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    胰腺癌組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達水平及其臨床意義

    2021-03-29 12:59:44施景龍宋向暉
    中國當(dāng)代醫(yī)藥 2021年5期
    關(guān)鍵詞:血清水平

    施景龍 李 博 賀 歡 宋向暉

    1.廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科,廣東廣州 510630;2.廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科,廣東廣州 510317;3.廣東省婦幼保健院ICU,廣東廣州 510000

    胰腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤疾病之一,其起病隱匿且病情發(fā)展較快,疾病惡性程度高,患者死亡率亦較高,是導(dǎo)致我國消化系統(tǒng)腫瘤疾病致死的主要原因之一[1]。近年來隨著腫瘤研究的展開,腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移等多項過程中相關(guān)基因在腫瘤病情評估和預(yù)后預(yù)測的研究成為熱點。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等為EMT 相關(guān)蛋白,亦可參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展[2]。通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)可促進EMT 從而促進癌細胞轉(zhuǎn)移[3-4]。TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白均可能與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),但目前關(guān)于胰腺癌組織中TGF-β1、EMT 相關(guān)蛋白表達水平及其與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究仍較少。因此,本研究檢測胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白的表達水平,并分析其與病情以及腫瘤侵襲的關(guān)系,旨在為胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移防治提供新思路,現(xiàn)報道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2019年1月~2020年2月廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科(32例)和廣州市第十二人民醫(yī)院普通外科(28例)收治的60例胰腺癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為胰腺癌,首次確診;②預(yù)計存活期在3個月以上;③行胰腺癌根治手術(shù);④知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①入院前經(jīng)抗癌治療或合并手術(shù)禁忌證;②合并腫瘤轉(zhuǎn)移或其他腫瘤疾病患者;③合并肝腎功能障礙患者;④合并心腦血疾病患者;⑤妊娠期或哺乳期女性;⑥精神狀態(tài)異?;颊?。60例胰腺癌患者中,男35例,女25例;年齡45~76歲,平均(60.52±13.73)歲;高分化癌28例,低分化癌32例;腫瘤部位位于胰頭33例,胰體20例,胰尾7例;合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例;腫瘤直徑<2 cm 7例,2~4 cm 28例,>4 cm 25例。所有患者及其家屬均知情同意,且本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

    1.2 試劑和儀器

    即用型SABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒、鼠抗人Vimentin 單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體及鼠抗人TGF-β1 單克隆抗體均購自南京凱基公司,工作濃度1∶100,SW-CY-1F型凈化工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠,微量移液器均購自德國Eppendorf 公司,倒置顯微鏡購自日本Nikon 公司,低溫冰箱購自山東青島海爾公司,Model550 酶標(biāo)儀購自美國BIORAD公司,糖類抗原(CA)199和CA242 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。

    1.3 檢測方法

    1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測 以手術(shù)獲取的胰腺癌組織和癌旁組織為待檢測標(biāo)本,免疫組織化學(xué)染色法檢測胰腺癌組織和癌旁組織的TGF-β1 以及E-cadherin、Vimentin 等EMT 相關(guān)蛋白陽性表達率。待檢測樣本經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋切制成厚度為4 μm連續(xù)切片,二甲苯浸泡10 min 脫蠟,梯度酒精脫水去除二甲苯,3%過氧化氫溶液進行內(nèi)源性過氧化物酶的滅活,檸檬酸工作液加熱行抗原熱修復(fù),添加40 μL 相應(yīng)一抗,室溫(20℃)下孵育1 h,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3 遍,添加40 μL 相應(yīng)二抗,室溫下孵育0.5 h,PBS 洗滌3 遍,DAB 顯色2 min后顯微鏡下觀察,顯色滿意后以清水終止反應(yīng),行蘇木精復(fù)染,返藍,脫水,透明,吹干并以中性樹脂封片。隨機選取3個視野(400×)進行觀察,TGF-β1、Vimentin 表達定位于細胞質(zhì),E-cadherin 表達定位于細胞膜,以出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達陽性,以陽性細胞<10%為陰性,陽性細胞≥10%為陽性,統(tǒng)計陽性表達率。

    1.3.2 酶聯(lián)免疫檢測 入組次日患者均取空腹肘靜脈血3 mL檢測血清CA199和CA242水平,血液樣本采集采用一次性針管和不含熱原和內(nèi)毒素試管,1500 r/min、3 cm 半徑、4℃環(huán)境中離心10 min,待分層后收集上層血清在-20℃低溫冰箱冷藏待測。CA199和CA242 ELISA 試劑盒固相包被板在室溫(20℃)下平衡約20 min,設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔,不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL 分別加入標(biāo)準(zhǔn)品孔,取待測樣本10 μL 和樣本稀釋液40 μL 先后加入樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣品孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL 并在37℃水浴恒溫箱孵育1 h,棄去反應(yīng)液并吸水紙上拍干,洗滌,每孔中均加入顯色劑A、B 各50 μL,輕輕搖晃混勻后在37℃恒溫箱中避光孵育15 min,每孔中均加入終止液50 μL,15 min 內(nèi)在450 nm 波長處測量各孔的吸光度(OD)值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本吸光度計算樣本濃度。

    1.3.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期狀況檢測 采用PhilipsIE33型超聲儀、3.5~6 MHz 探頭頻率常規(guī)行超聲檢查,觀察胰腺腫瘤形態(tài)、回聲、陰影狀況以及邊界模糊情況,行常規(guī)淋巴結(jié)掃描,對可疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位取樣行病理檢查,確定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期狀況,采用美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第8版TNM 分期[5]中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期標(biāo)準(zhǔn)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗;計數(shù)資料采用率表示,組間比較采用χ2檢驗;Kendall 相關(guān)法分析胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期的關(guān)系,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平的比較

    以出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒為表達陽性,TGF-β1、Vimentin 表達于細胞質(zhì)而E-cadherin 表達于細胞膜。胰腺癌組織細胞中TGF-β1 和Vimentin陽性表達細胞數(shù)占多數(shù),僅有少數(shù)胰腺癌組織細胞為E-cadherin陽性表達;而在癌旁組織細胞中僅有少量細胞為TGF-β1 或Vimentin陽性表達,而E-cadherin陽性表達細胞數(shù)占多數(shù)(圖1~2,封三)。與癌旁組織比較,胰腺癌組織中TGF-β1 和Vimentin陽性表達率升高而E-cadherin 的陽性表達率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

    圖1 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在胰腺癌組織中的表達(免疫組織化學(xué)染色法,400×)

    圖2 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在癌旁組織中的表達(免疫組織化學(xué)染色法,400×)

    表1 胰腺癌組織與癌旁組織中TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平的比較[n=60,n(%)]

    2.2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期的比較

    TGF-β1 陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3~T4期比例均高于其陰性表達患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);E-cadherin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3~T4期比例均低于其陰性表達患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Vimentin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3~T4期比例均高于其陰性表達患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

    表2 不同胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期的比較

    2.3 胰腺癌組織TGF-β1 和EMT 相關(guān)蛋白表達水平與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期的關(guān)系分析

    Kendall 相關(guān)分析結(jié)果顯示,胰腺癌組織TGF-β1和Vimentin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期均呈正相關(guān)(TGF-β1:r=0.786、0.835、0.882、0.874,P<0.05;Vimentin:r=0.757、0.792、0.808、0.849,P<0.05),而胰腺癌組織E-cadherin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期均呈負相關(guān)(r=-0.842、-0.889、-0.818、-0.793,P<0.05)。

    3 討論

    胰腺癌是臨床常見惡性腫瘤,好發(fā)于男性人群,發(fā)病率近年來呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,其早期癥狀隱匿均無明顯的特異性,早期確診困難,且病情發(fā)展迅速,死亡率較高[6-8]。侵襲轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者病情惡化和患者死亡的重要原因[9-12]。本研究中,近一半的確診胰腺癌患者出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而浸潤分期為T3~T4期,而血清CA199和CA242水平明顯較高,其侵襲轉(zhuǎn)移明顯,需對其侵襲轉(zhuǎn)移進行有效預(yù)防和控制以緩解病情,改善療效和預(yù)后。近年來,腫瘤研究開展較多,腫瘤相關(guān)基因和蛋白表達檢測在腫瘤病情和預(yù)后評估中應(yīng)用成為熱門。

    TGF-β1 參與腫瘤的細胞增殖、分化調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)、促進細胞外基質(zhì)形成以及免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等多個過程,在腫瘤疾病早期具有腫瘤抑制因子的作用,而隨著腫瘤發(fā)展,TGF-β1 對腫瘤細胞的抑制作用失效,反而可刺激腫瘤血管生成、細胞外基質(zhì)合成、抑制免疫并促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[13-16]。本研究中,胰腺癌組織中TGF-β1 陽性表達率高于其癌旁組織(P<0.05),證實TGF-β1 在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能具有促進作用;TGF-β1 陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3~T4期比例均高于其陰性表達患者(P<0.05);相關(guān)分析結(jié)果顯示,胰腺癌組織TGF-β1 表達與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤分期均密切相關(guān),可能促進胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移,TGF-β1 在胰腺癌組織中表達水平的檢測可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移評估。EMT 在胰腺癌等腫瘤疾病演進中扮演重要角色,EMT 具有上皮細胞極性喪失和間質(zhì)特征,可下調(diào)E-cadherin 等上皮細胞性標(biāo)志物并上調(diào)Vimentin 等間質(zhì)性標(biāo)志物,從而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[17-19]。本研究中,胰腺癌組織中E-cadherin陽性表達率降低而Vimentin陽性表達率升高,提示EMT 在胰腺癌發(fā)展中可能具有促進作用,這與Krebs 等[20]研究的Zeb1 激活EMT 促進胰腺癌的轉(zhuǎn)移結(jié)論以及Sheng 等[21]研究的促進EGF 誘導(dǎo)的胰腺癌細胞EMT 可促進胰腺癌的發(fā)生發(fā)展結(jié)論一致。E-cadherin、Vimentin陽性表達患者的血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期為T3~T4期比例與其陰性表達患者比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Kendall 相關(guān)分析提示,胰腺癌腺癌組織E-cadherin和Vimentin陽性表達率與其血清CA199和CA242水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、浸潤分期均密切相關(guān),EMT 可能促進胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移,E-cadherin、Vimentin 等EMT相關(guān)蛋白在胰腺癌組織中表達水平的檢測可能用于胰腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移評估。而對TGF-β1 以及EMT干預(yù)可能為胰腺癌防治的有效措施。

    綜上所述,胰腺癌組織TGF-β1、Vimentin、E-cadherin 表達均與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能用于胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移評估。

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