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    基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)挖掘分析PRC1在肺腺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義

    2021-03-29 06:10:34劉細(xì)幫胡旭鋼唐夏莉陳清勇
    浙江醫(yī)學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期數(shù)據(jù)庫基因

    劉細(xì)幫 胡旭鋼 唐夏莉 陳清勇

    肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌最常見的病理亞型,患者5年平均生存率僅為15%[1-2]。盡管近年來診斷和治療方法不斷改進(jìn),但LUAD患者的總體生存率并未提高。因此,有必要尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物,這不僅有助于改善個體化治療,還能為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供參考。胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1(protein regulator of cytokinesis 1,PRC1)基因位于人體15號染色體上(15q26.1),編碼含有620個氨基酸的蛋白;屬于微管相關(guān)蛋白家族,參與細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn),PRC1 是乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、肝細(xì)胞癌[6]和胃癌[7]等腫瘤的致癌因子,并且PRC1的表達(dá)與LUAD細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡相關(guān),可能是LUAD潛在的治療靶點(diǎn)[8-9]。但目前PRC1對LUAD患者總體預(yù)后影響的相關(guān)研究較少。本研究旨在通過對公共數(shù)據(jù)庫的挖掘,分析PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者總體預(yù)后的相關(guān)性,探討其作為LUAD預(yù)后標(biāo)志物的可行性,為今后有關(guān)PRC1的機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 PRC1數(shù)據(jù)的獲取 33種腫瘤數(shù)據(jù)來自腫瘤免疫評估資源(tumor immune estimation resource,TIMER)數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/),通過 Diff Exp模塊檢索PRC1在腫瘤組織與正常對照組織中的表達(dá)情況。通過腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取 PRC1表達(dá)的RNASeq數(shù)據(jù),獲得的數(shù)據(jù)中包含517例原發(fā)性LUAD患者和59例正常肺組織,其中504例LUAD患者記錄了生存數(shù)據(jù),并以PRC1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。利用基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)分別下載包含LUAD組織及正常對照組織或癌旁正常組織的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE31210、GSE75037和 GSE68465,其中 GSE31210、GSE68465 數(shù)據(jù)集各包含226、362例LUAD患者完整的臨床資料以及生存信息,并以PRC1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。同時,從人類蛋白質(zhì)圖譜(human protein atlas,HPA)數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)獲取腫瘤以及正常對照組織中PRC1蛋白免疫組化染色數(shù)據(jù)。

    1.2 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)采用GSEA 4.0進(jìn)行分析。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中PRC1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,以Hallmark基因集作為參考基因集,通過GSEA分析PRC1參與LUAD發(fā)展的可能機(jī)制,設(shè)置置換次數(shù)為1 000次,以P<0.05、錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.25為顯著富集基因集。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R 3.6和GraphPad 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示,兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn);多組比較采用單因素方差分析。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法,組間比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用R軟件ROC的時間序列分析(timeROC)包繪制ROC曲線并計算AUC值。Cox回歸模型分析PRC1與LUAD患者總生存期(overall survival,OS)、無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)的關(guān)系,并計算HR值及其95% CI。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 腫瘤組織中PRC1 mRNA表達(dá) 在TIMER數(shù)據(jù)庫提供的33種腫瘤數(shù)據(jù)中,膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)、乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma,BRCA)、膽管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)、結(jié)腸癌(colon adenocarcinoma,COAD)、食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe,KICH)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)、乳頭狀腎細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)、肝細(xì)胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)、LUAD、肺鱗癌(lung squamous carcinoma,LUSC)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PRAD)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma,READ)、胃癌(stomach adenocarcinoma,STAD)、甲狀腺癌(thyroid car-cinoma,THCA)、子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)17種腫瘤組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平均高于正常對照組織,見圖1。

    圖1 腫瘤組織中胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1(PRC1)表達(dá)

    2.2 LUAD組織和正常對照組織中PRC1的表達(dá) 在TCGA數(shù)據(jù)庫和GSE31210數(shù)據(jù)集中,LUAD組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常對照組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),見圖2a-b。在GSE75037數(shù)據(jù)集中,LUAD組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖2c。在HPA數(shù)據(jù)庫中,PRC1免疫組化染色結(jié)果顯示,PRC1蛋白在正常對照組織中弱表達(dá),而在LUAD組織中強(qiáng)表達(dá),見圖2d-e。

    圖2 肺腺癌(LUAD)組織和正常對照組織中胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1(PRC1)的表達(dá)[a-b:腫瘤基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫、GSE31210數(shù)據(jù)集中LUAD組織和正常對照組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平比較,與正常對照組織比較,**P<0.01;c:GSE75037數(shù)據(jù)集中LUAD組織和癌旁正常組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平比較,與癌旁正常組織比較,**P<0.01;d-e:正常對照組織和LUAD組織中PRC1蛋白表達(dá)的比較,免疫組化染色,×40]

    2.3 PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者臨床特征的關(guān)系 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者的年齡、M分期均無關(guān)(均P>0.05),但與LUAD患者的性別、吸煙、T分期、N分期和TNM分期均有關(guān)(均P<0.01),見表1。

    表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中不同臨床特征LUAD患者PRC1表達(dá)水平比較

    2.4 PRC1 mRNA表達(dá)與LUAD預(yù)后的關(guān)系

    2.4.1 PRC1 mRNA表達(dá)與OS和PFS的關(guān)系 在TCGA數(shù)據(jù)庫、GSE31210和GSE68465數(shù)據(jù)集中,通過Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn),除GSE68465數(shù)據(jù)集中的PFS外,其余PRC1高表達(dá)組患者PFS和OS均差于低表達(dá)組(均 P<0.05),見圖 3(插頁)。

    圖3 胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1(PRC1)表達(dá)與總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)的關(guān)系[a-b:腫瘤基因圖譜(TCGA)中PRC1高表達(dá)組與低表達(dá)組OS和PFS生存曲線比較;c-d:GSE31210數(shù)據(jù)集中PRC1高表達(dá)組與低表達(dá)組OS和PFS生存曲線比較;e-f:GSE68465數(shù)據(jù)集中PRC1高表達(dá)組與低表達(dá)組OS和PFS生存曲線比較]

    2.4.2 影響LUAD患者預(yù)后的臨床特征分析 在TCGA數(shù)據(jù)庫中,ROC曲線模型的OS顯示,1、3、5年生存率AUC值分別為0.674、0.632、0.590;ROC曲線模型的PFS顯示,1、3、5年生存率 AUC 值分別為 0.611、0.583、0.506,見圖4a-b。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示LUAD患者的性別、年齡和吸煙與OS均無關(guān)(均P>0.05),但T分期、N分期、TNM分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平與OS均有關(guān)(均P<0.05);單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示LUAD患者的性別、年齡、TNM分期和吸煙與PFS均無關(guān)(均P>0.05),但T分期、N分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平均與PFS均有關(guān)(均P<0.05)。將以上所有單因素納入多因素Cox回歸分析顯示,T分期、N分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平均是影響LUAD患者OS和PFS的獨(dú)立危險因素(均P≤0.05),見圖4c-f。

    圖4 影響肺腺癌(LUAD)患者預(yù)后的臨床特征分析[a-b:腫瘤基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)的ROC曲線;c-d:TCGA數(shù)據(jù)庫中OS單因素和多因素Cox分析;e-f:TCGA數(shù)據(jù)庫中PFS單因素和多因素Cox分析]

    2.5 GSEA識別與PRC1相關(guān)的信號通路 為了確定PRC1作用的潛在信號通路,在TCGA數(shù)據(jù)庫中,GSEA分析結(jié)果顯示,PRC1高表達(dá)樣本富集在有絲分裂紡錘體、G2M檢查點(diǎn)、E2F信號通路、DNA修復(fù)等基因集中,見圖5。

    圖5 基因集富集分析(GSEA)識別與胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1(PRC1)相關(guān)的信號通路

    3 討論

    細(xì)胞周期是哺乳動物細(xì)胞生長和發(fā)育所必需的進(jìn)化保守過程,因?yàn)榧?xì)胞周期畸變是癌癥的標(biāo)志[10]。PRC1被認(rèn)為是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)底物,在早期細(xì)胞分裂中,是維持紡錘體中段所需的微管相關(guān)蛋白[11-12]。細(xì)胞分裂是一個復(fù)雜的過程,涉及復(fù)雜的生化和細(xì)胞動力學(xué)因素[10],而PRC1作為細(xì)胞分裂的關(guān)鍵蛋白,其表達(dá)異??梢鸺?xì)胞分裂的紊亂。研究表明,PRC1的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,并與早期復(fù)發(fā)和患者預(yù)后不良相關(guān)[6]。敲除PRC1可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖,減少胃癌細(xì)胞克隆形成并抑制其侵襲和遷移[7]。但是,目前PRC1在肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制方面的研究較少,尤其是與患者臨床預(yù)后生存及標(biāo)志物篩查的研究鮮有報道。

    本研究中,筆者通過對多個大樣本數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),PRC1的表達(dá)水平在包括LUAD在內(nèi)的多種腫瘤組織中上調(diào),LUAD組織中PRC1表達(dá)也明顯高于正常對照組織和癌旁正常組織;且免疫組化結(jié)果提示,LUAD組織中PRC1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對照組織。在TCGA數(shù)據(jù)庫和GSE68465數(shù)據(jù)集中,PRC1表達(dá)與腫瘤的T分期、N分期和TNM分期均有關(guān),提示PRC1可能參與LUAD的進(jìn)展?;诙鄠€數(shù)據(jù)庫的生存分析結(jié)果,表明PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者的PFS、OS呈負(fù)相關(guān),其表達(dá)水平越高,LUAD患者預(yù)后越差。并且該結(jié)果與Bu等[13]研究結(jié)果類似,該研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織PRC1呈高表達(dá),并且PRC1的表達(dá)與生存時間呈負(fù)相關(guān)。

    單因素及多因素Cox回歸分析顯示,T分期、N分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平均是影響LUAD患者的獨(dú)立危險因素。為了進(jìn)一步探討PRC1在LUAD中的潛在功能,GSEA分析結(jié)果表明,在有絲分裂紡錘體、G2M檢查點(diǎn)、E2F信號通路、DNA修復(fù)等通路高度富集。G2M檢查點(diǎn)能在DNA損傷的情況下阻止細(xì)胞周期,使細(xì)胞在進(jìn)入下一個細(xì)胞周期階段前修復(fù)DNA損傷,從而維持基因組完整性[14]。因此,PRC1過表達(dá)時可能通過影響細(xì)胞周期和DNA修復(fù),從而促進(jìn)LUAD細(xì)胞的增殖分化。CDK-RB-E2F軸是細(xì)胞周期進(jìn)程的核心轉(zhuǎn)錄機(jī)制,該軸的一個或多個關(guān)鍵組成部分的變化幾乎發(fā)生在所有腫瘤中,并導(dǎo)致致癌E2F活性增強(qiáng),使腫瘤細(xì)胞增殖不受控制,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[15]。而PRC1作為CDK底物,過表達(dá)時可能促進(jìn)該軸的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步增加E2F活性,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。由此可見,PRC1可能參與LUAD發(fā)生、發(fā)展過程,可能是LUAD治療的潛在靶點(diǎn)。

    綜上所述,PRC1基因在LUAD中可能是一個潛在的致癌基因。PRC1在LUAD中的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及患者的預(yù)后有著非常密切的關(guān)系,可作為一個重要的候選生物標(biāo)志物。因此,有必要對該基因在LUAD中的機(jī)制以及功能進(jìn)一步研究,為全面掌握PRC1在腫瘤中的作用以及LUAD的預(yù)防診治提供更多依據(jù)。

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