施景龍 李 博 賀 歡 宋向暉
1.廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科,廣東廣州 510630;2.廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東廣州 510317;3.廣東省婦幼保健院ICU,廣東廣州 510000
胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤疾病之一,其起病隱匿且病情發(fā)展較快,疾病惡性程度高,患者死亡率亦較高,是導(dǎo)致我國(guó)消化系統(tǒng)腫瘤疾病致死的主要原因之一[1]。近年來(lái)隨著腫瘤研究的展開(kāi),腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)過(guò)程中相關(guān)基因在腫瘤病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)的研究成為熱點(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等為EMT 相關(guān)蛋白,亦可參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展[2]。通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)可促進(jìn)EMT 從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3-4]。TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白均可能與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),但目前關(guān)于胰腺癌組織中TGF-β1、EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平及其與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究仍較少。因此,本研究檢測(cè)胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,并分析其與病情以及腫瘤侵襲的關(guān)系,旨在為胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移防治提供新思路,現(xiàn)報(bào)道如下。
選取2019年1月~2020年2月廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科(32例)和廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科(28例)收治的60例胰腺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為胰腺癌,首次確診;②預(yù)計(jì)存活期在3個(gè)月以上;③行胰腺癌根治手術(shù);④知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①入院前經(jīng)抗癌治療或合并手術(shù)禁忌證;②合并腫瘤轉(zhuǎn)移或其他腫瘤疾病患者;③合并肝腎功能障礙患者;④合并心腦血疾病患者;⑤妊娠期或哺乳期女性;⑥精神狀態(tài)異?;颊?。60例胰腺癌患者中,男35例,女25例;年齡45~76歲,平均(60.52±13.73)歲;高分化癌28例,低分化癌32例;腫瘤部位位于胰頭33例,胰體20例,胰尾7例;合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例;腫瘤直徑<2 cm 7例,2~4 cm 28例,>4 cm 25例。所有患者及其家屬均知情同意,且本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。
即用型SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒、鼠抗人Vimentin 單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體及鼠抗人TGF-β1 單克隆抗體均購(gòu)自南京凱基公司,工作濃度1∶100,SW-CY-1F型凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng),微量移液器均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司,倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司,低溫冰箱購(gòu)自山東青島海爾公司,Model550 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIORAD公司,糖類(lèi)抗原(CA)199和CA242 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。
1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) 以手術(shù)獲取的胰腺癌組織和癌旁組織為待檢測(cè)標(biāo)本,免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胰腺癌組織和癌旁組織的TGF-β1 以及E-cadherin、Vimentin 等EMT 相關(guān)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。待檢測(cè)樣本經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋切制成厚度為4 μm連續(xù)切片,二甲苯浸泡10 min 脫蠟,梯度酒精脫水去除二甲苯,3%過(guò)氧化氫溶液進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活,檸檬酸工作液加熱行抗原熱修復(fù),添加40 μL 相應(yīng)一抗,室溫(20℃)下孵育1 h,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3 遍,添加40 μL 相應(yīng)二抗,室溫下孵育0.5 h,PBS 洗滌3 遍,DAB 顯色2 min后顯微鏡下觀察,顯色滿(mǎn)意后以清水終止反應(yīng),行蘇木精復(fù)染,返藍(lán),脫水,透明,吹干并以中性樹(shù)脂封片。隨機(jī)選取3個(gè)視野(400×)進(jìn)行觀察,TGF-β1、Vimentin 表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì),E-cadherin 表達(dá)定位于細(xì)胞膜,以出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性,以陽(yáng)性細(xì)胞<10%為陰性,陽(yáng)性細(xì)胞≥10%為陽(yáng)性,統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性表達(dá)率。
1.3.2 酶聯(lián)免疫檢測(cè) 入組次日患者均取空腹肘靜脈血3 mL檢測(cè)血清CA199和CA242水平,血液樣本采集采用一次性針管和不含熱原和內(nèi)毒素試管,1500 r/min、3 cm 半徑、4℃環(huán)境中離心10 min,待分層后收集上層血清在-20℃低溫冰箱冷藏待測(cè)。CA199和CA242 ELISA 試劑盒固相包被板在室溫(20℃)下平衡約20 min,設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔,不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 分別加入標(biāo)準(zhǔn)品孔,取待測(cè)樣本10 μL 和樣本稀釋液40 μL 先后加入樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL 并在37℃水浴恒溫箱孵育1 h,棄去反應(yīng)液并吸水紙上拍干,洗滌,每孔中均加入顯色劑A、B 各50 μL,輕輕搖晃混勻后在37℃恒溫箱中避光孵育15 min,每孔中均加入終止液50 μL,15 min 內(nèi)在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度(OD)值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣本吸光度計(jì)算樣本濃度。
1.3.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)分期狀況檢測(cè) 采用PhilipsIE33型超聲儀、3.5~6 MHz 探頭頻率常規(guī)行超聲檢查,觀察胰腺腫瘤形態(tài)、回聲、陰影狀況以及邊界模糊情況,行常規(guī)淋巴結(jié)掃描,對(duì)可疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位取樣行病理檢查,確定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)分期狀況,采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第8版TNM 分期[5]中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)分期標(biāo)準(zhǔn)。
采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);Kendall 相關(guān)法分析胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)分期的關(guān)系,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
以出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性,TGF-β1、Vimentin 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)而E-cadherin 表達(dá)于細(xì)胞膜。胰腺癌組織細(xì)胞中TGF-β1 和Vimentin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)占多數(shù),僅有少數(shù)胰腺癌組織細(xì)胞為E-cadherin陽(yáng)性表達(dá);而在癌旁組織細(xì)胞中僅有少量細(xì)胞為T(mén)GF-β1 或Vimentin陽(yáng)性表達(dá),而E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)占多數(shù)(圖1~2,封三)。與癌旁組織比較,胰腺癌組織中TGF-β1 和Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率升高而E-cadherin 的陽(yáng)性表達(dá)率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。
圖1 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在胰腺癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法,400×)
圖2 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法,400×)
表1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較[n=60,n(%)]
TGF-β1 陽(yáng)性表達(dá)患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期為T(mén)3~T4期比例均高于其陰性表達(dá)患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期為T(mén)3~T4期比例均低于其陰性表達(dá)患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Vimentin陽(yáng)性表達(dá)患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期為T(mén)3~T4期比例均高于其陰性表達(dá)患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。
表2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期的比較
Kendall 相關(guān)分析結(jié)果顯示,胰腺癌組織TGF-β1和Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期均呈正相關(guān)(TGF-β1:r=0.786、0.835、0.882、0.874,P<0.05;Vimentin:r=0.757、0.792、0.808、0.849,P<0.05),而胰腺癌組織E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.842、-0.889、-0.818、-0.793,P<0.05)。
胰腺癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,好發(fā)于男性人群,發(fā)病率近年來(lái)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì),其早期癥狀隱匿均無(wú)明顯的特異性,早期確診困難,且病情發(fā)展迅速,死亡率較高[6-8]。侵襲轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者病情惡化和患者死亡的重要原因[9-12]。本研究中,近一半的確診胰腺癌患者出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而浸潤(rùn)分期為T(mén)3~T4期,而血清CA199和CA242水平明顯較高,其侵襲轉(zhuǎn)移明顯,需對(duì)其侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行有效預(yù)防和控制以緩解病情,改善療效和預(yù)后。近年來(lái),腫瘤研究開(kāi)展較多,腫瘤相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)在腫瘤病情和預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用成為熱門(mén)。
TGF-β1 參與腫瘤的細(xì)胞增殖、分化調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成以及免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等多個(gè)過(guò)程,在腫瘤疾病早期具有腫瘤抑制因子的作用,而隨著腫瘤發(fā)展,TGF-β1 對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用失效,反而可刺激腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)合成、抑制免疫并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13-16]。本研究中,胰腺癌組織中TGF-β1 陽(yáng)性表達(dá)率高于其癌旁組織(P<0.05),證實(shí)TGF-β1 在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有促進(jìn)作用;TGF-β1 陽(yáng)性表達(dá)患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期為T(mén)3~T4期比例均高于其陰性表達(dá)患者(P<0.05);相關(guān)分析結(jié)果顯示,胰腺癌組織TGF-β1 表達(dá)與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)分期均密切相關(guān),可能促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移,TGF-β1 在胰腺癌組織中表達(dá)水平的檢測(cè)可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移評(píng)估。EMT 在胰腺癌等腫瘤疾病演進(jìn)中扮演重要角色,EMT 具有上皮細(xì)胞極性喪失和間質(zhì)特征,可下調(diào)E-cadherin 等上皮細(xì)胞性標(biāo)志物并上調(diào)Vimentin 等間質(zhì)性標(biāo)志物,從而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[17-19]。本研究中,胰腺癌組織中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率降低而Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率升高,提示EMT 在胰腺癌發(fā)展中可能具有促進(jìn)作用,這與Krebs 等[20]研究的Zeb1 激活EMT 促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移結(jié)論以及Sheng 等[21]研究的促進(jìn)EGF 誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞EMT 可促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展結(jié)論一致。E-cadherin、Vimentin陽(yáng)性表達(dá)患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期為T(mén)3~T4期比例與其陰性表達(dá)患者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Kendall 相關(guān)分析提示,胰腺癌腺癌組織E-cadherin和Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤(rùn)分期均密切相關(guān),EMT 可能促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移,E-cadherin、Vimentin 等EMT相關(guān)蛋白在胰腺癌組織中表達(dá)水平的檢測(cè)可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移評(píng)估。而對(duì)TGF-β1 以及EMT干預(yù)可能為胰腺癌防治的有效措施。
綜上所述,胰腺癌組織TGF-β1、Vimentin、E-cadherin 表達(dá)均與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能用于胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移評(píng)估。