多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后相關(guān)基因的鑒定及核心基因CLDN1的機(jī)制探討

龔高明 陳博 舒鵬

隨著靶向藥物的不斷開(kāi)發(fā)，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的預(yù)后得到了顯著改善，但MM仍是一種不可治愈的疾病[1]。因此尋找MM的治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)靶向治療藥物，從而改善患者的預(yù)后成為研究的熱點(diǎn)[2]。在患者治療靶點(diǎn)的分析中，除去對(duì)患者本身的臨床病理因素進(jìn)行分析外，近年來(lái)通過(guò)對(duì)患者腫瘤組織樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，明確腫瘤組織中的基因表達(dá)與患者預(yù)后因素之間的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步應(yīng)用于臨床病例的診斷、腫瘤靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的這一流程已得到廣泛的認(rèn)可[3]。目前已有多項(xiàng)研究得出了與MM患者生存率相關(guān)的預(yù)后基因[4]。盡管如此，有關(guān)這些預(yù)后基因如何影響MM患者腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的研究則相對(duì)較少。本研究通過(guò)Cox預(yù)后模型分析基因表達(dá)與MM患者整體生存率之間的相關(guān)性，并得到預(yù)后相關(guān)基因，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的機(jī)制探討。

1 材料和方法

1.1 試劑 RPMI 1640（11875-085）培養(yǎng)基、DMEM（11530556）培養(yǎng)基、FBS（10438026）均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；小干擾 RNA（small interfering RNA,siRNA）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；PMD2.G（12259）、psPAX2（12260）、lenti－CRISPR V2（52961）均購(gòu)自美國(guó)addgene公司；Lipofectamine2000（12566014）、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中Trizol（15596026）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RTReagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）、SYBR檢測(cè)試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNaseHPlus）（RR820A）均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)中全部引物均由華大基因合成；在Western blot實(shí)驗(yàn)中，RIPA強(qiáng)裂解液（P0013B）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；緊密連接蛋白 1（claudin1,CLDN1）（ab63070）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）（ab15537）、GAPDH（ab9485）抗體均購(gòu)自美國(guó) Abcam公司；Transwell小室（BMS500FI-100）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8（CK04）增殖檢測(cè)試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V FITC/PI（BMS500FI-100）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；CD138+磁珠分選試劑盒購(gòu)自美國(guó)STEMCELL Technologies公司。

1.2 預(yù)后相關(guān)基因的確定與驗(yàn)證 MM預(yù)后相關(guān)基因的確定使用R 3.5.1軟件完成，選取GSE2658數(shù)據(jù)集為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，GSE57317數(shù)據(jù)集為測(cè)試數(shù)據(jù)集。訓(xùn)練與測(cè)試數(shù)據(jù)集均使用GEOquery包下載后，log2轉(zhuǎn)換并使用preprocessCore包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集隨后進(jìn)行如下操作：（1）使用randomForest包中的隨機(jī)森林對(duì)基因的重要性進(jìn)行排序；（2）進(jìn)一步使用多因素Cox模型，最終得到25個(gè)預(yù)后相關(guān)基因，使用survival包中的多因素Cox模型檢測(cè)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與測(cè)試數(shù)據(jù)集中25個(gè)基因的表達(dá)與MM患者總體生存率的關(guān)聯(lián)，并使用ROC的時(shí)間序列分析（timeROC）工具包評(píng)估模型對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)生存預(yù)測(cè)的性能，隨后使用qRT-PCR檢測(cè)25個(gè)基因在MM患者CD138+細(xì)胞中的表達(dá)；（3）在得到候選基因CLDN1后，使用survival包中的單因素Cox模型檢測(cè)測(cè)序數(shù)據(jù)中CLDN1的表達(dá)與MM患者總體生存率的關(guān)聯(lián)；（4）根據(jù)CLDN1的表達(dá)值，將GSE2658數(shù)據(jù)集中樣本分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，并使用limma包進(jìn)行差異表達(dá)分析，以P＜0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選基因，最終得到779個(gè)異常表達(dá)基因，使用fgsea包進(jìn)行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），并對(duì)富集通路中的基因使用cor.test計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 3例健康志愿者、7例MM患者骨髓樣本均來(lái)自寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院，樣本收集時(shí)間為2015年11月至2017年11月，實(shí)驗(yàn)過(guò)程經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。健康志愿者、MM患者骨髓在經(jīng)Ficoll分離出單個(gè)核細(xì)胞后，MM患者骨髓使用CD138+磁珠分選試劑盒分選出CD138+細(xì)胞待用。人MM細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。人胚腎細(xì)胞系293t細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司）培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。

1.4 CLDN1敲除慢病毒包裝、單克隆篩選以及TGF-β3 siRNA轉(zhuǎn)染 從addgene human GECKOV2 library庫(kù)中提取CLDN1單引導(dǎo)核糖核酸（single guide RNA,sgRNA）序列，選取6條sgRNA，按照相應(yīng)的操作步驟克隆至lentiCRISPR V2載體中[5]。使用第三代慢病毒包裝體系將sgRNA包裝為慢病毒，主要步驟如下：（1）PMD2.G、psPAX2、lentiCRISPR V2 分別取 3、9、12 μg，轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中。（2）收集36、48 h病毒上清液，混在一起低速離心（3 000 rpm，15 min）后，使用病毒上清液感染RPMI8226，標(biāo)記為RPMI8226 KO組；RPMI8226細(xì)胞同時(shí)感染lentiCRISPR V2空載病毒，標(biāo)記為RPMI8226 CON組。RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組在使用8.5×10-6mol/L濃度的嘌呤霉素篩選48 h后，使用BD FACSARIA III單細(xì)胞分選功能篩選單克隆細(xì)胞，并使用Sanger測(cè)序檢測(cè)DNA突變變化，使用Western blot檢測(cè)CLDN1蛋白水平的抑制，最終確定序列為5'-GGCGGTCACGATGTTGTCGC-3'的sgRNA阻斷了RPMI8226細(xì)胞中CLDN1的表達(dá)。（3）在CLDN1與TGF-β3關(guān)聯(lián)的驗(yàn)證中，將RPMI8226細(xì)胞分為RPMI8226 CON 組、RPMI8226 CLDN1 KO 組、RPMI8226 TGF-β3 siRNA組、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA組，并分別轉(zhuǎn)染lentiCRISPR V2空載體、CLDN1 sgRNA、TGF-β3 siRNA 和 CLDN1 sgRNA+TGF-β3 siRNA，TGF-β3 siRNA轉(zhuǎn)染使用lipofectamine 2000進(jìn)行，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞與MM患者CD138+細(xì)胞中CLDN1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞與MM患者CD138+細(xì)胞首先使用Trizol裂解，經(jīng)氯仿分離出苯酚、等體積異丙醇沉淀出細(xì)胞總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)SYBR染料法檢測(cè)目的基因在mRNA水平的表達(dá)。GAPDH上游引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'；CLDN1 上游引物：5'-GTCTTTGACTCCTTGCTGAATCTG-3'，下游引物：5'-CACCTCATCGTCTTCCAAGCAC-3'。反應(yīng)體系為cDNA 1.2 μl，引物 1.2 μl，2×qPCR Mix 7.5 μl，ROX DyeⅡ 0.3 μl，水 4.8 μl，總反應(yīng)體系為 15 μl；反應(yīng)條件為50 ℃ 20 s，95℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，后兩步40個(gè)循環(huán)。最終mRNA的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCT法定量。

1.6 CLDN1、TGF-β3蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。細(xì)胞使用RIPA裂解液冰上裂解30 min后，使用BCA蛋白定量試劑盒定量，加入相應(yīng)比例的上樣緩沖液，沸水浴15 min后，取20μg蛋白加入到Western預(yù)制膠中，恒壓電泳直至溴酚藍(lán)跑至膠板底部，并使用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，標(biāo)記相應(yīng)一抗與二抗，使用ECL發(fā)光液檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度以判定蛋白的表達(dá)。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V FITC/PI雙染法。PBS清洗細(xì)胞后，使用Binding buffer重懸，并加入Annexin V FITC與PI，冰上標(biāo)記10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。數(shù)據(jù)使用FLOWjo 7.6.1進(jìn)行分析。

1.8 細(xì)胞遷移檢測(cè) 采用Transwell法。選用8μm Transwell小室，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室加入含有血清的培養(yǎng)基，12 h后吸取下室培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)得到遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.9 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法。將細(xì)胞鋪于96孔板中，并設(shè)立 4 個(gè)副孔，于 0、24、48、72、96 h 分別加入1/10體積的CCK-8試劑，37℃避光孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm處的吸光度（OD）值（OD450），并以0 h時(shí)的OD450為參照，其余時(shí)間點(diǎn)OD值均與0 h時(shí)相除得到增殖指數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R 3.5.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。生存分析采用單因素Cox回歸分析。樣本的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM患者25個(gè)基因預(yù)后模型的建立及與患者預(yù)后的相關(guān)性 本研究得到25個(gè)與患者整體生存率相關(guān)的預(yù)后基因，分別為 NNAT、TRAPPC8、IFI27L1、PNOC、HJURP、KRT6B、METTL7A、C16orf45、CENPA、TPT1P8、TYROBP、MSN、RFC4、DSPP、PABPC1、TNFSF12、C3orf52、CLDN1、RPS9、CSTF3、CDKN1A、SLC25A43、HPRT1、VDAC3、FZD3。以25個(gè)基因組合得到的預(yù)后模型在訓(xùn)練（圖1a）與測(cè)試數(shù)據(jù)集（圖1b）中均能夠很好地預(yù)測(cè)患者的總體生存率，且在患者1～3年生存率的預(yù)測(cè)中也有很好的表現(xiàn)（AUC 均＞0.7）（圖 1c）。

圖1 多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者25個(gè)基因預(yù)后模型的建立及與患者預(yù)后的相關(guān)性（a：使用Cox模型得到的25個(gè)預(yù)后相關(guān)基因在GSE2658數(shù)據(jù)集中與患者總體生存率的相關(guān)性；b：在測(cè)試數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證25個(gè)預(yù)后基因與患者總體生存率的相關(guān)性；c：在測(cè)試數(shù)據(jù)集中，25個(gè)預(yù)后基因?qū)颊?.5、1、1.5、2、2.5、3年生存率的預(yù)測(cè)能力的比較）

2.2 MM患者CD138+細(xì)胞中CLDN1的表達(dá)情況及與患者預(yù)后的相關(guān)性 MM患者CD138+細(xì)胞中CLDN1 mRNA表達(dá)水平為4.89±0.63，高于健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的 1.00±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.11，P＜0.01）（圖2a）。同時(shí)MM患者CD138+細(xì)胞中CLDN1蛋白水平呈高表達(dá)（圖2b）。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，CLDN1高表達(dá)組患者生存率明顯低于CLDN1低表達(dá)患者（P＜0.01）（圖 2c）。

2.3 CLDN1的表達(dá)水平與MM細(xì)胞系細(xì)胞生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián) 在確定了CLDN1在CD138+細(xì)胞中的表達(dá)后，隨后構(gòu)建了CLDN1敲除單克隆，結(jié)果表明CLDN1 sgRNA抑制了CLDN1蛋白水平的表達(dá)（圖3a）。而RPMI8226 CON組細(xì)胞凋亡比例為2.40±0.23，明顯低于RPMI8226 CLDN1 KO組的17.67±2.77，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.55，P＜0.01）（圖 3b）。在細(xì)胞增殖中，72 h時(shí)RPMI8226 CON組增殖指數(shù)為4.87±1.56，明顯高于RPMI8226 CLDN1 KO組的 2.51±0.18，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.94，P＜0.01）；96 h時(shí) RPMI8226 CON 組增殖指數(shù)為6.86±0.12，明顯高于RPMI8226 CLDN1 KO組的 3.06±0.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.73，P＜0.01）（圖3c）。在細(xì)胞遷移中，12 h時(shí)RPMI8226 CON組遷移細(xì)胞數(shù)為2 063±241.9，明顯高于RPMI8226 CLDN1 KO 組的 1 197±166.9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.95，P＜0.05）（圖 3d）。

圖3 緊密連接蛋白1（CLDN1）的表達(dá)水平與骨髓瘤細(xì)胞系細(xì)胞生物學(xué)特性之間的關(guān)聯(lián)（a：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組CLDN1蛋白表達(dá)水平比較；b：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組細(xì)胞凋亡比例比較；c：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組細(xì)胞增殖指數(shù)比較；d：RPMI8226 CON組與RPMI8226 CLDN1 KO組遷移細(xì)胞數(shù)比較；與RPMI8226 CON組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 CLDN1調(diào)控的信號(hào)通路探討 在確定了CLDN1與RPMI8226細(xì)胞生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)后，在GSE2658數(shù)據(jù)集中選取CLDN1高表達(dá)與低表達(dá)樣本，使用GSEA方法檢測(cè)細(xì)胞通路的富集，結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)通路在CLDN1高表達(dá)樣本中富集（圖4a），檢測(cè)CLDN1與細(xì)胞外基質(zhì)分子（GO:0031012）表達(dá)相關(guān)性后，發(fā)現(xiàn)CLDN1與TGF-β3的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.27，P＜0.01）（圖 4b和表 1）。RPMI8226隨后轉(zhuǎn)染 TGF-β3 siRNA，結(jié)果表明CLDN1的表達(dá)受限（圖4c），使用Transwell小室檢測(cè) RPMI8226 CON組、RPMI8226 CLDN1 KO 組、RPMI8226 TGF-β3 siRNA 組、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA組細(xì)胞遷移的變化后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLDN1的敲除、TGF-β3的抑制均能抑制RPMI8226細(xì)胞的遷移，而同時(shí)抑制CLDN1與TGF-β3能夠進(jìn)一步抑制RPMI8226細(xì)胞的遷移能力（圖4d）。

表1 細(xì)胞外基質(zhì)分子（GO:0031012）中與CLDN1表達(dá)相關(guān)的基因

圖4 緊密連接蛋白1（CLDN1）調(diào)控的信號(hào)通路的探討[a：在GSE2658數(shù)據(jù)集中，篩選出CLDN1高表達(dá)與低表達(dá)樣本后，使用基因富集分析（GSEA）檢測(cè)通路的富集；b：GSE2658數(shù)據(jù)集中CLDN1與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3（TGF-β3）表達(dá)的相關(guān)性；c：RPMI8226細(xì)胞在轉(zhuǎn)染TGF-β3小干擾 RNA（siRNA）后，CLDN1、TGF-β3 蛋白表達(dá)的電泳圖；d：RPMI8226 CON 組、RPMI8226 CLDN1 KO 組、RPMI8226 TGF-β3 siRNA組、RPMI8226 CLDN1 and TGF-β3 siRNA組細(xì)胞遷移的變化比較，與RPMI8226 CON組比較，*P＜0.05，**P＜0.01]

3 討論

MM目前仍為預(yù)后較差的一種惡性疾病，我國(guó)患者中位生存期僅為3年，僅有少數(shù)患者能夠存活10年以上[6]。與此同時(shí)MM也是最早應(yīng)用靶向治療藥物的疾病之一，通過(guò)對(duì)MM發(fā)病過(guò)程中特異的通路進(jìn)行靶向治療能夠起到很好的效果，如2014年的一項(xiàng)研究中，在130例成人MM患者中應(yīng)用蛋白酶體抑制劑硼替佐米，使得1例患者達(dá)到完全緩解、49例患者達(dá)到部分緩解[7]。然而隨著腫瘤細(xì)胞的不斷演化，多種基因如PSMB5 A49T、C52F等位點(diǎn)突變介導(dǎo)的耐藥也備受關(guān)注[8]，而明確新的預(yù)后相關(guān)基因，并開(kāi)發(fā)新的靶點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)Cox生存分析與隨機(jī)森林算法結(jié)合的方式，得到了25個(gè)與患者總體生存率顯著相關(guān)的基因，而由該25個(gè)預(yù)后相關(guān)基因構(gòu)建的預(yù)后模型，在對(duì)患者 0.5、1、1.5、2、2.5、3 年生存率的預(yù)測(cè)中，該模型的AUC在0.5年最高，在3年總體生存率的預(yù)測(cè)中依然具有很好的性能。通過(guò)在本院MM樣本驗(yàn)證，25個(gè)基因中，CLDN1在7例MM患者中的mRNA與蛋白水平均呈現(xiàn)高表達(dá)，與此同時(shí)CLDN1的表達(dá)與患者的總體生存率高度相關(guān)，因此筆者選定CLDN1進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

目前已有的研究中，CLDN1又稱(chēng)Claudin 1，屬于跨細(xì)胞膜蛋白家族，其主要功能與細(xì)胞之間的緊密連接相關(guān)[9]，因此也被證實(shí)與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[10]、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]等進(jìn)程密切相關(guān)。MM中CLDN1的具體功能與機(jī)制尚未有報(bào)道，通過(guò)構(gòu)建CLDN1敲除細(xì)胞系，筆者證實(shí)了CLDN1的表達(dá)與MM細(xì)胞系的增殖、凋亡、遷移高度相關(guān)，初步證實(shí)了CLDN1的表達(dá)水平?jīng)Q定了MM細(xì)胞系的生物學(xué)特性，可能為MM的驅(qū)動(dòng)基因之一。因此筆者隨后在測(cè)試數(shù)據(jù)集中調(diào)取CLDN1的表達(dá)數(shù)據(jù)并計(jì)算細(xì)胞通路的富集，結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)通路在CLDN1高表達(dá)樣本中異常富集，隨后調(diào)取該通路（GO:0031012）中的所有基因，并與CLDN1表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出TGF-β3與CLDN1的表達(dá)呈正相關(guān)。TGF-β3屬于TGF-β家族，已被證實(shí)與MM的發(fā)病相關(guān)[12]。同時(shí)在結(jié)腸上皮細(xì)胞系中TGF-β家族的TGF-β1能夠誘導(dǎo)CLDN1的表達(dá)，因此筆者認(rèn)為T(mén)GF-β3可能通過(guò)同樣的機(jī)制調(diào)控CLDN1的表達(dá)[13]。筆者向RPMI8226細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了TGF-β3 siRNA，通過(guò)Western blot確定了敲低效率后，進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β3的抑制能夠降低CLDN1的表達(dá)，初步證實(shí)TGF-β3對(duì)CLDN1的調(diào)控，而在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，TGF-β3、CLDN1的抑制均能降低細(xì)胞的遷移能力，且兩者具有協(xié)同作用。

綜上所述，本研究確定了25個(gè)預(yù)后相關(guān)基因?qū)颊呱娴念A(yù)測(cè)作用，并確定了其中與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的癌基因CLDN1，同時(shí)初步證實(shí)了CLDN1與TGF-β3之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)靶向藥物提供了基礎(chǔ)。