組蛋白去乙?；?抑制劑RGFP966改善放射性腦損傷的研究

任安邦 李榮 徐安安 簡海鋒 李可俊 袁亞維

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州510095）

頭頸部原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移瘤每年新增確診病例數(shù)超過500 000 例［1］，放射治療是其最有效的非手術(shù)治療方式［2］。頭頸部腫瘤患者放射治療后產(chǎn)生一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的癥狀稱為放射性腦損傷（radiation-induced brain injury，RBI），近年來放射性腦損傷確診率總體呈上升趨勢［3］。放射性腦損傷是一個漸進(jìn)的過程［4］，后期出現(xiàn)的不可逆性認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響腫瘤患者的生活質(zhì)量［5］。類固醇［6］、貝伐單抗［7］等藥物臨床治療放射性腦損傷效果非常有限，除此之外目前尚無其他有效的放射性腦損傷治療方法。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦主要的免疫細(xì)胞以及神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)細(xì)胞［8-10］，而神經(jīng)炎癥在放射性腦損傷的發(fā)展中起關(guān)鍵作用［11］，認(rèn)知功能損傷往往也與神經(jīng)元凋亡相關(guān)［12］。因此，如何有效減少小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡對于改善放射性腦損傷至關(guān)重要。

HDAC3 是大腦中表達(dá)最多的一種組蛋白去乙?；福?3］，負(fù)向調(diào)控大腦學(xué)習(xí)和記憶過程［14］。HDAC 抑制劑是一類有干擾HDAC 功能的化合物，RGFP966 為高度選擇性的HDAC3 抑制劑。RGFP-966 具有神經(jīng)炎癥抑制效應(yīng)，可保護(hù)脊髓損傷［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ類HDAC 抑制劑（丙戊酸鈉）可以保護(hù)放射性腦損傷［16］，而HDAC3屬于Ⅰ類HDAC［17］，故本實驗以HDAC3 抑制劑RGFP966 為干預(yù)藥物，以放射性腦損傷為研究病種，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥水平和神經(jīng)元的凋亡變化為指標(biāo)，初步探索RGFP966 是否可改善放射性神經(jīng)炎癥，為放射性腦損傷保護(hù)提供全新視角。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑RGFP966（A8803，美國APE×BIO 公司）；TNF-α、IL-6 和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（HZ-1014、HZ-1019、HZ-1164，美國Proteintech公司）；TUNEL 試劑盒（G3250，Promega 公司）；實驗所用腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列（5′-3′）：TNF-α-F：GGAACACGTCGTGGGATAATG；TNF-α-R：GGCAGACTTTGGATGCTTCTT；IL-6-F：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG；IL-6-R：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG；IL-1β-F：TTCAGGCAGGCAGTATCACTC；IL-1β-R：GAAGGTCCACGGGAAAGACAC；β-actin-F：TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC；β-actin-R：GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC。

1.2 注射藥液的制備RGFP966 溶于二甲基亞砜（DMSO），但由于DMSO 本身對動物有刺激作用，因此將RGFP966 溶解在DMSO 同時并在30%（wt/vol）羥丙基-β-環(huán)糊精和100 mmol/L 乙酸鈉（pH 5.4）的載體中稀釋，最終摻有藥物和媒介物的DMSO 濃度為10%（vol/vol）。羥丙基-β-環(huán)糊精對肌肉沒有刺激性，是一種理想的注射增溶劑和藥物賦形劑。所用動物給藥的濃度為10 mg/kg，細(xì)胞培養(yǎng)用的濃度為10 μmol/L。

1.3 動物分組將40 只C57BL/6 小鼠飼養(yǎng)1 周適應(yīng)環(huán)境后將其按照有無放射和有無注射抑制劑隨機(jī)分為4組：A，溶劑對照組；B，放射組；C，RGFP966組；D，放射+RGFP966 組，每組10 只。

1.4 放射性腦損傷模型的建立動物模型：根據(jù)已有參考文獻(xiàn)的模型復(fù)制，具體方法如下：小鼠腹腔注射5%的水合氯醛（0.2 mL/20 g），待其靜止后俯臥位固定于治療床上。為更加貼合臨床實際，將用直線加速器（型號：Clinic iX，Varian，Pali Alto，CA，USA）劑量率300 cGy/min、源軸距（SAD）為1.5 cm的6 MV 光子線，照射野大小2.5 cm × 3 cm 劑量為30 Gy 單次照射小鼠全腦。通過前期實驗驗證照射后一周內(nèi)小鼠自主活動量逐漸減少，包括頭部皮膚在內(nèi)的照射野開始出現(xiàn)輕度脫毛，切片染色觀察到腦內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，指示放射性腦損傷模型建立成功。

1.5 動物給藥方案放射前1 天按照分組情況將小鼠分別預(yù)先皮下注射10 mL/kg 的配置好的不同藥物，放射當(dāng)天在放射前一小時分別以同樣的方式第二次給藥，再以直線加速器進(jìn)行全腦放射，繼而在放射后第一天和第二天連續(xù)皮下注射兩天，觀察小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元凋亡情況。

1.6 樣本采集動物腦組織：末次給藥后24 h內(nèi)取樣。（1）分別對各組小鼠進(jìn)行稱重并記錄，予質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的戊巴比妥溶液腹腔注射麻醉（50 mg/kg）；（2）迅速打開腹腔，用PBS 和4%的多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注；（3）用眼科剪剪開小鼠顱骨速取大腦，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h。細(xì)胞RNA：1 mL Trizol 裂解細(xì)胞，按照試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。無DNA/RNAse 水溶解稀釋RNA，紫外分光光度計測量RNA 濃度。按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）操作使用說明書，反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 腦組織的病理變化組織免疫熒光驗證取出固定24 h 后的腦組織再經(jīng)脫水、石蠟包埋及切片后，根據(jù)TUNEL 試劑盒步驟要求組織染色，熒光顯微鏡觀察其形態(tài)變化。

1.7.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥水平qRT-PCR 驗證：采用TB Green?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，qRT-PCR 擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad 公司，CFX96）擴(kuò)增cDNA，β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）驗證：將目的時間段的細(xì)胞培養(yǎng)基收集離心，按照試劑盒要求在酶標(biāo)儀下450 nm 波長處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。

1.7.3 CCK-8 驗證細(xì)胞增殖活力將消化下來的細(xì)胞懸液每孔按照103/100 μL 數(shù)量滴加入96 孔板中，按照試劑盒說明不同時間段在酶標(biāo)儀450 nm波長處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7、SPSS 15.0 軟件進(jìn)行處理，所得結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGFP966抑制放射后的小膠質(zhì)細(xì)胞激活小膠質(zhì)細(xì)胞的激活往往出現(xiàn)在損傷早期，IBA-1 是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)記物。30 Gy放射24 h后分別檢測小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及細(xì)胞活力情況，結(jié)果顯示照射后加入RGFP966 的BV2 細(xì)胞胞體有所減小，阿米巴樣改變緩解，IBA-1 表達(dá)也有所減少（圖1A），腦組織石蠟切片觀察到放射+RGFP966組的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體相較于單純放射組明顯縮小（圖1C）；CCK-8 檢測表明放射+RGFP966 處理組的BV2細(xì)胞活力顯著高于單純放射組（圖1B）。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞IBA-1 的表達(dá)情況（免疫熒光染色，×200）及細(xì)胞活力變化Fig.1 Expression of IBA-1 in microglia（IF，×200）and changes in cell viability

2.2 RGFP966 抑制放射后的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和分泌TNF-α、IL-6、IL-1β是小膠質(zhì)細(xì)胞放射激活后表達(dá)和分泌的經(jīng)典急性炎癥因子，通常在放射后6 h 即在小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中顯著升高。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，加入RGFP966的30 Gy放射組小膠質(zhì)細(xì)胞的以上三種炎癥因子mRNA 水平顯著低于單獨30 Gy 放射組細(xì)胞（表1）；利用Elisa 方法檢測顯示，加入RGFP966 的放射組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的炎癥因子含量顯著低于單獨放射組細(xì)胞（表2）。

2.3 RGFP966 抑制放射后的神經(jīng)元凋亡30 Gy放射72 h 后分別檢測海馬神經(jīng)元的凋亡比例及活力情況，將神經(jīng)元HT22 細(xì)胞進(jìn)行TUNEL 染色并計數(shù)，顯示放射+RGFP966 組中細(xì)胞凋亡的數(shù)量相較于單獨放射組明顯減少（P＜0.05，圖2A），腦組織石蠟切片TUNEL 染色顯示放射+RGFP966 組海馬區(qū)齒狀回（dentate gyrus）的凋亡細(xì)胞數(shù)量相較于單純放射組明顯減少（P＜0.05，圖3）；CCK8 實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在放射30 Gy 后24 和72 h 的放射+RGFP966 處理組的HT22 細(xì)胞活力顯著高于單純放射組（圖2B）。

3 討論

頭頸部腫瘤患者在進(jìn)行放射治療的過程中，腫瘤細(xì)胞會連同周邊人體正常組織細(xì)胞一同接受放射［18］，因此放療也可能對鄰近的正常腦組織造成傷害并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥［19］。有關(guān)放射性腦損傷發(fā)生的機(jī)制目前仍不明確，多項研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡起重要作用［20］。HDAC3是一種重要的基因表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白［21］，抑制HDAC3 的表達(dá)可改善多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型的嚴(yán)重程度。

本實驗結(jié)果顯示，RGFP966 處理可以顯著抑制BV2 細(xì)胞的放射后激活，并降低BV2 細(xì)胞在放射后急性期炎癥因子的表達(dá)水平及其在細(xì)胞上清液中的含量，表明該抑制劑可能通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞中的某些炎癥通路來減少放射激活過程中產(chǎn)生的炎癥因子。在腦組織功能分區(qū)中，海馬區(qū)是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵區(qū)域，小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡使小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶能力的下降［22］。已有研究證明長期給予RGFP966 可以增強小鼠的長期記憶、空間和識別記憶［23-24］。依據(jù)上述理論，本研究采取30 Gy 劑量單次全腦放射小鼠，TUNEL 染色法觀察小鼠海馬區(qū)齒狀回神經(jīng)元凋亡情況，注射RGFP966 抑制劑的小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量較之單純放射處理組明顯減少，結(jié)果提示放射會導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，RGFP966 可以一定程度上改善凋亡狀況，間接為小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的保護(hù)提供了理論依據(jù)。有研究表明可能是通過激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，從而進(jìn)一步活化其下游的細(xì)胞保護(hù)性因子GSH、SOD 等［25］，但下調(diào)的HDAC3 具體是通過何種途徑改變凋亡信號通路仍需筆者進(jìn)一步探究。

表1 炎癥因子mRNA 表達(dá)情況Tab.1 mRNA expression of inflammatory factors ±s

表1 炎癥因子mRNA 表達(dá)情況Tab.1 mRNA expression of inflammatory factors ±s

注：取溶劑對照組6 h 為參照，#表示未放射組間P 值；*表示放射組間P 值

基因TNF-α IL-6 IL-1β時間（h）6 12 24 6 12 24 6 12 24溶劑對照組1 1.27±0.19 1.26±0.18 1 1.19±0.17 1.17±0.12 1 1.24±0.13 1.21±0.22放射組4.74±0.62 1.45±0.28 1.51±0.21 1.35±0.21 1.53±0.18 2.06±0.19 2.41±0.20 1.67±0.17 1.24±0.16 RGFP966組1.13±0.15 1.30±0.24 1.19±0.13 1.17±0.11 1.14±0.20 1.15±0.13 1.11±0.10 1.25±0.19 1.37±0.08放射+RGFP966組2.24±0.31 1.77±0.17 1.25±0.14 1.24±0.15 1.22±0.23 1.41±0.24 1.54±0.13 1.24±0.07 1.15±0.06 P值#0.522 0.879 0.723 0.160 0.679 0.762 0.339 0.909 0.190 P值*＜0.001 0.839 0.200 0.353 0.014＜0.001＜0.001 0.001 0.446

表2 炎癥因子濃度差異Tab.2 Difference in inflammatory factor concentration ±s，pg/mL

表2 炎癥因子濃度差異Tab.2 Difference in inflammatory factor concentration ±s，pg/mL

注：取溶劑對照組6 h 為參照，#表示未放射組間P 值；*表示放射組間P 值

基因TNF-α IL-6 IL-1β時間（h）6 12 24 6 12 24 6 12 24 6 12溶劑對照組1 1.27±0.19 1.26±0.18 1 1.19±0.17 1.17±0.12 1 1.24±0.13 1.21±0.22 1 1.27±0.19放射組4.74±0.62 1.45±0.28 1.51±0.21 1.35±0.21 1.53±0.18 2.06±0.19 2.41±0.20 1.67±0.17 1.24±0.16 4.74±0.62 1.45±0.28 RGFP966組1.13±0.15 1.30±0.24 1images/BZ_18_1224_1601_1418_1716.png1 1.14±0.20 1.15±0.13 1.11±0.10 1.25±0.19 1.37±0.08 1.13±0.15 1.30±0.24放射+RGFP966組2.24±0.31 1.77±0.17 1.25±0.14 1.24±0.15 1.22±0.23 1.41±0.24 1.54±0.13 1.24±0.07 1.15±0.06 2.24±0.31 1.77±0.17 P值#0.522 0.879 0.723 0.160 0.679 0.762 0.339 0.909 0.190 0.522 0.879 P值*＜0.001 0.839 0.200 0.353 0.014＜0.001＜0.001 0.001 0.446＜0.001 0.839

在臨床研究和FDA 批準(zhǔn)的用藥通常是泛抑制低選擇性的HDAC 抑制劑，盡管低選擇性HDACI在臨床前或臨床研究中表現(xiàn)出高活性，但其所引起的副作用包括胃腸道惡心、血液系統(tǒng)血小板減少癥、中性粒細(xì)胞減少和貧血、代謝性肝毒性、電解質(zhì)失衡和腎功能不全等令人擔(dān)憂［26］，因此為降低上述毒副作用本研究選用RGFP966，它是一種高度選擇的特異性抑制HDAC3 活性的新型化合物。放射性腦損傷涉及多種細(xì)胞功能異常，本研究表明該藥物具有保護(hù)神經(jīng)元，抑制炎癥，保護(hù)血腦屏障等多重效應(yīng)，有臨床應(yīng)用潛力。但作為探索藥物保護(hù)效應(yīng)的初步研究，本研究并沒有做相關(guān)行為學(xué)，無法確定該藥物是否能改善動物的整體認(rèn)知能力。因此筆者下一步的研究方向?qū)⒕驮撍幬飳游镎J(rèn)知能力的影響進(jìn)行具體的驗證，并探索其在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞，血腦屏障的詳細(xì)作用機(jī)制。

圖2 小鼠HT22 細(xì)胞的凋亡（TUNEL，×100）及細(xì)胞活力變化Fig.2 Changes of apoptosis（TUNEL，×100）and cell viability in mouse HT22 cells

圖3 小鼠腦組織海馬區(qū)凋亡變化（免疫熒光染色，×100）Fig.3 Apoptotic changes in hippocampus of mouse brain（IF，×100）

總之，筆者對于選擇性HDAC3抑制劑RGFP966應(yīng)用于放射性腦損傷的效果進(jìn)行了初步的探索，它能夠減輕放射腦損傷急性期的炎癥水平，減少神經(jīng)元凋亡，為臨床增加放射性腦損傷保護(hù)的新途徑提供可能。