超極化激活環(huán)核苷酸門控離子通道2在內(nèi)臟高敏感性大鼠視上核的表達(dá)及作用

毛廣通 苗蓓 王德廣，3

徐州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，3影像學(xué)院（江蘇徐州221004）；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化科（江蘇徐州221006）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是常見的功能性胃腸道綜合征，嚴(yán)重影響患者的心身健康和生活質(zhì)量［1］。慢性內(nèi)臟高敏感性（chronic visceral hypersensitivity，CVH）是IBS 的主要病理生理改變之一，表現(xiàn)為慢性腹痛、大便性狀和排便頻率改變等［2-3］。IBS 存在明顯的腦-腸相互作用，神經(jīng)系統(tǒng)功能異常可導(dǎo)致黏膜免疫功能改變、胃腸動力紊亂、腸道菌群改變和內(nèi)臟高敏感性等體征，但機制尚未明確［4-6］。因此研究IBS 疾病的腦-腸機制將加深對IBS 慢性內(nèi)臟高敏感性形成的理解。

視上核（supraoptic nucleus，SON）是內(nèi)臟活動調(diào)節(jié)核團之一，可通過視上垂體束的分泌活動參與調(diào)控下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis，HPA axis）的功能，間接參與IBS 的病理生理過程。視上核可通過分泌催產(chǎn)素發(fā)揮陣痛作用，且研究發(fā)現(xiàn)慢性疼痛模型中視上核催產(chǎn)素分泌增加，提示視上核的中樞敏化可能參與慢性疼痛的緩解［7-9］。但IBS 的病理生理改變中是否發(fā)生視上核中樞敏化卻鮮有報道。

超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated 2，HCN2）是hcn2 基因編碼的電壓門控鈉-鉀離子通道，其獨特的電生理特性（膜電位超級化激活，且與cAMP 結(jié)合后電活動增強）使HCN2 與神經(jīng)中樞的敏化關(guān)系密切［10-12］，并可通過與其他離子通道的相互作用，影響神經(jīng)元興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及神經(jīng)環(huán)路的功能狀態(tài)。因此，研究內(nèi)臟高敏感性大鼠視上核HCN2 的表達(dá)及功能改變有助于闡釋視上核在IBS 病理生理過程中發(fā)揮作用的機制，有利于尋找潛在的IBS 治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物新生雄性Sprague-Dawley大鼠38只（親代大鼠由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），隨機分為假手術(shù)（Sham）、結(jié)直腸擴張（CRD）、溶劑（Vehicle）、ZD7288 1 ng、ZD7288 10 ng 和ZD7288 100 ng 組，6 只/組，立體定位矯正補充2 只。母乳喂養(yǎng)，21日齡斷奶分籠，每4 只幼鼠1 籠，室溫、晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。本實驗遵從國際疼痛研究聯(lián)合會（international association for the study of pain，IASP）相關(guān)指南，以盡量減少實驗動物數(shù)目及對實驗動物傷害為原則，并經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑小鼠抗c-Fos 單克隆抗體、山羊抗小鼠紅色標(biāo)記熒光二抗、山羊抗兔綠色標(biāo)記熒光二抗購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；兔抗HCN2 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)（二步法）試劑盒購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3 主要儀器腦立體定位儀購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；BL-420E+多道生理記錄儀購自成都泰盟軟件有限公司；CK50-F200 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.4 新生大鼠CRD參照并微調(diào)AL-CHAER 等［13］的報道，采用新生大鼠CRD 法制備慢性內(nèi)臟高敏感性模型。大鼠分別于8、10、12日齡接受CRD：將涂有液體石蠟的長10 mm、直徑3 mm 經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）球囊通過幼鼠肛門置入末段結(jié)腸，以60 mmHg 壓力持續(xù)擴張1 min（2 次/d，間隔30～60 min），然后撤壓、移除球囊并清潔肛門，將幼鼠送歸母鼠籠喂養(yǎng)。Sham 組幼鼠僅作球囊置入，不擴張。

1.5 CRD 刺激球囊置入?yún)⒖嘉墨I制作成年大鼠CRD 刺激球囊［13］。大鼠8 周齡時檢測其內(nèi)臟敏感性，檢測前禁食不禁水約18 h。2%異氟烷麻醉后，經(jīng)大鼠肛門將液體石蠟潤滑的球囊置入結(jié)腸（約4 cm），妥善固定于大鼠尾根部后將大鼠轉(zhuǎn)移至透明觀察箱（12 cm × 20 cm × 9 cm）內(nèi)，待其復(fù)蘇并適應(yīng)30 min 后依次進行腹壁撤退反射（AWR）、內(nèi)臟痛閾和腹外科肌放電肌電圖（EMG）實驗。

1.6 病理檢測

1.6.1 AWR雙盲法記錄大鼠AWR評分。球囊經(jīng)三通與血壓計相連，注空法使球囊壓力分別達(dá)到20、40、60 和80 mmHg，每次持續(xù)10 s，間隔4 min，每個壓力重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)取均值錄入。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，大鼠無顯著行為改變；1 分，大鼠自由活動停止伴/不伴頭部運動；2 分，大鼠腹部變平，尚未顯著抬離桌面；3 分，大鼠腹部顯著抬離桌面；4 分，大鼠腹、背躬起，伴骨盆抬起。

1.6.2 內(nèi)臟痛閾的檢測雙盲法觀察大鼠內(nèi)臟痛閾。經(jīng)三通將球囊與注射器和血壓計相連，待大鼠完全蘇醒并適應(yīng)環(huán)境30 min 后注入空氣，初始壓力10 mmHg，若大鼠無AWR 評分3 分的行為表現(xiàn)，則間隔4 min，增加10 mmHg 壓力，直至出現(xiàn)AWR 評分3 分或壓力達(dá)到80 mmHg，記錄壓力值并結(jié)束本次痛閾檢測。痛閾檢測共進行3 次，取均值后錄入。

1.6.3 EMG檢測提前3天將電極埋置于腹外斜肌內(nèi)（髂棘水平，距腹中線約1～1.5 cm），參照AWR評分的檢測方法進行CRD，并用BL-420E 信號采集系統(tǒng)采集EMG 數(shù)據(jù)（參數(shù)設(shè)置：靈敏度500 μV，高頻濾波2 kHz，采樣頻率50 Hz，時間常數(shù)0.001 s，走紙速度500 ms/div）。每次CRD 前先記錄10 s 基礎(chǔ)放電，再記錄10 s CRD 誘導(dǎo)的腹外斜肌放電，導(dǎo)出EMG 波形的曲線下面積（AUC），記錄腹外斜肌放電與基礎(chǔ)放電的差值。每個壓力測量3 次，所得AUC 取均值后錄入。實驗結(jié)束2 h 后，對Sham組和CRD 組大鼠進行4%甲醛灌注（或斷首處死）取腦及結(jié)腸（結(jié)腸左曲至骨盆入口段），用于形態(tài)學(xué)研究檢測或Western blot 分析。

1.7 視上核立體定位注射提前1 周將立體定位注射套管植入大鼠雙側(cè)視上核（Vehicle 組和各濃度ZD7288 組；坐標(biāo)：前囟點后0.90 mm；雙側(cè)旁開2.00 mm；顱表以下9.20 mm），牙科水泥包埋。大鼠8 周齡時，置入CRD 刺激球囊（操作同前述）。經(jīng)套管向雙側(cè)視上核各注入0.5 μL 預(yù)先配制好的溶液，計量參照文獻［14］和預(yù)實驗結(jié)果確定：Vehicle組注射生理鹽水；ZD7288 組注射HCN2 通道抑制劑ZD7288，總劑量分別為1、10、100 ng/只（濃度分別為1、10、100 ng/μL）。2 h 后開始AWR、痛閾和EMG 檢測，檢測結(jié)束2 h 后處死取腦（同前述）。

1.8 結(jié)腸組織HE 染色將固定好的結(jié)腸取出，雙蒸水反復(fù)沖洗后脫水、透明、石蠟包埋、切片（5 μm），HE 染色后脫水、透明、封片，光鏡下攝片，圖像分析。

1.9 中性紅染色將完成沉糖的鼠腦取出，冠狀位冰凍切片（厚度30 μm），中性紅染色、封片后光鏡下攝片、分析視上核立體定位是否準(zhǔn)確。

1.10 免疫組織化學(xué)染色（二步法）鼠腦切片清洗后，兔二步法試劑盒試劑I 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，隨后依次0.1% Triton X-100 孵育10 min、4%山羊血清室溫孵育2 h，兔抗HCN2（1∶200）或小鼠抗c-Fos 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃過夜；依次室溫孵化試劑Ⅱ和試劑Ⅲ，各20 min，DAB 顯色5 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，Olympus光學(xué)顯微鏡攝片。根據(jù)Paxinos 和Watson 大鼠腦圖譜［15］，低倍鏡下辨析視上核形態(tài)，每組取相同部位的6 張照片，高倍鏡下辨析陽性染色，應(yīng)用Imagepro Plus 6.0 軟件進行陽性細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)一添加比例尺（Bar=100 μm）。

1.11 免疫熒光染色鼠腦切片清洗后，依次0.1%Triton X-100 孵育10 min、4%山羊血清室溫孵育，兔抗HCN2 多克隆抗體（1∶200）小鼠抗c-Fos 單克隆抗體（1∶1 000）混合一抗4 ℃過夜；1∶500 混合熒光二抗室溫2 h，DAPA 復(fù)染5 min，50%甘油封片，Olympus 熒光顯微鏡攝片。圖片分析同前述。

1.12 Western blot應(yīng)用Western blot 法檢測視上核目的蛋白表達(dá)，步驟如下，將鼠腦腹面朝上置于冰面，沿視神經(jīng)剝離視交叉至視神經(jīng)潛入腦實質(zhì)段的淺層、狹長丘腦組織，提取蛋白、制樣、配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，1∶500 兔抗HCN2 抗體、1∶2 000 小鼠抗c-Fos 抗體或1∶1 000 小鼠抗β-actin 孵育4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h，發(fā)光法顯色，攝片，ImageJ 8.0 軟件分析灰度值。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析，Graphpad prism 8.3.0 軟件作圖，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，滿足正態(tài)分布時采用t檢驗，不滿足時采取Welch′st檢驗；多組比較，參數(shù)滿足方差齊性時采方差分析，組間對比采用獨立樣本t檢驗，不滿足方差齊性時采用Brown-Forsythe and Welch方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性內(nèi)臟高敏感大鼠模型的建立與Sham組相比，20、40、60 mmHg 壓力下8 周齡CRD 組大鼠AWR 評分顯著升高（P＜0.05，圖1A）；40、60、80 mmHg 壓力下AUC 顯著升高（P＜0.05，圖1B）；痛閾明顯降低（P＜0.05，圖1C）。HE 染色顯示，與Sham 組相比，CRD 組大鼠結(jié)腸腸壁各層結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無明顯水腫，無中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，無顯著纖維結(jié)締組織增生（圖1D）。以上結(jié)果表明CRD 組大鼠成年后內(nèi)臟敏感性顯著增強，未見明顯結(jié)腸病理性改變，符合IBS 的病理生理特征，CVH 大鼠模型建立成功。

2.2 大鼠視上核HCN2 通道上調(diào)參與對CVH 的調(diào)控行為學(xué)檢測2 h 后，免疫組織化學(xué)染色和Western blot 顯示，CRD 組大鼠視上核HCN2 表達(dá)較Sham 組明顯上調(diào)（P＜0.05，圖2）；免疫組織化學(xué)染色顯示，Sham 組大鼠視上核偶見c-Fos 陽性細(xì)胞，CRD 組大鼠c-Fos 陽性細(xì)胞顯著增加（P＜0.05，圖3）；熒光雙標(biāo)染色顯示，CRD 組大鼠視上核HCN2（綠色）和c-Fos（紅色）共標(biāo)細(xì)胞較Sham 組顯著增多（P＜0.05，圖4）。c-fos 基因是早期表達(dá)的原癌基因，正常情況下低水平表達(dá)于大部分細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物c-Fos 蛋白的上調(diào)可作為細(xì)胞活化的標(biāo)志［16-17］。以上結(jié)果表明，大鼠視上核HCN2 表達(dá)上調(diào)參與對CVH 的調(diào)控。

2.3 抑制視上核HCN2通道對模型大鼠的CVH樣行為起加重作用參照Paxinos 和Watson 大鼠腦圖譜對立體定位的準(zhǔn)確性進行組織學(xué)鑒定（中性紅染色法，圖5A）。最初接受立體定位的模型大鼠24 只，經(jīng)鑒定，定位偏斜2 只，補充注射對應(yīng)分組的模型大鼠2 只，定位準(zhǔn)確并納入統(tǒng)計的大鼠共24 只。ZD7288 立體定位注射2 h 后，與Vehicle 組相比，40 mmHg 壓力下AWR 評分（P＜0.05，圖5B）和AUC（P＜0.05，圖5C）呈劑量依賴性升高，痛閾呈劑量依賴性降低（P＜0.05，圖5D）；Western blot結(jié)果顯示，與Vehicle 組相比，100 ng ZD7288可顯著降低c-Fos 和HCN2 的表達(dá)（P＜0.05，圖5E、F）。以上結(jié)果表明，抑制視上核HCN2 通道對模型大鼠的CVH 樣行為起加重作用。

圖1 CVH 模型大鼠病理檢測和結(jié)腸組織HE 染色Fig.1 Pathologicl detection and HE staining of colon tissue in CVH rats

圖2 CVH 大鼠視上核HCN2 表達(dá)Fig.2 The expression of supraoptic HCN2 in CVH rats

圖3 CVH 大鼠視上核c-Fos 表達(dá)Fig.3 The expression of supraoptic c-Fos in CVH rats

圖4 CVH 大鼠視上核HCN2 和c-Fos 雙標(biāo)陽性細(xì)胞Fig.4 HCN2+/c-Fos+cells in SON of CVH rats

3 討論

內(nèi)臟高敏感性是腸易激綜合征的特征性表現(xiàn)，表現(xiàn)為腸道對各種內(nèi)外環(huán)境刺激（腸氣、糞便、結(jié)直腸擴張等）的過度反應(yīng)，可伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)下行抑制的弱化和痛覺的中樞敏化［18-21］。既往研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者和CVH動物具有諸多相似的表現(xiàn)，如HPA 軸活動性增強，循環(huán)CRF 水平升高［22-24］；來自IBS 患者或CVH 動物的糞便移植，均可導(dǎo)致正常鼠內(nèi)臟敏感性升高［25-26］；核磁共振下觀察CRD 誘導(dǎo)的中樞活動，發(fā)現(xiàn)IBS 患者和CVH 動物存在相似的腦區(qū)活動［27-29］。AL-CHAER 等［13］和LIN 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，對新生期大鼠進行多次CRD 刺激可導(dǎo)致大鼠成年后內(nèi)臟敏感性升高。此后，新生期CRD誘導(dǎo)成年大鼠CVH 模型成為被廣泛采納的IBS 動物模型，是研究IBS 中樞機制的理想平臺之一。

視上核是下丘腦調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動的核團之一，除了參與調(diào)控垂體的分泌活動外，還參與內(nèi)臟感覺的調(diào)節(jié)［31-33］。本研究以新生期CRD 誘導(dǎo)成年大鼠CVH 模型為研究平臺，發(fā)現(xiàn)與對照大鼠相比，CVH 模型大鼠對結(jié)直腸刺激的敏感性升高，且結(jié)直腸刺激可誘導(dǎo)視上核c-Fos 的表達(dá)上調(diào)。c-Fos基因是早期表達(dá)的原癌基因，正常情況下低水平表達(dá)于大部分細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物c-Fos 蛋白的上調(diào)可作為細(xì)胞活化的標(biāo)志［16-17］。因此，c-Fos的表達(dá)上調(diào)提示CVH 模型大鼠視上核發(fā)生中樞敏化，表明視上核參與對CVH 的調(diào)控。

HCN2 是一種超極化電位激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道，可產(chǎn)生內(nèi)向電流，增強神經(jīng)元的放電傾向［10，34-35］。本研究發(fā)現(xiàn)CVH 模型大鼠視上核c-Fos 陽性細(xì)胞的HCN2 表達(dá)上調(diào)，提示HCN2 表達(dá)上調(diào)參與視上核的中樞敏化。HCN2 通道抑制實驗表明，ZD7288（HCN 通道特異性抑制劑）立體定位注射可劑量依賴性地下調(diào)視上核HCN2 和c-Fos的表達(dá)并加重大鼠的CVH 樣行為，表明抑制HCN2可使CVH 模型大鼠視上核脫敏并提高大鼠的內(nèi)臟敏感性，提示視上核HCN2 表達(dá)上調(diào)可能抑制CVH模型大鼠內(nèi)臟敏感性的升高。既往研究表明，視上核可通過分泌催產(chǎn)素發(fā)揮陣痛作用；由于視上核存在顯著的“興奮-分泌偶連”現(xiàn)象，且ZD7288可顯著降低大鼠視上核神經(jīng)元的放電頻率，故CVH模型大鼠視上核HCN2 的上調(diào)，可增加視上核的激素分泌活動［36-38］。結(jié)合本研究的結(jié)果，證明CVH模型大鼠視上核HCN2 表達(dá)上調(diào)對大鼠內(nèi)臟高敏感性起抑制性作用。

值得注意的是，HCN2 在脊髓和外周痛覺神經(jīng)元上也有分布，鞘內(nèi)注射ZD7288 抑制HCN2 通道可以緩解CVH 大鼠的腹部癥狀［39］。由于目前HCN通道抑制劑均無法通過血腦屏障，故HCN 通道抑制類藥物有可能從阻斷外周的痛覺傳導(dǎo)和非抑制視上核的陣痛作用兩個方面發(fā)揮控制IBS 癥狀的作用，但該假設(shè)有待臨床研究考證。

綜上所述，下丘腦視上核通過上調(diào)HCN2 通道蛋白參與抑制大鼠的內(nèi)臟高敏感性。

圖5 ZD7288 對CVH 大鼠的內(nèi)臟敏感性以及視上核c-Fos 和HCN2 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of ZD7288 on the visceral sensation and the expression of c-Fos and HCN2 in supraoptic nucleus of CVH rats