靈芝多糖抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展①

李亞晗 劉佳琳 王天添 劉玟妍 孫麗媛 李明成（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 132013）

靈芝（G.lucidum）具有補(bǔ)益、益氣、強(qiáng)心等神奇的藥用功效，幾千年來一直被用作促進(jìn)身體健康、永葆青春活力、延年益壽的良藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明靈芝具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗血糖、抗?jié)?、抗癌和免疫刺激作用，尤其是它被認(rèn)為是癌癥的一種替代性輔助療法［1‐2］。靈芝含有多種成分，例如糖蛋白、多糖、三萜、類萜、倍半萜、類固醇、生物堿、苯并吡喃衍生物和苯甲酸衍生物，它還包含一些礦物質(zhì)，例如鉀、鈣、磷、鎂、硒、鐵和鋅［3］。研究發(fā)現(xiàn)靈芝的抗癌特性主要歸因于其多糖和三萜。靈芝多糖（ganoderma lucidum polysaccha-ride，GLP）由（1→3）、（1→6）‐α/β‐葡聚糖、糖蛋白和水溶性雜多糖組成。GLP通過多種機(jī)制，如抗增殖、促凋亡、抗轉(zhuǎn)移、抗血管生成、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，通過抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)患者的免疫功能來執(zhí)行抗癌作用［4］。

宿主免疫監(jiān)視在識別和摧毀癌變的宿主細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用，因此免疫治療已成為癌癥防治的主要策略之一［5］。越來越多的研究表明，GLP部分通過刺激免疫功能發(fā)揮抗癌作用。這主要歸因于GLP可以激活T和B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和天然殺傷（natural killer cell，NK）細(xì)胞，它促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)吞噬作用，增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。本文將重點討論GLP的免疫調(diào)節(jié)抗癌作用及其潛在機(jī)制。

1 靈芝多糖對固有免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用

1.1 GLP對巨噬細(xì)胞的影響巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的“吞噬者”，吞噬并消化凋亡細(xì)胞和病原體（稱為吞噬作用），并產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子［5］。GLP的體內(nèi)治療會激活肉瘤S180小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，例如IL‐1β，TNF‐α和一氧化氮（NO）。GLP顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。同樣，GLP在體外激活巨噬細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中增加各種細(xì)胞因子的水平，包括IL‐1β、腫瘤壞死因子（TNF）‐α、IFN‐γ和IL‐6［6］。GLP是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌MAPKs和Syk依賴性TNF‐α和IL‐6的誘導(dǎo)因子。Dectin‐1受GLP刺激，但類似Toll樣受體4（TLR4）的信號傳導(dǎo)并不參與GLP的生物學(xué)活性［7］。然而，TLR4的信號傳導(dǎo)是否參與GLP的生物活性是有爭議的，因為GLP被發(fā)現(xiàn)直接與TLR4、B細(xì)胞細(xì)胞膜Ig（membrane Ig，mIg）、7S核糖體蛋白和bZIP增強(qiáng)劑結(jié)合，并通過TLR4傳遞某些信號。除了GLP對上述細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)的影響外，GLP還誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL‐1的表達(dá)，這在一定程度上與其抗癌活性有關(guān)。GLP可上調(diào)人巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞IL‐1的分泌，上調(diào)IL‐1前體pro‐IL‐1和IL‐1轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)［8］。這歸因于蛋白酪氨酸激酶/蛋白激酶C/MEK1/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和蛋白酪氨酸激酶/Rac1/p21激活激酶/p38途徑的激活［9］。

1.2 GLP對NK細(xì)胞的影響與細(xì)胞毒性T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞在沒有抗體和主要組織相容性復(fù)合物的情況下可以識別應(yīng)激細(xì)胞，從而加快免疫反應(yīng)，因此NK細(xì)胞對先天免疫至關(guān)重要［10］。結(jié)果表明，GLP可使人臍血單個核細(xì)胞中CD14+CD26+單核/巨噬細(xì)胞、CD83+CD1a+DCs和CD16+CD56+NK細(xì)胞的數(shù)量分別增加2.9、2.3和1.5倍。此外，GLP能將NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性提高31.7%。口服靈芝提取物可增加1型T輔助細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IL‐6和IFN‐γ）的水平，并增強(qiáng)BALB/c小鼠的NK細(xì)胞活性和吞噬作用［11］。GLP部分與TLR‐4受體結(jié)合，激活ERK、c‐Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK。GLP可刺激小鼠脾細(xì)胞IL‐1、IL‐6、IL‐12、IFN‐γ、TNF‐α、粒細(xì)胞‐巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM‐CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M‐CSF）的表達(dá)［12］。GLP可增加小鼠脾臟DCs、CD4、CD8、調(diào)節(jié)性T、B和NK細(xì)胞的數(shù)量。低劑量GLP減輕了環(huán)磷酰胺引起的小鼠體重、NK活性、IFN‐γ產(chǎn)生和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性的降低，并抑制由于環(huán)磷酰胺給藥引起的IL‐4水平的異常升高或降低［13］。慢性給藥2.5 mg/kg GLP可加速骨髓細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、脾臟NK細(xì)胞和NK細(xì)胞的恢復(fù)，增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖反應(yīng)。增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和細(xì)胞毒性，并無明顯副作用［14］。因此，低劑量GLP治療可以加速免疫抑制小鼠從白細(xì)胞減少、骨髓抑制和免疫抑制中恢復(fù)，這對癌癥化療是有益的。

1.3 GLP對DC細(xì)胞的影響DC細(xì)胞是重要的專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞，對于啟動輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的初次免疫反應(yīng)是必需的［15］。GLP具有刺激正常人單核細(xì)胞衍生DC細(xì)胞和白血病單核細(xì)胞衍生DC細(xì)胞成熟的能力。GLP增加CD80、CD86、CD83、CD40、CD54和人類白細(xì)胞抗原DR（HLA‐DR）的細(xì)胞表面表達(dá)［16］。它還增強(qiáng)了IL‐12p70、IL‐12p40和IL‐10的產(chǎn)生。GLP誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞源性DCs的活化和成熟是通過活化B細(xì)胞的核因子kappa輕鏈增強(qiáng)子（NF‐κB）和p38絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途徑介導(dǎo)的［17］。GLP（0.8、3.2或12.8 mg/ml）可增加培養(yǎng)的骨髓來源樹突狀細(xì)胞表面CD11c和I‐A/I‐E分子的共表達(dá)，提高DCs中細(xì)胞因子IL‐12p40的mRNA表達(dá)，增加培養(yǎng)上清液中IL‐12p40蛋白的產(chǎn)生。GLP還增強(qiáng)了成熟DC細(xì)胞誘導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中淋巴細(xì)胞的增殖。用GLP（100μg/ml）處理白血病單核細(xì)胞系THP‐1和U937可顯著增加HLA‐DR、CD40、CD80和CD86的表達(dá)［18］。GLP通過促進(jìn)細(xì)胞黏附、超氧化物產(chǎn)生、細(xì)胞周期阻滯和CD11b、CD14、CD68、MMP‐9、髓過氧化物酶等分化標(biāo)志物的表達(dá)，誘導(dǎo)THP‐1白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分化。此外，GLP誘導(dǎo)的caspases和p53激活也有助于這種分化［19］。

2 靈芝多糖對T/B細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

2.1 GLP對T淋巴細(xì)胞的影響大量研究表明GLP是T淋巴細(xì)胞的活化劑。GAO等［20］研究表明，GLP能夠顯著增加小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷力以及NK細(xì)胞的活性。用GLP治療可顯著促進(jìn)伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，ConA）誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖和IL‐2的產(chǎn)生［21］。GLP還能促進(jìn)脾細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子如IL‐1α、IL‐1β、IFN‐γ、TNF‐α和TNF‐β的產(chǎn)生。有研究表明GLP還可以通過誘導(dǎo)DNA聚合酶α的表達(dá)，促進(jìn)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中小鼠脾細(xì)胞的DNA合成。GLP可增加T淋巴細(xì)胞中IFN‐γ的表達(dá)以及小鼠脾細(xì)胞中IL‐1、IL‐2和IFN‐γ的表達(dá)。GLP增加靜息T細(xì)胞中三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycer-ol，DAG）的生成，盡管它不影響ConA激活T細(xì)胞中IP3和DAG的生成，這表明IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C（protein kinase，PKC）途徑可能參與GLP對T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的研究表明，GLP可以激活鼠T細(xì)胞中的PKC和蛋白激酶A（protein ki-nase A，PKA）［22］。

B16F10黑色素瘤細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌大量IL‐10、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor，TGF‐β1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endo-thelial growth factor，VEGF）。研究表明，B16F10細(xì)胞培養(yǎng)上清液能抑制植物血凝素（phytohemaggluti-nin，PHA）刺激穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生，抑制淋巴細(xì)胞的增殖。有趣的是，添加GLP可以完全或部分拮抗B16F10細(xì)胞培養(yǎng)上清對淋巴細(xì)胞的抑制作用［23］。GLP還能防止B16F10細(xì)胞減少淋巴細(xì)胞中CD71和Fas配體（FasL）的表達(dá)。此外，肺癌患者的血漿可抑制PHA激活的淋巴細(xì)胞的增殖，CD69表達(dá)以及穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生，而這些成分也可以通過GLP治療完全或部分逆轉(zhuǎn)。用GLP處理B16F10黑色素瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)物可增加培養(yǎng)基中CD69（T細(xì)胞活化和增殖的共同刺激分子）、FasL和IFN‐γ的產(chǎn)生［24］。

2.2 GLP對B淋巴細(xì)胞的影響B(tài)淋巴細(xì)胞在體液免疫中起重要作用，與T細(xì)胞或NK細(xì)胞不同，B細(xì)胞在其細(xì)胞膜上表達(dá)B細(xì)胞受體，使B細(xì)胞結(jié)合特定抗原并產(chǎn)生針對該抗原的抗體，此外，B細(xì)胞也呈 遞 抗 原 并 分 泌 細(xì) 胞 因 子［25］。GLP激 活mIg和TLR4，后者發(fā)送信號激活B細(xì)胞，并通過核糖體蛋白s7和轉(zhuǎn)錄輔激活劑（胞內(nèi)蛋白）啟動巨噬細(xì)胞激活過程［26］。GLP可以通過增加B細(xì)胞的增殖和分化來激活B細(xì)胞。據(jù)報道GLP不僅使B細(xì)胞的百分比增加了2.5～4倍，而且還增加了B細(xì)胞的大小。同樣，在體內(nèi)用GLP治療還可以激活脾臟和骨髓來源的肉瘤S180小鼠的B淋巴細(xì)胞，并誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和在小鼠中產(chǎn)生大量免疫球蛋白。從機(jī)制上講，GLP可通過直接刺激B細(xì)胞中PKCα和PKCγ的表達(dá)來誘導(dǎo)B細(xì)胞表面CD71和CD25的表達(dá)，并增加B細(xì)胞免疫球蛋白的分泌［27］。

3 靈芝多糖對細(xì)胞因子的影響

3.1 增加抗腫瘤的細(xì)胞因子GLP在荷瘤小鼠體內(nèi)治療可提高小鼠血清中12種細(xì)胞因子和趨化因子的水平，包括KC（CXCL1）、MCP‐1（CCL2）、IL‐6、MIP‐1β（CCL3）、IL‐1β、IL‐12p40、IL‐12p70、RANTES（CCL5）、IL‐1α、TNF‐α、IL‐10和IL‐13［28］。GLP能增強(qiáng)晚期癌癥患者的免疫反應(yīng)。在一項非隨機(jī)開放臨床試驗中，74例晚期結(jié)直腸癌患者以5.4 g/d的劑量服用GLP，持續(xù)12周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLP能提高CD3、CD4、CD8和CD56淋巴細(xì)胞計數(shù)，也能提高PHA的有絲分裂反應(yīng)性、血漿IL‐2、IL‐6、IFN‐γ濃度以及NK活性，但降低血漿IL‐1和TNF‐α濃度。在另一項臨床試驗中，34例晚期癌癥患者3次/d服用1 800μg的ganopoli（GLP提取物），為期12周。這導(dǎo)致血漿中IL‐2、IL‐6和IFN‐γ的平均濃度升高，IL‐1和TNF‐α的水平降低。在CD4∶CD8 T細(xì)胞比率不變的情況下，CD56+細(xì)胞的平均絕對數(shù)也增加，CD3+、CD4+或CD8+的數(shù)量與基礎(chǔ)水平相比僅略有增加。此外，與基線相比，治療導(dǎo)致平均NK活性顯著增加［29］。

3.2 抗炎作用一些炎癥介質(zhì)，如TNF‐α、IL‐6、TGF‐β和IL‐10，已經(jīng)被證明參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。GLP具有劑量依賴性的抗炎作用。服用GLP（100 mg/kg）可導(dǎo)致58%的炎癥抑制，如卡拉膠誘導(dǎo)（急性）和福爾馬林誘導(dǎo)（慢性）炎癥試驗所評估的［30］。GLP在體內(nèi)外對O2‐，SO，HO˙，H2O2和2，2‐二苯基‐1‐吡啶酰肼（DPPH）具有較強(qiáng)的清除活性。研究表明，5 mg/ml的GLP提取物能在2 min內(nèi)顯著降低DPPH自由基，15 min內(nèi)完全清除DPPH自由基。GLP提取物通過Nrf2介導(dǎo)的信號通路在體外誘導(dǎo)結(jié)直腸癌組織中超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD）、過氧化氫酶、Ⅱ期脫毒酶、醌氧化還原酶1（NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1）和谷 胱 甘 肽S‐轉(zhuǎn) 移 酶P1（glutathione S‐transferase，P1GSTP1）［31］。GLP還能增強(qiáng)SOD和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，并以劑量依賴的方式降低暴露于γ射線照射的小鼠或?qū)m頸癌大鼠體內(nèi)的丙二醛水平。

4 小結(jié)與展望

臨床前和臨床研究表明，GLP不僅具有抗腫瘤細(xì)胞增殖、促凋亡和抗遷移作用，而且具有抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)作用。因此，聯(lián)合應(yīng)用GLP有利于腫瘤患者接受常規(guī)化療和/或放療，有助于提高患者的免疫功能，減輕常規(guī)治療的毒副作用。然而，仍然需要更多的研究來進(jìn)一步闡明免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制以及GLP的直接抗癌作用，特別是為不同的病人群體設(shè)計更為合理的臨床試驗也是必要的。