)方面研究最廣泛[4]。 既往報(bào)道ANXA2 在多種腫瘤中過表達(dá),參與癌癥的發(fā)生發(fā)展,涉及多種機(jī)制,并與預(yù)后不良密切相關(guān)[5]。 我們先前研究顯示ANXA2 在參與腎小球細(xì)胞性新月體形成的上皮細(xì)胞中高表達(dá),在伴有新月體病變的紫癜性腎炎患兒尿中的濃度也明顯增高,拓展了對(duì)ANXA2 病理作用的認(rèn)識(shí)[6]。 本文通過綜述運(yùn)用基因調(diào)控技術(shù)敲低、敲除和過表達(dá)ANXA2 的相關(guān)研究,以期更全面地總結(jié)ANXA2 的病理作用及其相關(guān)作用機(jī)制,并精準(zhǔn)探尋可能的臨床診療靶點(diǎn)。

1 基因調(diào)控技術(shù)在研究ANXA2 功能中的應(yīng)用

近年來,基因調(diào)控技術(shù)廣泛應(yīng)用于ANXA2 功能研究。 基因敲除或敲低的技術(shù)包括siRNA(smallinterfering RNA)技術(shù)、shRNA(short hairpin RNA)技術(shù)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats ( CRISPR )/CRISPR-associated ( Cas ) 9,CRISPR/Cas9)技術(shù)。 因ANXA2 在多種疾病中過表達(dá),有關(guān)探究ANXA2 功能的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多采用siRNA 干擾技術(shù)降低ANXA2 表達(dá)水平。 靶向ANXA2 的siRNA 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,通過RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)機(jī)制與ANXA2 mRNA 互補(bǔ)結(jié)合,從而引起目標(biāo)mRNA 降解,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或生物體ANXA2 基因沉默[7-8]。 但siRNA 技術(shù)存在脫靶率問題,在基因敲除實(shí)驗(yàn)中不能完全敲除目標(biāo)基因。 在細(xì)胞核內(nèi)合成的shRNA 可由Drosha 酶處理后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),并經(jīng)Dicer 酶將shRNA 加工成siRNA,shRNA 誘導(dǎo)的基因沉默較siRNA 更持久[7]。 通過將敲除ANXA2基因的胚胎干細(xì)胞注射至胚泡,并植入假孕小鼠的子宮中,經(jīng)嵌合體雜交育種可產(chǎn)生穩(wěn)定敲除ANXA2的小鼠[9]。 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是新興的基因編輯技術(shù),通過sgRNAs 序列特異性互補(bǔ)并切割靶DNA,導(dǎo)致基因部分序列缺失,精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)基因敲除[10]。 但應(yīng)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)靶向ANXA2 的研究較少。 目前多采用構(gòu)建靶向ANXA2 基因的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)[11]。

2 敲低或敲除ANXA2

2.1 敲低ANXA2 可抑制細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和增生

細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有上皮表型的細(xì)胞失去極性和粘附性等上皮特征,轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型的細(xì)胞[12]。 目前,與ANXA2 相關(guān)的EMT 報(bào)道主要涉及腫瘤 增 殖、 侵 襲、 遷 移 方 面。 胰 腺 導(dǎo) 管 腺 癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)是一種破壞性惡性疾病,ANXA2 屬于PDA 相關(guān)抗原,細(xì)胞表面ANXA2 的表達(dá)隨著PDA 的進(jìn)展而增加。 Zheng等[13]通過建立小鼠PDA 模型證實(shí)了ANXA2 在細(xì)胞表面的定位依賴于酪氨酸23(Tyr-23)位點(diǎn)磷酸化,并可通過Rho 介導(dǎo)PDA 細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)EMT。敲低ANXA2 或使用抗ANXA2 抗體可有效抑制PDA轉(zhuǎn)移并提高模型小鼠存活率,為開發(fā)靶向ANXA2抑制劑治療人PDA 提供了理論依據(jù)[13]。 在鼻咽癌中,Chen 等[14]通過將靶向ANXA2 的shRNA 導(dǎo)入TW01 和BM1 鼻咽癌細(xì)胞系,建立特異性敲低ANXA2 細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)敲低ANXA2 可抑制TGF-β 誘導(dǎo)的Snail/Twist 癌癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),抑制鼻咽癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程,從而減少細(xì)胞侵襲、遷移,同時(shí)可提高放射治療和化學(xué)治療敏感性。 2018 年,Rocha 等[15]基于對(duì)敲低ANXA2 的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞研究,提出TGF-β 可通過其受體激活Src 介導(dǎo)ANXA2 磷酸化,磷酸化的ANXA2 一方面促進(jìn)E-鈣粘蛋白內(nèi)化,下調(diào)E-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄,另一方面結(jié)合并激活STAT3,同時(shí)誘導(dǎo)STAT3 磷酸化,磷酸化的STAT3 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,上調(diào)EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug 的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)波形蛋白和金屬蛋白酶MMP2/9 的表達(dá)[16]。

ANXA2 可在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部位介導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)功能。 細(xì)胞質(zhì)中的ANXA2 在蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和Src 激酶介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)N 端絲氨酸25(ser-25)和Tyr-23 位點(diǎn)磷酸化后,經(jīng)鈣離子載體或鈣誘導(dǎo)劑移至細(xì)胞表面[17]。2019 年,Fan 等[18]研究表明,活化的蛋白激酶C 受體1(RACK1)是ANXA2 和Src 激酶的共受體,可介導(dǎo)兩者結(jié)合,促進(jìn)ANXA2 磷酸化。 EGFR 由細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)C 端酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成,Chaudhary 等[19]發(fā)現(xiàn)在三陰性和赫賽汀耐藥的乳腺癌細(xì)胞中,大量易位至細(xì)胞膜表面的ANXA2與EGFR 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合,在表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)誘導(dǎo)下導(dǎo)致EGFR 同源二聚化和酪氨酸激酶區(qū)域自磷酸化后脫離細(xì)胞膜內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。 內(nèi)化過程依賴于脂質(zhì)筏對(duì)EGFR 的內(nèi)吞作用,而ANXA2 作為Ca2+依賴性膜結(jié)合蛋白,在富含膽固醇和/或磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸酯域中與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用,可調(diào)節(jié)脂質(zhì)筏形成[20]。 研究者利用抗ANXA2 抗體阻斷細(xì)胞表面ANXA2 功能可抑制EGF 誘導(dǎo)的EGFR 同源二聚化、酪氨酸磷酸化、內(nèi)化和EGFR 介導(dǎo)的下游AKT和ERK 信號(hào)通路,從而抑制三陰性和赫賽汀耐藥乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移[19]。 Wang 等[21]提出磷酸化的EGFR 可引起細(xì)胞質(zhì)ANXA2 Tyr-23 位點(diǎn)磷酸化,觸發(fā)STAT3 途徑。 使用shRNA 在表達(dá)EGFR 的上皮樣乳腺癌細(xì)胞系T47D 細(xì)胞中穩(wěn)定敲低ANXA2,可抑制ANXA2 介導(dǎo)的STAT3 Tyr-705 磷酸化,降低STAT3 活化和核轉(zhuǎn)位,阻斷EMT 的發(fā)生發(fā)展,表明ANXA2 可通過STAT3 依賴性方式促進(jìn)EGF 誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT。 在宮頸癌細(xì)胞中,敲低ANXA2 可部分逆轉(zhuǎn)EGF 誘導(dǎo)的CaSki 宮頸癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程,并抑制CaSki 細(xì)胞活力和遷移[22]。 上述結(jié)果表明ANXA2 在EMT 進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,可能成為潛在的治療靶點(diǎn)。 同時(shí)也證明了ANXA2可在EGFR 信號(hào)通路的上游和下游發(fā)揮不同的作用,在EGF 誘導(dǎo)的EMT 信號(hào)通路中具有上通下聯(lián)的關(guān)鍵功能。

2.2 敲低ANXA2 抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)順鉑耐藥細(xì)胞的藥物敏感性

ANXA2 作為引物識(shí)別蛋白參與DNA 復(fù)制[2],并通過不同的途徑參與細(xì)胞周期進(jìn)程。 Wang 等[23]發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮下注射ANXA2 缺陷型人肺腺癌A549 細(xì)胞(shANXA2-A549)懸浮液的BALB/c 裸鼠的背側(cè)腫瘤結(jié)節(jié)明顯小于對(duì)照組,用siRNA 敲低體外培養(yǎng)的A549 細(xì)胞的ANXA2,同樣細(xì)胞增殖明顯受到抑制。 進(jìn)一步證明敲低ANXA2 可抑制JNK/c-Jun 通路,并誘導(dǎo)p53 及其下游凋亡基因如p21 表達(dá),引起細(xì)胞周期G2 期停滯,從而抑制細(xì)胞增殖[23]。 Zhang等[24]用shANXA2 慢病毒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系T47D 和MDA-MB-231,獲得穩(wěn)定敲低ANXA2 的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)敲低ANXA2 抑制EGF 誘導(dǎo)的STAT3 磷酸化,進(jìn)而降低細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)水平。ANXA2 也是一種RNA 結(jié)合蛋白,可與原癌基因cmyc mRNA 的3′UTR 結(jié)合,從而導(dǎo)致其核周定位及與細(xì)胞骨架結(jié)合,并促進(jìn)c-myc 蛋白的合成[5]。 Cmyc 在促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,Cyclin D1 是c-myc 的下游因子,也是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵促進(jìn)因子,可延遲細(xì)胞G1 到S 期轉(zhuǎn)變,抑制癌細(xì)胞增殖[5]。

順鉑是非小細(xì)胞肺癌患者的常用藥,主要通過與相關(guān)DNA 上的嘌呤相互作用,激活數(shù)個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑造成DNA 損傷和線粒體凋亡并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,然而治療過程中伴隨的細(xì)胞凋亡作用減弱可能是腫瘤細(xì)胞獲得順鉑耐藥性的關(guān)鍵特征[25-26]。Feng 等[27]通過體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性與ANXA2 調(diào)控的JNK/c-Jun/p53 途徑中p21 等凋亡基因的異常表達(dá)密切相關(guān),敲低ANXA2 增加了凋亡細(xì)胞數(shù)量,可部分恢復(fù)已耐藥細(xì)胞的藥物敏感性。 ANXA2 也可作為凋亡細(xì)胞表面C1q 的配體誘導(dǎo)自身裂解,抑制細(xì)胞周期促進(jìn)凋亡[27]。 因此,ANXA2 基因可能用作耐藥性非小細(xì)胞肺癌的重要治療靶標(biāo)。

2.3 敲低ANXA2 降低博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化

博來霉素是一種臨床應(yīng)用廣泛的抗癌藥物,然而其誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生率高達(dá)46%,嚴(yán)重限制了博來霉素的臨床使用和治療效果。 博來霉素誘導(dǎo)的肺毒性涉及氧化應(yīng)激和其引起的DNA 損傷,從而引起炎癥反應(yīng)。 2018 年一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),生理狀態(tài)下ANXA2 可通過肌動(dòng)蛋白促進(jìn)噬菌體裝配參與自噬過程[28]。 在小鼠肺部感染模型中,ANXA2 可通過肺泡巨噬細(xì)胞中的AKT-雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)途徑調(diào)節(jié)自噬[29]。 2018 年,Wang 等[28]利用CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法證明了在A549 細(xì)胞中ANXA2 的Glu139位點(diǎn)可直接與博萊霉素二糖片段的酰胺基結(jié)合,二者的結(jié)合可抑制TFEB(轉(zhuǎn)錄因子EB)誘導(dǎo)的自噬通量,進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化。 2019 年Lei 等[30]證明博來霉素可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞中ANXA2 向細(xì)胞表面易位,并激活整合素連接激酶/核因子-κB(ILK/NFκB)途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 同時(shí)將博來霉素經(jīng)氣管注射至缺失ANXA2 小鼠中14 d 后,通過Masson 染色和羥脯氨酸(膠原蛋白的標(biāo)志物)定量分析證明,低表達(dá)ANXA2 小鼠肺間質(zhì)厚度及胸膜下膠原沉積明顯小于對(duì)照組,NF-κB 磷酸化以及p65、IL-6 和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎性因子表達(dá)水平降低[30]。 因此,ANXA2 可通過與博來霉素結(jié)合抑制自噬,促進(jìn)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)肺纖維化,下調(diào)ANXA2 的表達(dá)可能是降低博來霉素所致肺部毒副作用的有效方案。

2.4 敲低ANXA2 抑制炎癥

TNF-α 是TNF 超家族成員,介導(dǎo)一系列免疫反應(yīng),在炎癥性腸病的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。 去整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinases,ADAM)17 是裂解TNF-α 前體的關(guān)鍵酶,參與多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[31]。 為了明確ANXA2 是否參與TNF-α 裂解脫落,Tsukamoto 等[32]在單核細(xì)胞和結(jié)腸上皮細(xì)胞系中運(yùn)用siRNA 分別敲低ANXA2或ADAM,均顯著地抑制了細(xì)胞中TNF-α 的裂解脫落。 Tsukamoto 等[32]又運(yùn)用免疫沉淀蛋白印跡法證實(shí)ANXA2 可直接結(jié)合并激活A(yù)DAM17,被激活的ADAM17 裂解TNF-α 的前體,使TNF-α 的釋放增加,從而加重炎癥反應(yīng)。 因此,抑制ANXA2 可能是減少TNF-α 脫落,防治炎癥性腸病炎癥的新治療策略。

2.5 敲低ANXA2 減少細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體水平，增加高膽固醇血癥發(fā)生率

文獻(xiàn)顯示,前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9 型(proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9,PCSK9)的催化結(jié)構(gòu)域可與低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)的EGF-A 結(jié)構(gòu)域結(jié)合,在酸性條件下經(jīng)由內(nèi)體/溶酶體能有效誘導(dǎo)肝LDLR 降解,較低水平的肝LDLR 降低了血漿中低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 的清除率,導(dǎo)致高膽固醇血癥[33-34]。 ANXA2 基因位于染色體15q22.2 上,由13 個(gè)外顯子組成,ANXA2 的R1 結(jié)構(gòu)域由外顯子4e6 編碼,外顯子4e6 具有8 個(gè)報(bào)告的單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism, SNP ),rs11633032 和rs17191344 為SNP 的功能性突變體,與LDL-C 水平正相關(guān),其次要等位基因可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn),抑制ANXA2 基因表達(dá)[35]。ANXA2 通過其R1 域與PCSK9 富含半胱氨酸-組氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合發(fā)揮PCSK9 功能的內(nèi)源性抑制劑作用,ANXA2 單體和四聚體均可抑制PCSK9 對(duì)細(xì)胞表面LDLR 的降解活性,降低高膽固醇血癥發(fā)生率[35]。 Ly 等[34]發(fā)現(xiàn)用shANXA2 轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh7 敲低ANXA2 細(xì)胞,可減輕ANXA2 對(duì)PCSK9 C 末端結(jié)構(gòu)域M1 和/或M2 的抑制作用,使PCSK9 mRNA 在該細(xì)胞中翻譯增加,加速對(duì)LDLR降解,升高循環(huán)LDL-C 水平,證實(shí)敲低ANXA2 解除了對(duì)PCSK9 活性的抑制作用,提高了高膽固醇血癥風(fēng)險(xiǎn)。

3 過表達(dá)ANXA2

3.1 過表達(dá)ANXA2 加速纖溶酶產(chǎn)生導(dǎo)致腫瘤新血管生成及出血性疾病

p11 是鈣結(jié)合蛋白S100A10 的片段,在細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化的驅(qū)動(dòng)下,兩個(gè)p11 的C 末端結(jié)構(gòu)域可與兩個(gè)ANXA2 單體的N 末端氨基酸結(jié)合形成異源四聚體[36]。 錨定于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的ANXA2 四聚體是纖溶酶原和tPA 的共同受體,當(dāng)ANXA2 過表達(dá)時(shí)可加速纖溶酶產(chǎn)生,并激活多種MMP(如MMP2,MMP9)參與下游蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜溶解,釋放內(nèi)皮細(xì)胞以及基質(zhì)中的血管生成調(diào)節(jié)劑(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子),啟動(dòng)血管生成系統(tǒng)[5,37]。 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見和致命的腦腫瘤,Maruo 等[38]將犬神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系J3T 經(jīng)皮下植入無胸腺小鼠中,6 周后分別在腫瘤中收集到J3T-1 和J3T-2 細(xì)胞系,經(jīng)檢測(cè)J3T-1 細(xì)胞系中ANXA2 表達(dá)水平高于J3T-2 細(xì)胞系,并且J3T-1 細(xì)胞主要聚集在腫瘤邊界處的擴(kuò)張血管周圍,而J3T-2細(xì)胞則表現(xiàn)出彌散的單細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍正常的腦實(shí)質(zhì)中,沒有新血管生成。 Onishi 等[39]用ANXA2 編碼質(zhì)粒載體(pIRES-EGFP)轉(zhuǎn)染J3T-2 細(xì)胞建立過表達(dá)ANXA2 的J3T-2 細(xì)胞系,并將其接種在無胸腺大鼠中28 d 出現(xiàn)腦腫瘤,在腫瘤中心觀察到新血管生成而致血管擴(kuò)張,同時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子的表達(dá)明顯升高。 2020 年一項(xiàng)最新的研究表明,在三陰性乳腺癌細(xì)胞中外泌體ANXA2 也可促進(jìn)新血管生成[40]。 總之,以上結(jié)果表明過表達(dá)ANXA2 可通過促進(jìn)血管生成因子表達(dá)誘導(dǎo)血管生成。

ANXA2 過表達(dá)時(shí),纖溶酶合成量過高可致周圍組織受損,甚至引發(fā)出血,其中以急性早幼粒細(xì)胞白血病最具代表性。 其細(xì)胞具有特征性染色體易位t(15； 17),也稱為早幼粒細(xì)胞白血病/視黃酸受體α(PML/RARα)融合基因[41]。 PML/RARα 融合蛋白激活A(yù)NXA2 啟動(dòng)子上調(diào)ANXA2 mRNA,過表達(dá)的ANXA2 可通過翻譯后調(diào)控導(dǎo)致p11 表達(dá)的增加,加速合成的ANXA2 四聚體促進(jìn)纖溶酶以異常高的速率產(chǎn)生,大量活性纖溶酶在血漿中累積,最終導(dǎo)致急性早幼粒細(xì)胞白血病出血性并發(fā)癥[41]。然而,He 等[42]提出纖溶酶可特異性激活Toll 樣受體4 信號(hào)途徑誘導(dǎo)PKC 活化,啟動(dòng)ANXA2 的ser-11 和ser-25 位點(diǎn)磷酸化,使四聚體解離,游離的p11 受到蛋白酶體依賴性多泛素化和降解,可阻止ANXA2 向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移,從而保持ANXA2 單體和四聚體的精確劃分。 纖溶酶的這種“反饋”機(jī)制可以限制自身的生成,從而維持血管纖溶系統(tǒng)平衡。

3.2 過表達(dá)ANXA2 促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖

據(jù)報(bào)道G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)可感知氨基酸的刺激,也可激活PKC 和蛋白激酶A(PKA),同時(shí)兩個(gè)蛋白激酶參與介導(dǎo)ANXA2 磷酸化,而激素是刺激牛乳合成和牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)增殖的最重要因素[43]。 因此,激素刺激下ANXA2 與乳蛋白合成和BMEC 增殖密切相關(guān)。Osorio 等[44]認(rèn)為氨基酸如甲硫氨酸可誘導(dǎo)mTOR途徑相關(guān)蛋白磷酸化,對(duì)牛乳蛋白合成有積極作用。 2018 年, Zhang 等[43]為 了 研 究ANXA2 與BMEC 增殖和牛乳合成的分子機(jī)制,利用pcDNA3.1-ANXA2 構(gòu)建體轉(zhuǎn)染BMEC 過表達(dá)ANXA2。 結(jié)果顯示,在氨基酸及雌激素刺激下,BMEC 中過表達(dá)的ANXA2 正向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇 3 - 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)產(chǎn)生PIP3,進(jìn)而刺激mTOR 磷酸化,并增加固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c ( sterol response element-binding protein-1c,SREBP-1c) 和Cyclin D1 表達(dá)水平,經(jīng)由PI3KmTOR-SREBP-1c/Cyclin D1 信號(hào)通路促進(jìn)BMEC 增殖,合成乳蛋白、脂肪和乳糖等乳汁原料,加速乳汁合成[43]。 正如前所述,ANXA2 可能通過影響細(xì)胞周期因子促進(jìn)增殖過程。

3.3 過表達(dá)ANXA2 參與多種病毒生命周期

文獻(xiàn)顯示,ANXA2 單體和四聚體可通過病毒-膜融合的內(nèi)吞機(jī)制參與人乳頭瘤病毒、腸道病毒71、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒的附著和滲入細(xì)胞內(nèi),參與多種靶向上皮細(xì)胞的病毒裝配、復(fù)制和釋放等過程,也是促進(jìn)體外流感病毒復(fù)制的前病毒宿主因子,在加速高致病性禽流感病毒H5N1 的復(fù)制中起著重要作用[45-46]。 2019 年一篇文獻(xiàn)顯示,非結(jié)構(gòu)蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)是一種多功能蛋白,包含兩個(gè)不同的功能域：N 端RNA 結(jié)合域和C 末端效應(yīng)域,效應(yīng)域與宿主蛋白相互作用,抑制宿主免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)病毒感染過程[47]。 為了研究ANXA2 與NS1 在禽流感病毒H5N1 復(fù)制中的具體作用機(jī)制,Ma 等[46]利用RT-PCR 擴(kuò)增A549 細(xì)胞的ANXA2 基因,然后將其克隆到pCAGGS-HA 載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-ANXA2,再用質(zhì)粒及GD1322(H5N1 菌株)轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞24 h,檢測(cè)到子代病毒滴度顯著增加。 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明ANXA2 可作為NS1 的靶分子,并與NS1 C 末端效應(yīng)域相互作用,加速病毒復(fù)制。 細(xì)胞凋亡是抵抗病毒感染的宿主防御機(jī)制,NS1 與p53 結(jié)合可抑制細(xì)胞凋亡,基于ANXA2 和NS1 之間的相互作用以及p53的潛在拮抗作用,NS1 可能作為橋接分子促進(jìn)ANXA2 和p53 結(jié)合以抑制細(xì)胞凋亡[46]。

4 總結(jié)

ANXA2 可作用于EMT 進(jìn)程的不同位點(diǎn),在EGFR 介導(dǎo)的EMT 信號(hào)通路中具有上通下聯(lián)的作用。 ANXA2 具有博來霉素的結(jié)合靶點(diǎn),兩者的結(jié)合可抑制自噬通量,進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化。 作為支架蛋白,Tyr-23 位點(diǎn)磷酸化是ANXA2 由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞表面移位的關(guān)鍵環(huán)節(jié),ANXA2 四聚體可促進(jìn)纖溶酶生成,裂解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜,釋放血管生成調(diào)節(jié)劑促進(jìn)新血管生成。 此外,ANXA2 還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、炎癥和膽固醇代謝,參與病毒生命周期復(fù)制、凋亡等過程。 綜上所述,運(yùn)用基因調(diào)控技術(shù)精準(zhǔn)揭示了ANXA2 的病理作用,拓展了對(duì)ANXA2 作用機(jī)制的認(rèn)識(shí),有助于探索針對(duì)ANXA2 的腫瘤早期診斷和靶向治療,也有助于建立其他非腫瘤疾病的治療策略。