梁云云 莫 沛 解龍昌 陳 艷 胡 楠 傅君毅
缺血性卒中是中國卒中最常見的類型,其已成為我國人口主要死亡原因[1]。血管再生作為內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)的一部分,在卒中早期為了增加側(cè)支循環(huán)的供應(yīng)以及緊密耦合神經(jīng)元再生和少突膠質(zhì)細(xì)胞再生,血管再生和血管重構(gòu)的機(jī)制被激活,并在卒中后幾天甚至幾周內(nèi)保持很高水平[2-4]。近年來,隨著對外泌體研究的深入,已證實(shí)外泌體調(diào)控的細(xì)胞間信息交流過程也廣泛參與了腦血管系統(tǒng)的生理、病理過程,并在缺血性腦卒中血管再生機(jī)制中扮演著重要的角色[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)含有豐富的miRNAs,這些miRNAs是其發(fā)揮治療功能的一個關(guān)鍵性因素[7-8],miR-126是一種重要的可調(diào)控血管新生的miRNA[9],但血小板外泌體能否通過攜帶的miRNAs促進(jìn)缺血性腦卒中血管再生目前研究尚少。
本實(shí)驗(yàn)通過檢測缺血性腦卒中患者與健康志愿者血小板外泌體攜帶miR-126水平,推測血小板外泌體及其攜帶的miR-126可能在缺血性腦卒中患者血管再生發(fā)揮重要作用。
2019年6月—12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科入選急性缺血性腦卒中住院患者50人,體檢中心收集健康志愿者50人,分為卒中組和對照組。缺血性腦卒中患者入選標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》,結(jié)合患者的神經(jīng)影像學(xué)及臨床病例資料,診斷為缺血性腦卒中。 排除標(biāo)準(zhǔn):各種原因?qū)е碌某鲅阅X血管病患者;外傷或夾層引起的頭頸部血管狹窄或閉塞;煙霧?。淮髣用}炎等炎性反應(yīng)疾病造成的血管狹窄或閉塞;單純由心源性因素導(dǎo)致的卒中;其他原因?qū)е碌淖渲?;其他:血液系統(tǒng)疾病、腫瘤、急性期感染、血管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、休克、肝炎,近期應(yīng)用過干擾素、糖皮質(zhì)激素。兩組患者在性別、年齡、吸煙史、血壓、總膽固醇以及低密度脂蛋白等方面均無統(tǒng)計學(xué)差異,見表1。
表1 兩組患者一般資料比較
1.2.1 外泌體的分離 檸檬酸鈉(ACD)抗凝管取全血20 mL,術(shù)后2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室處理;將富含血小板的血液裝入50 mL無菌離心管中,500 g室溫離心15 min,棄沉淀,去除血細(xì)胞;將上一步離心所得上清液裝入一新15 mL無菌離心管中,2 000 g室溫下離心15 min,可見血小板沉淀至管底,收集管底沉淀即血小板,棄上清液;將上一步離心所得沉淀用1 mL改良臺氏液懸浮,裝入新的1 mL無菌離心管中,加入0.1 μ/mL凝血酶,37 ℃孵育激活血小板,期間緩慢震蕩,孵育30 min,得到完全激活的血小板;將激活后的血小板10 000 g,4 ℃離心1 h,可見血小板沉淀于管底,收集上清液;將上一步離心所得上清液放入1 mL的無菌離心管中,使用1 mL預(yù)冷臺式液重懸,120 000 g,4 ℃離心90 min,棄上清,沉淀用200 μL臺氏液重懸,收集血小板EXs,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 NTA檢測分析 我們實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了Nanosight 公司的NS300 儀器,將使用最新的納米顆粒示蹤分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)方法,對血小板釋放EXs 進(jìn)行精確定量及定性分析。取5 μL外泌體原液,稀釋至1 000 μL PBS中。使用NanoSight NS300進(jìn)行測量分析外泌體形態(tài)、粒徑及濃度。
1.2.3 血小板外泌體(p-EXs)中miRNA表達(dá)量 使用Trizol法對p-EXs中經(jīng)查閱文獻(xiàn)獲得的miRNA進(jìn)行表達(dá)量的鑒定。
數(shù)據(jù)表示成均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, 使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析。是否正態(tài)分布用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)。使用Levene檢驗(yàn)判斷是否方差齊性。兩組計量資料組間比較,若正態(tài)分布資料使用Student’st檢驗(yàn),若非正態(tài)分布資料使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。以P<0.05 為統(tǒng)計學(xué)顯著意義。
與對照組相比,卒中組血小板外泌體的數(shù)量明顯增加(P<0.05);卒中組與對照組相比血小板外泌體內(nèi)miR-126的水平升高(P<0.05),見表2。
表2 腦卒中組與對照組血小板外泌體的數(shù)量以及血小板外泌體miR-126的水平
據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,腦卒中是全球范圍內(nèi)第二大致死原因,占所有死亡的11.9%。腦卒中是中國第一位的死亡原因,在每年所有死亡中約占1/5[10]。其中缺血性卒中是腦卒中最常見類型,占70%~80%。血管再生作為腦保護(hù)重要機(jī)制之一,已經(jīng)成為缺血性腦梗塞治療的研究熱點(diǎn)。
外泌體(Exosomes,EXs)是機(jī)體細(xì)胞受到各種刺激后釋放的直徑約30~100 nm的細(xì)胞膜小囊泡[11]。外泌體可由細(xì)胞自發(fā)或在激活因子的刺激下生成和釋放,該過程并不是細(xì)胞一種簡單、被動的胞吐,而是主動地外排[12]。外泌體結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,攜帶母細(xì)胞的膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)分子、miRNA和mRNA等信號分子,在細(xì)胞間信息交流和細(xì)胞功能調(diào)控中起重要的作用[13]。由于外泌體能與細(xì)胞融合而傳遞所攜帶的信號分子,影響靶細(xì)胞的功能,因此可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程[14]。近年來,外泌體的細(xì)胞功能作用引起了臨床和科學(xué)界的廣泛關(guān)注,已經(jīng)成為心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)[15-16]。Sheldon等[17]研究表明外泌體能與細(xì)胞膜融合,在內(nèi)皮細(xì)胞間傳導(dǎo)Notch 配體Delta-like 4蛋白,抑制Notch通道從而調(diào)節(jié)血管生成。
血小板在缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。而血小板外泌體(Platelet-derived exosomes,PLT-EXs)是外周血外泌體的重要組成成分。血小板能通過釋放外泌體,攜帶細(xì)胞因子、生長因子、凝血因子以及各種不同類型的RNA等,作為主要的介質(zhì)調(diào)節(jié)血小板與細(xì)胞以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用[18],文獻(xiàn)報道血小板外泌體參與在血管再生[19],它的主要機(jī)制是通過血小板來源的外泌體協(xié)同VEGF、BFGF、HIF-1等基因,與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的G蛋白通過PI3K途徑介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔的形成[20]。血小板外泌體促進(jìn)血管再生的作用得到另一研究的支持,研究表明在體外實(shí)驗(yàn)中,在富含血小板外泌體環(huán)境中的內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成,如果去除血小板外泌體這種促進(jìn)血管再生的作用則被減弱[21]。實(shí)驗(yàn)表明在大腦中動脈阻塞的小鼠中,血小板外泌體以劑量依賴性的方式刺激內(nèi)源性干細(xì)胞促進(jìn)缺血區(qū)域血管再生和神經(jīng)修復(fù),同時可以對抗腦血管缺血再灌注損傷[22]。
miRNAs是一類由19~23個核苷酸組成的高度保守的內(nèi)源性小分子非編碼RNA,主要通過一種不完全匹配的方式結(jié)合靶mRNA的3’-UTR區(qū)域,促進(jìn)mRNA的降解或抑制其翻譯,在調(diào)控基因表達(dá)的過程中發(fā)揮著重要的作用[23]。miR-126是一種重要的可調(diào)控血管新生的miRNA[9],研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠體內(nèi)miR-126基因使其不能表達(dá),引起小鼠血管完整性破壞及血管破裂,甚至引起胚胎死亡,而提高梗死肌肉內(nèi)miR-126的表達(dá)水平則有利于梗死肌肉內(nèi)的血管生成[24-25]。進(jìn)一步研究顯示miR-126可通過下調(diào)PI3KR2而激活PI3K,從而促進(jìn)血管新生[26]。此外,下調(diào)PI3KR2是VEGF血管新生過程中Akt/PKB磷酸化的必要環(huán)節(jié),因此,miR-126也可通過VEGF途徑促進(jìn)血管新生[27]。但目前研究表明急性缺血性腦卒中外周血循環(huán)及內(nèi)皮細(xì)胞中miR-126都較健康對照組表達(dá)下調(diào)[28-29],miR-126如何在缺血性腦卒中患者中發(fā)揮促進(jìn)血管再生作用尚不明確。我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中患者血小板外泌體攜帶的miR-126表達(dá)較健康對照組升高,血小板外泌體及其攜帶的miR-126可能在缺血性腦卒中患者血管再生發(fā)揮重要作用。
綜上所述,我們推測血小板外泌體攜帶miR-126能促進(jìn)缺血性腦卒中血管再生,改善患者的預(yù)后。我們將通過臨床研究、細(xì)胞、離體血管及動物模型試驗(yàn),驗(yàn)證血小板外泌體能通過攜帶miR-126作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)靶點(diǎn),促進(jìn)缺血性腦卒中后血管生成,是改善患者的預(yù)后的重要機(jī)制,為開展缺血性腦卒中的防治提供新的治療方向。