同位素標(biāo)記的靶向藥物體外篩選研究

黃立群,李曙芳,周文華,孫鴿,秦秀軍,李建國(guó)

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP中心，太原，030006)

0 引言

藥物篩選是新藥研究開(kāi)發(fā)的起點(diǎn)和重要環(huán)節(jié)，篩選的靶點(diǎn)包括受體、酶、離子通道等，其中受體參與機(jī)體的各種生理和病理過(guò)程，是藥物篩選的主要靶標(biāo)之一[1]。受體是細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)識(shí)別、接收、傳遞、放大信號(hào)的一類生物大分子，能引起靶細(xì)胞產(chǎn)生生物效應(yīng)。受體與配體的相互作用具有高特異性、高選擇性、高親和性、飽和性和可逆性等特點(diǎn)，現(xiàn)有藥物中超過(guò)50%的藥物以受體為作用靶點(diǎn)[2]。

單克隆抗體、多肽等配體標(biāo)記放射性核素后，通過(guò)與受體的特異性結(jié)合可以達(dá)到顯像或治療的目的。藥物篩選是通過(guò)規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)手段從大量化合物或新化合物中選擇對(duì)某一特定作用靶點(diǎn)具有較高活性化合物的過(guò)程，成像技術(shù)的發(fā)展使得基于熒光標(biāo)記和配體的檢測(cè)成為可能，盡管熒光標(biāo)記法已廣泛用于細(xì)胞親和性實(shí)驗(yàn)，但基于同位素標(biāo)記的親和性試驗(yàn)具有靈敏度高、專一性好、更好模擬核素標(biāo)記靶向性等特點(diǎn)[3]。蛋白質(zhì)配體-受體的作用本質(zhì)上是蛋白質(zhì)的相互作用，其親和性基于蛋白質(zhì)相互作用的理論，但實(shí)際操作中要想精確測(cè)定面臨許多挑戰(zhàn)[4]。其中最重要的兩點(diǎn)是親和反應(yīng)的平衡時(shí)間和配體的消耗，親和反應(yīng)的平衡高度依賴于配體的濃度和親和性的強(qiáng)弱，通常需要數(shù)小時(shí)達(dá)到平衡；親和性的精確測(cè)定需要對(duì)平衡時(shí)自由配體的濃度進(jìn)行測(cè)定，通常假定實(shí)驗(yàn)起始時(shí)的配體濃度等于平衡時(shí)自由配體的濃度，這個(gè)假設(shè)成立的前提是系統(tǒng)中起始配體的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于受體的濃度，如果配體消耗較多，會(huì)導(dǎo)致親和曲線右移，使解離常數(shù)Kd較實(shí)際值偏大，只有基于合適的體系，才能準(zhǔn)確測(cè)定配體-受體的親和性[5]。

PSMA-617是已遞交FDA上市申請(qǐng)的PSMA靶向藥物，用于轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌的靶向放射配體治療，其結(jié)構(gòu)包含3部分，左側(cè)為PSMA靶向單元，右側(cè)為DOTA結(jié)構(gòu)，用于螯合金屬離子，中間部分為連接結(jié)構(gòu)。PSMA-617結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)在離體條件下，基于人前列腺癌LNCaP細(xì)胞表面前列腺癌細(xì)胞膜抗原(PSMA)靶點(diǎn)，通過(guò)與125I標(biāo)記的靶向藥物A(由PSMA-617右側(cè)單元改為酪胺基團(tuán)而成，用于125I的標(biāo)記)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，篩選特異性結(jié)合的靶向配體，并比較其親和性大小，從而建立靶向藥物的體外同位素標(biāo)記篩選方法。

圖1 PSMA-617結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人前列腺癌細(xì)胞，南京科佰生物科技有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶，Gibco公司。磷酸緩沖液，上海生工生物工程有限公司。DMSO，索萊寶生物技術(shù)有限公司。Na125I溶液，中國(guó)同輻股份有限公司。多孔過(guò)濾板、篩選架，Millipore公司。化合物A為靶向PSMA已知配體，B、C、D和E為待測(cè)配體，對(duì)PSMA-617靶向單元進(jìn)行了改進(jìn)，親和特異性未知。

1.2 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

人前列腺癌細(xì)胞，用含有15%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)按照1∶3傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%～80%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 125I標(biāo)記與質(zhì)控

125I標(biāo)記采用氯胺-T法，吸取1 nmol的多肽溶液，2.0 mCi的Na125I溶液充分混勻，在混合液中加入14 μL的氯胺-T溶液，混勻后室溫靜置5 min，加入2 μL的抗壞血酸鈉溶液，混勻2 min，加入HLB柱抽提，經(jīng)2次純化后使用。薄層層析法檢測(cè)標(biāo)記化合物的放化純度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

(1)Binding buffer 溶液配制：取47.5 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，加入2.5 mL 5%BSA溶液，混勻待用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(2)125I標(biāo)記配體工作液配制：根據(jù)原溶液放射性活度濃度用Binding Buffer溶液稀釋混勻，配制成放射性濃度約為0.4 μCi/mL的125I-A放射性標(biāo)記配體工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(3)配體工作液配制：A-D配制成濃度為2 000 μmol/L的儲(chǔ)備液，吸取儲(chǔ)備液5 μL，加入245 μL Binding buffer溶液中，混勻配制成40 μmol/L的工作液。依次取20 μL按10倍梯度用Binding buffer溶液，按10倍梯度逐級(jí)稀釋，配制配體工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2劑量與分組

設(shè)計(jì)空白對(duì)照組(不含細(xì)胞)、陽(yáng)性對(duì)照組(含細(xì)胞，不含配體)、化合物組，化合物組包括待測(cè)配體B、C、D、E及參考配體A，每種化合物分別設(shè)置6組，組1、組2、組3、組4、組5、組6的配體溶液終濃度分別為0.1、1、10、100、1 000、10 000 nM。

1.4.3親和性試驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用Binding buffer(RPMI 1640加上0.25%BSA，防止非特異性結(jié)合)溶液懸浮配制成濃度為(1～3)×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL的量將細(xì)胞懸液接種于96孔過(guò)濾板中(空白組除外，空白組加入150 μL的Binding buffer)。每孔中分別加入50 μL的125I-A放射性標(biāo)記化合物(每孔總放射性活度約0.02 μCi)?；衔锝M分別加入50 μL系列梯度濃度工作液，陽(yáng)性對(duì)照組加入50 μL的Binding buffer。每個(gè)濃度和組別均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以參考配體A為例，每組化合物的試驗(yàn)體系中各種組分加樣體積列于表1。

表1 每組化合物的試驗(yàn)體系中各種組分加樣體積(以參考配體A為例)

在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后抽濾，每孔加入200 μL Binding buffer溶液清洗抽濾3次。將板托取下晾干后，小心撕下濾膜放置于離心管底部，γ-counting檢測(cè)計(jì)數(shù)。

1.4.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

計(jì)算公式：

式中，Cs為系列濃度受試物放射性計(jì)數(shù)；Cc為陽(yáng)性對(duì)照組放射性計(jì)數(shù)；Cb為空白對(duì)照組放射性計(jì)數(shù)。

以125I-A結(jié)合率為縱坐標(biāo)，logM濃度為橫坐標(biāo)，通過(guò)GraphPad Prism5.0線性回歸分析計(jì)算受試物的IC50濃度(即競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合50%125I-A的受試物濃度)，建立擬合曲線計(jì)算IC50。

根據(jù)IC50值大小可以判斷化合物與PSMA靶點(diǎn)親和性的相對(duì)大小，IC50越小，化合物與PSMA靶點(diǎn)的親和性越高。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 125I-A標(biāo)記及質(zhì)量控制

125I-A標(biāo)記放化純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。放射化學(xué)純度受制備方法及原料的化學(xué)純度、產(chǎn)物存放條件等影響，對(duì)于體外篩選研究，一般放化純度控制在90%以上。由圖2可見(jiàn)，125I-A的標(biāo)記放化純度達(dá)到了91.92%，滿足體外篩選實(shí)驗(yàn)需要。將醇洗餾分加入含0.5% VC-Na的pH 7.5磷酸溶液中，混勻后分裝保存于-80 ℃，可穩(wěn)定保存1個(gè)月以上。

圖2 125I-A標(biāo)記放化純度

2.2 親和性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

化合物A、B、C、D、E的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合擬合曲線見(jiàn)圖3，IC50值列于表2。由表2可見(jiàn)，與PSMA靶點(diǎn)的親和性由大到小的化合物為：C>B>A>D>E，即化合物C與PSMA靶點(diǎn)的親和性最高。

表2 化合物的LogIC50和IC50擬合值

圖3 化合物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合擬合曲線圖

親和性試驗(yàn)中必須考慮非特異性結(jié)合，放射性配體除了結(jié)合我們感興趣的靶點(diǎn)外，還可以與其他物質(zhì)非特異的結(jié)合，如細(xì)胞膜、多孔板、濾膜甚至其他受體等，從而產(chǎn)生不依賴于靶點(diǎn)的“背景”信號(hào)。非特異性結(jié)合的水平可以通過(guò)增加非標(biāo)記配體量從而完全占據(jù)結(jié)合靶點(diǎn)(替代放射性配體)時(shí)的放射性計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。理想的親和性實(shí)驗(yàn)中，放射性配體應(yīng)有較高親和性，較低的非特異性結(jié)合，高度的特異性結(jié)合(70%～100%)。降低非特異性結(jié)合可以提高特異性結(jié)合比率，通常降低非特異性結(jié)合的方法有：控制反應(yīng)體系中受體的含量，非特異性結(jié)合通常隨著受體濃度的增加而增加；多孔板使用BSA或聚乙烯預(yù)處理可以降低非特異性吸附；另外過(guò)濾和緩沖液的清洗可以清除大多數(shù)非特異性結(jié)合信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)中，Binding buffer中添加了0.25%BSA，最后buffer清洗3次可以顯著降低非特異性結(jié)合，對(duì)于管壁和濾膜的非特異性吸附通過(guò)設(shè)定空白組，計(jì)算特異性結(jié)合率時(shí)進(jìn)行了扣除，最終特異性結(jié)合率控制在了85%以上，滿足親和性試驗(yàn)要求。

3 討論

與基于可溶性蛋白質(zhì)的體外實(shí)驗(yàn)相比，基于細(xì)胞的配體-受體親和性試驗(yàn)具有內(nèi)源性的優(yōu)點(diǎn)，可以防止受體形成復(fù)合物，影響親和實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]。細(xì)胞親和性實(shí)驗(yàn)有直接測(cè)定法和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法，直接測(cè)定法是將系列梯度濃度的標(biāo)記化合物與細(xì)胞共同孵育，達(dá)到平衡后分離上清液，測(cè)定細(xì)胞的標(biāo)記化合物含量，根據(jù)結(jié)合率計(jì)算親和性曲線。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合是在上述體系中引入定量的標(biāo)記配體，待測(cè)配體與標(biāo)記配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞表面受體，最后測(cè)定細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性配體的含量，建立競(jìng)爭(zhēng)性擬合曲線圖，求得IC50值，由Cheng-Prusoff方程可以計(jì)算化合物的Kd值

方程中已知競(jìng)爭(zhēng)性配體的Kdcompetitor值和競(jìng)爭(zhēng)性配體的濃度，根據(jù)測(cè)得的IC50值，可以間接求得待測(cè)化合物的Kd值,但應(yīng)注意競(jìng)爭(zhēng)性配體的Kdcompetitor值必須是基于同樣條件下在同種細(xì)胞內(nèi)測(cè)得的結(jié)果[7]。無(wú)論直接或者間接方法，盡管親和性試驗(yàn)容易開(kāi)展，但Kd值的精確測(cè)定仍面臨挑戰(zhàn)，受操作者和試驗(yàn)條件的影響較大。但在早期候選藥物篩選過(guò)程中，依據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)得的IC50值判斷其親和性相對(duì)大小，可以滿足早期候選化合物篩選的需要。

藥物篩選中常使用的放射性同位素有14C、3H、125I、131I等，在使用上各有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)標(biāo)記物、供應(yīng)和實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的核素。使用C和H標(biāo)記不改變化合物的結(jié)構(gòu)及免疫學(xué)活性，且半衰期很長(zhǎng)，制備的標(biāo)記物可以長(zhǎng)時(shí)間放置，但標(biāo)記過(guò)程較為復(fù)雜，難以獲得高比放射性的標(biāo)記物，并且衰變產(chǎn)生弱β射線，需要液體閃爍計(jì)數(shù)器才能準(zhǔn)確測(cè)量，測(cè)量步驟繁瑣，對(duì)于碘標(biāo)記容易喪失免疫化學(xué)或生物活性的藥物才考慮使用該方法[8]。碘供應(yīng)的方便性、較低的價(jià)格及高效率的樣本檢測(cè)使其成為藥物篩選試驗(yàn)中最常用的核素，相較于131I，125I的使用有更多的優(yōu)勢(shì)，首先，半衰期適中，允許核素和標(biāo)記化合物的貯存和應(yīng)用；其次衰變發(fā)射低能γ射線，輻射自分解少，標(biāo)記化合物能穩(wěn)定貯存，同時(shí)對(duì)操作人員的防護(hù)要求較低。