低氧誘導(dǎo)因子在主動脈瘤形成中的作用*

劉欣如，馬雨濤，于寶琪，2△，曲愛娟，2

（1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京100069；2首都醫(yī)科大學(xué)重塑相關(guān)心血管疾病教育部重點實驗室，北京100069）

1 主動脈瘤概述

主動脈瘤（aortic aneurysm，AA）通常被定義為主動脈直徑≥30 mm的永久性和不可逆的血管局部擴張［1］。根據(jù)病灶部位的不同，主動脈瘤可分為擴張位于膈肌以下的腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）和膈肌以上的胸主動脈瘤（thoracic aortic aneurysm，TAA）［2］。AA具有高發(fā)病率與高死亡率。近20年來，AAA在60歲以上男性發(fā)病率在4%～7.6%［3］，TAA每年10.4人/10萬人［2］，在中國AAA破裂導(dǎo)致的死亡率高達80%以上［4］。目前臨床上對于AA的治療除了手術(shù)修復(fù)外，尚無特效藥物可以根治。因此，深入探究其病理生理學(xué)發(fā)病機制，有助于定位該病的治療靶點，并在發(fā)病早期就能起到有效的防治作用［5］。

主動脈血管壁中彈性纖維和膠原纖維的降解和斷裂使腹主動脈壁彈性和擴張強度顯著下降，導(dǎo)致動脈壁局限性膨出成瘤。降解彈性纖維和膠原纖維的酶類活性增高，以及分泌以上酶類的炎癥細胞在動脈壁浸潤增加，都是導(dǎo)致AAA形成的重要因素。TAA的發(fā)病常與某些遺傳性疾病如馬凡綜合征、埃-當(dāng)綜合征、家族性動脈瘤等相關(guān)。此外，吸煙、高血壓、慢性阻塞性肺疾病等也是主動脈瘤的易患因素［2，6］。目前大量研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致TAA或AAA的通路有所不同，然而研究二者的相似之處與相互聯(lián)系可能在探索疾病發(fā)病機制上更有意義。

2 AAA的發(fā)病機制

AAA的病理生理學(xué)機制主要包括彈性蛋白斷裂、炎癥反應(yīng)與血管新生、氧化應(yīng)激增加、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）減少等［1，7-8］。

2.1 細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）與正常主動脈相比，AAA血管壁內(nèi)膜增厚，中膜彈性纖維明顯降解、退化［9］。早期研究發(fā)現(xiàn)，AAA病人瘤體組織中彈性蛋白酶活性升高，提示可能與AAA血管壁中彈性纖維降解有關(guān)［1，10］。目前認為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族和絲氨酸蛋白酶家族［1］主要與AAA進展相關(guān)：除MMP-2和MMP-9早已被證實在AAA發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用［11-12］，近期發(fā)現(xiàn)，Mmp-3-/-小鼠經(jīng)血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）誘導(dǎo)后，AAA的發(fā)病率較野生型小鼠大大降低，主動脈的擴張程度和彈性蛋白斷裂程度均明顯降低，提示MMP-3活性升高可能促進AAA的發(fā)生發(fā)展［13］。另外，絲氨酸蛋白酶，如纖溶酶不僅能通過黏附蛋白降解ECM，還能促進VSMCs的凋亡，并激活MMPs前體，從而促進AAA的發(fā)生發(fā)展［1］。

2.2 炎癥反應(yīng)與血管新生血管壁全層慢性炎癥細胞浸潤是AAA的典型特征之一。巨噬細胞、CD3+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞和中性粒細胞等炎癥細胞在AAA病變周圍的內(nèi)膜、中膜的微血管中浸潤尤為明顯。這些炎癥細胞不僅分泌MMPs，還介導(dǎo)損傷性免疫反應(yīng)，如巨噬細胞可以表達MMP-9、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-8等，從而造成ECM的損傷［1，9］。

生理條件下，主動脈中膜沒有毛細血管，是免疫隔離部位。而在病理狀態(tài)下，炎癥細胞可以依靠新生毛細血管進入主動脈壁的ECM［1］。研究發(fā)現(xiàn)，AAA血管壁從內(nèi)膜到中膜有大量微血管分布，微血管中血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）——VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3表達增加，在微血管內(nèi)部及周圍可見血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）——VEGF-A+或VEGF-C+細胞，提示血管新生是AAA發(fā)病的重要機制之一［9］。

2.3 氧化應(yīng)激增加氧化應(yīng)激是AAA免疫適應(yīng)反應(yīng)的主要決定因素。人類AAA相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)中自由基的主要來源有粒細胞分泌的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和髓過氧化物酶，以及腹主動脈腔內(nèi)血栓中殘留的紅細胞釋放的還原性鐵，它們可能導(dǎo)致主動脈內(nèi)皮細胞和VSMCs的凋亡與壞死［1］。有研究報道，抑制氧化應(yīng)激可以降低MMP-2的活性，從而降低Ang II誘導(dǎo)的低密度脂蛋白受體基因敲除（low-density lipoprotein receptor gene knockout，Ldlr-/-）小鼠AAA的病變嚴(yán)重程度［14］，提示強烈的氧化應(yīng)激可通過提高MMP-2活性促進AAA的發(fā)展。

2.4 VSMCs凋亡VSMCs數(shù)量減少是AAA的關(guān)鍵組織學(xué)特征［15］。早期研究發(fā)現(xiàn)，AAA患者的瘤體組織中層存在大量凋亡的VSMCs。此外，浸潤在AAA血管壁中的巨噬細胞和T淋巴細胞可以通過分泌細胞因子、穿孔素、Fas/FasL等細胞毒性介質(zhì)促進VSMCs凋亡［16］，提示VSMCs的數(shù)量減少還與免疫細胞毒性作用相關(guān)。另外，前文所述纖溶酶、彈性蛋白酶等也能引起VSMCs凋亡［1］。由于VSMCs還可分泌彈性纖維和膠原纖維，ECM在VSMCs附近合成并成熟，所以在AAA中，上述引起VSMCs細胞數(shù)量減少的因素還可進一步導(dǎo)致ECM的修復(fù)受損［1，16］。

3 低氧誘導(dǎo)因子家族

在主動脈瘤形成及發(fā)展過程中，由于附壁血栓的形成與瘤壁動脈粥樣硬化改變，影響血氧彌散，將不可避免的影響動脈壁的供氧。低氧誘導(dǎo)因子家族作為機體應(yīng)對低氧過程的關(guān)鍵調(diào)控元件，其在主動脈瘤發(fā)病過程中的作用逐漸受到人們的關(guān)注。

低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是一種與DNA特定序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，是誘導(dǎo)低氧基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，能夠促進機體細胞適應(yīng)缺血性組織和實體腫瘤等多種缺氧環(huán)境［17-18］。HIF是由α亞基和β亞基組成的異二聚體，兩種亞基都是basic helix-loop-helix（bHLH）-PAS超家族的成員［19］。HIF-α家族包括HIF1α、HIF2α和HIF3α三個成員，HIF-β亞基即HIF1β，又被稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT），其基因定位于人1號染色體q21區(qū)，在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，起結(jié)構(gòu)性作用［20］。HIF1α和HIF2α都是典型的缺氧感受器［17］，包含2個專門的反式激活域NTAD和CTAD，可作為轉(zhuǎn)錄激活子［21］激活機體在缺氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)的反應(yīng)［22］。HIF1α主要通過激活編碼胞漿和線粒體蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，抑制線粒體的生物發(fā)生和氧化功能，促進線粒體的自噬清除，從而減少氧消耗［17］。HIF2α也稱為內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1（endothelial PASdomain protein 1，EPAS1），是促紅細胞生成素合成的主要驅(qū)動因子，可以通過促進過氧化物酶體的自噬清除減少機體氧消耗［17］。HIF1α和HIF2α在急性缺氧時迅速積累，在缺氧后6～8 h之間顯著升高，可能協(xié)同調(diào)控或競爭轉(zhuǎn)錄靶點［23］。HIF1由分子量為120 kD的HIF1α和分子量為91、93或94 kD的HIF1β組成［24］，HIF2由HIF2α和HIF1β組成，HIF1與HIF2參與基因的激活轉(zhuǎn)錄，在多種組織中廣泛表達［20］。HIF3是由HIF3α和ARNT組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，與HIF1α和HIF2α相比，人們對HIF3α的了解更少，這在一定程度上是由于HIF3α存在多種變異體，因此闡明HIF3的功能也變得非常具有挑戰(zhàn)性［21，25-26］。之前的研究認為HIF3α主要通過競爭性結(jié)合其他HIFα亞基來抑制缺氧反應(yīng)［20，26］，近期的研究表明，當(dāng)HIF3α的其中一個變異體HIF3α2與HIF1或HIF2共表達時，更有可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)而不是抑制效應(yīng)，提示HIF3可能是一個在缺氧反應(yīng)中有雙重作用的轉(zhuǎn)錄因子［26］。目前對HIF作用途徑的研究主要集中在HIF1和HIF2上，HIF3是一個相對未知的缺氧反應(yīng)調(diào)控因子。有證據(jù)表明，HIF3是最大化誘導(dǎo)EPO的mRNA和蛋白表達水平所必需的轉(zhuǎn)錄因子［26］，通常只在高度缺血的組織，如角膜中表達［20］。

研究表明，正常主動脈未見HIF1α表達，但在AAA血管壁內(nèi)膜、中膜的細胞核及細胞質(zhì)中HIF1α均有表達，且胞核、胞漿強表達HIF1α的巨噬細胞同時也表達VEGF-C、MMP-9等，提示HIF在AAA的發(fā)病通路中可能起到重要作用［9，15］。

4 HIF與AAA

4.1 HIF1α與ECM在Ang II和β-氨基丙腈誘導(dǎo)的小鼠主動脈瘤模型中，與野生型小鼠相比，平滑肌細胞Hif1a特異性敲除小鼠的AA（包括AAA和TAA）發(fā)生率更高，腹主動脈彈性纖維的斷裂和破壞更為廣泛，主動脈中的總彈性蛋白（包括交聯(lián)彈性蛋白和非交聯(lián)彈性蛋白）、成熟交聯(lián)彈性蛋白的體積更小。其機制可能是在平滑肌細胞Hif1a特異性敲除的小鼠中調(diào)控彈性蛋白交聯(lián)和凝聚的關(guān)鍵酶——賴氨酰氧化酶（lysyloxidase，LOX）的活性受到抑制。然而，MMP-2活性及金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的表達在兩組中沒有明顯差異，提示在VSMCs中特異性敲除Hif1a可以通過抑制VSMCs功能、抑制LOX活性等方式，破壞彈性纖維的形成，增加AA的發(fā)生率，但不改變彈性纖維的降解能力［27］。

4.2 HIF1α與MMPsMMP-2在遠離氧源的部位表達，意味著缺氧條件可能使MMP-2活化。研究發(fā)現(xiàn)，在正常人主動脈血管壁中HIF1α幾乎不表達，而在AAA患者中，HIF1α的表達主要集中在主動脈中膜及炎癥浸潤區(qū)，與MMP-2的定位一致［28］。當(dāng)人主動脈內(nèi)皮細胞中過表達HIF1α?xí)r，可明顯上調(diào)MMP-2和MMP-9水平。因此，臨床上對AAA患者應(yīng)謹慎使用增強HIF1α的藥物。反之，應(yīng)用HIF1α抑制劑——2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）或地高辛后，Ang II誘導(dǎo)的HIF1α、VEGF、MMP-2和MMP-9的高表達水平明顯被抑制，高脂血癥小鼠AAA的發(fā)生率和嚴(yán)重程度也隨之降低［29］。

在Ang II誘導(dǎo)載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein Egene knockout，ApoE-/-）小鼠AAA模型中，體內(nèi)水平沉默Hif1a基因后，MMP-2和MMP-9活性、彈性纖維斷裂和ECM破壞程度均明顯減低，AAA瘤體直徑減小，提示沉默Hif1a基因可通過降低MMPs活性減輕Ang II誘導(dǎo)的AAA的發(fā)生發(fā)展［15］。而在髓系Hif1a特異性敲除小鼠AAA模型中，瘤體直徑更大，發(fā)生嚴(yán)重AAA的比例更高，主動脈彈性纖維的斷裂程度和降解程度更高，組織中TIMPs的表達明顯下調(diào)。TIMPs可以抑制MMPs活性，盡管該研究未顯示MMPs的活性出現(xiàn)對應(yīng)上調(diào)，但TIMP1和TIMP3表達下調(diào)可能與AAA形成加劇有關(guān)，說明髓系HIF1α對ECM的保護作用主要是通過調(diào)節(jié)TIMPs實現(xiàn)的［30］。但是，如上文所述平滑肌細胞源性HIF1α的缺乏不影響MMP-2的活性［27］，提示在AA形成過程中，不同細胞源性的HIF1α作用是不同的，有待更深入的研究。

4.3 HIF與炎癥反應(yīng)和血管新生在許多疾病中，HIF1α都扮演一個調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血管新生的重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在AAA小鼠模型中沉默Hif1a，其巨噬細胞浸潤于主動脈中膜和外膜的數(shù)量明顯減少，炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的表達明顯降低，主動脈血管壁內(nèi)的新生血管數(shù)量明顯減少，其中VEGF-A以及血管內(nèi)皮生長因子相關(guān)的酪氨酸激酶1的分泌降低，提示Hif1a基因沉默減弱了AAA中炎癥反應(yīng)及抑制新生血管的形成。由此推測，應(yīng)用HIF1α抑制劑可能通過以上機制抑制AAA的發(fā)生發(fā)展［15］。同理，盡管髓系Hif1a特異性敲除小鼠的AAA組織中巨噬細胞浸潤程度高，但其可抑制AAA發(fā)病進程，提示髓系HIF1α可能通過降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮對主動脈的保護作用［30］。

目前關(guān)于HIF2α與主動脈瘤的相關(guān)研究還較少。有研究發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染HIF1α和HIF2α可明顯促進牛主動脈內(nèi)皮細胞的活化，增強細胞黏附能力，促進黏附分子的表達，同時活化的內(nèi)皮細胞可通過旁分泌的形式促進野生型內(nèi)皮細胞的遷移和成管能力，并在體內(nèi)促進血管新生，提示HIF1α和HIF2α在血管形成過程中具有累積作用［31］。此外，有研究報道，在肺動脈高壓患者和動物模型中均發(fā)現(xiàn)HIF2α及其靶基因表達水平上調(diào)，給予HIF2α抑制劑C76可明顯抑制肺動脈高壓動物的血管重塑進程，由此推論HIF2α抑制劑有望成為治療存在嚴(yán)重血管重構(gòu)的肺動脈高壓患者的新型藥物［32］。

4.4 HIF1α與VSMCs與正常主動脈相比，病人的主動脈中膜HIF1α的表達明顯上調(diào)，與人主動脈VSMCs的凋亡率呈正相關(guān)，而與增殖相關(guān)的星形膠質(zhì)細胞升高基因1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）的表達水平降低，提示HIF1α可能通過下調(diào)AEG-1的表達促進VSMCs的凋亡［33］。另有體外實驗證實，缺氧（3%O2）刺激能誘導(dǎo)HIF1α在人臍動脈血管平滑肌細胞中的表達與活化，而抑制HIF1α可以下調(diào)巨噬細胞游走抑制因子的表達，從而抑制VSMCs的遷移和增殖［34］。因此，HIF1α可能通過促進VSMCs的凋亡，影響ECM結(jié)構(gòu)的完整性而加劇主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。

VSMCs有收縮型和分泌型2種表型，收縮型VSMC的增殖和遷移能力較差，標(biāo)志物有α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和平滑肌蛋白22α（smooth muscle 22α，SM22α）等；分泌型VSMC增殖、遷移和合成細胞外基質(zhì)的能力強，生物標(biāo)志物包括骨橋蛋白（osteopontin，OPN）等。VSMCs的表型轉(zhuǎn)化是影響主動脈血管壁結(jié)構(gòu)與功能的重要因素。正常成人動脈中以收縮型VSMC為主。研究發(fā)現(xiàn)，過表達HIF1α后，收縮型VSMCs標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達明顯降低，而分泌型標(biāo)志物OPN明顯升高，提示HIF1α能改變VSMCs的表型，使其從收縮型轉(zhuǎn)為分泌型，從而影響主動脈壁結(jié)構(gòu)，參與主動脈瘤的發(fā)病過程［33］。

5 TAA的發(fā)病機制

在TAA的病理組織學(xué)特征中，除了彈性纖維的破壞、丟失等，還有蛋白多糖沉積明顯增加［2］，尤其是聚集蛋白聚糖（aggrecan）和多能蛋白聚糖（versican）［35］。大約20%的TAA表現(xiàn)為家族性、常染色體單基因顯性遺傳，而AAA則未明顯表現(xiàn)出這種遺傳特征［36］。一些基因的突變已被認為是導(dǎo)致TAA形成的 原 因，包 括ACTA2、TGFBR1、TGFBR2、FBN1、MYH11、SMAD3、MLCK和TGFB2等［37］。

有研究顯示，TAA患者血清中長鏈非編碼RNA HIF1α反義RNA 1（HIF1α-antisense RNA 1，HIF1AAS1）的表達較對照組顯著增高，而主動脈中膜和VSMCs中brahma-related gene 1（BRG1）的水平明顯增高，在VSMCs過表達BRG1，HIF1A-AS1的表達水平也隨之上調(diào)，導(dǎo)致促凋亡蛋白caspase-3上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，VSMCs凋亡更為顯著，說明在TAA中HIF1A-AS1的表達受BRG1正性調(diào)節(jié)，在VSMCs的增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用，從而影響TAA的發(fā)生發(fā)展［38-40］。

6 前景展望

目前，大量研究證實HIF1α可以通過調(diào)節(jié)彈性纖維的形成、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達及活性、血管平滑肌細胞的數(shù)量與表型、炎癥反應(yīng)與血管新生等多種途徑參與腹主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程。由于目前的研究表明系統(tǒng)性HIF1α活性降低對腹主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展有抑制作用，故HIF1α抑制劑有望在未來主動脈瘤的防治工作中起到關(guān)鍵作用。值得注意的是，不同細胞源性的HIF1α對主動脈瘤的形成與發(fā)展可能有不同的作用，這一點有待更加深入的研究。此外，在血管領(lǐng)域，HIF2α與血管新生及血管重塑的研究日臻成熟，而HIF3作為低氧誘導(dǎo)因子家族中具有負向調(diào)節(jié)能力的因子，均使二者在主動脈瘤的發(fā)病機制中成為重要的靶標(biāo)因子，很可能成為臨床上的防治主動脈瘤發(fā)生發(fā)展的新靶點。