小反芻獸疫疫苗研究進展

李 菊，和偉程，柏家林

(1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)通過呼吸道和消化道感染引起的一種急性傳染病，短時間內(nèi)可侵襲所有重要器官[1].PPRV主要感染山羊和綿羊，導致極高的發(fā)病率和死亡率，中亞地區(qū)的瀕危動物賽加羚羊也深受影響[2-3].根據(jù)PPRV 核衣殼(Nucleocapsid protein,N)蛋白和融合(Fusion protein,F)蛋白基因的部分序列，將其分為4個譜系，但發(fā)病早期病毒致病性沒有譜系特異性差異[4].該病的潛伏期一般為4～6天，早期感染在局部淋巴組織中[5]，感染后5～10天傳染性最強[6]，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、白細胞減少及排泄物增多等，通過組織學檢測可在病畜脾臟、淋巴結(jié)和胸腺中檢測到糜爛性壞死.PPR的實驗室確診需通過病毒分離、聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)和病毒中和試驗(Virus neutralization test,VNT)三個金標準.在資源有限的環(huán)境下，側(cè)流裝置(Lateral-flow device,LFD)和逆轉(zhuǎn)錄重組聚合酶擴增(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)檢測技術(shù)可為檢測PPRV提供一個簡單、快速、可靠的檢測平臺.有人認為進行PPRV分子診斷時鼻拭子是首選標本[7-8].

PPRV 于1942年首次在西非的科特迪瓦被發(fā)現(xiàn)，曾在非洲、中東和亞洲等地區(qū)流行并造成重大經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)列為未來15年必須消滅的跨界疫病.2007年在我國西藏首次爆發(fā)小反芻獸疫，2013—2014年間該病在我國22個省市流行開來[9-10]，2018年在我國甘肅西北部造成少量綿羊死亡[11]，由此PPRV疫苗的開發(fā)就顯得十分重要.

1 病毒分子結(jié)構(gòu)及流行病學

1.1 病毒分子結(jié)構(gòu)

PPRV是15 948個核苷酸組成的無節(jié)段單股負鏈有包膜的RNA病毒，由3'N、P、M、F、H和L5' 6個轉(zhuǎn)錄單元組成.根據(jù)開放閱讀框架和RNA編輯的不同，可編碼8種蛋白質(zhì)，包括核衣殼(N)蛋白、基質(zhì)(Matrix protein,M)蛋白、聚合酶(Large virus-specified RNA polymereasprotien,L)或大蛋白、磷(Phospho protein,P)蛋白、血凝素(Hemagglutinin protein,H)和融合(F)蛋白6種結(jié)構(gòu)蛋白以及2種非結(jié)構(gòu)蛋白C和V.N、P和L蛋白形成的核糖核蛋白復合物(Ribonucleoprotein complex,RNP)包裹病毒RNA，形成大小為400～500 nm的包膜顆粒.兩個跨膜糖蛋白F和H位于病毒包膜上.在包膜的內(nèi)表面，M蛋白作為橋梁將F和H蛋白的胞質(zhì)尾部連接到RNP上.

1.2 流行病學

PPRV宿主廣泛，可在種內(nèi)和種間傳播和流行，除了典型宿主山羊和綿羊，在其他許多物種中也分離出了該病毒包括牛、駱駝、豬、狗和亞洲獅等.PPRV對山羊高度易感，致病率和死亡率可高達100%，但是PPRV的致病機制及傳染性與菌株的毒力和宿主的種類以及年齡等多種因素有關，如不同的山羊發(fā)病嚴重程度不同，死亡率也不盡相同，綿羊常表現(xiàn)為亞臨床癥狀，在PPRV的傳播中起著重要作用[12].牛和駱駝幾乎不表現(xiàn)出臨床癥狀，是PPRV的死胡同宿主[13-15].而豬和野豬有可能作為PPRV的傳染源[14]，對其他易感物種造成潛在的感染風險，成為根除PPR的障礙.有研究表明，PPRV的宿主譜仍在逐漸擴大[16-17].了解疾病流行地區(qū)PPRV在宿主中的流行特點，可為開發(fā)一種針對多種宿主有用的新型疫苗提供思路.

2 疫苗的開發(fā)

在麻疹病毒屬6個成員中，PPRV與牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)關系最近，在過去常用RPV減毒活疫苗來控制PPRV.隨著RPV的根除和無牛瘟區(qū)域策略的實施，RPV疫苗被禁用.根據(jù)RPV根除經(jīng)驗，研究人員利用連續(xù)培養(yǎng)致弱的方法先后開發(fā)了4種減毒活疫苗，這幾種疫苗在流行地區(qū)取得不錯的免疫成效，但PPRV減毒活疫苗無法區(qū)分自然感染動物和接種動物(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA)并且耐熱性低，導致PPR仍在很多地區(qū)相繼出現(xiàn)并造成重大的經(jīng)濟損失.雖然采用穩(wěn)定劑和冷凍干燥循環(huán)可提高其耐熱性[18]，但這也增加了疫苗生產(chǎn)成本，難以在PPR流行的發(fā)展中國家推行.因此耐熱的新型DIVA疫苗成為近年來的研究熱點，并在重組亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和聯(lián)合疫苗方面取得了一定的成就，滅活疫苗的開發(fā)也頗具進展.

2.1 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗由病原功能性結(jié)構(gòu)蛋白制成，與傳統(tǒng)減毒活疫苗相比，此類疫苗安全性更高、免疫保護性更強，是PPRV根除運動中的候選疫苗.PPRV H和F是病毒的兩種主要抗原蛋白，H蛋白包含較多中和抗體表位和少數(shù)T細胞表位，主要誘導中和抗體的表達;F蛋白包含許多T細胞表位，主要誘導特異性抗體表達.這兩種蛋白均能激發(fā)保護性免疫抵抗PPRV的侵害[19]，是開發(fā)PPRV新型重組亞單位疫苗的良好靶蛋白.

Rojas等構(gòu)建了含PPRV F和H基因的重組復制缺陷型人5型腺病毒(Adenovirus 5,Ad5)，并將該重組病毒感染HEK293A細胞，獲得表達F或H蛋白以及同時表達F和H蛋白的兩種重組亞單位疫苗，用肌肉接種的方法兩次免疫小鼠，可誘導小鼠體內(nèi)PPRV特異性B細胞和T細胞應答.攻毒試驗也表明該疫苗可抵抗PPRV強毒株的攻擊，使綿羊免受PPRV的侵害[20-21].Herbert等也對該重組亞單位疫苗在山羊體內(nèi)的免疫原性進行了評價，結(jié)果表明,單次接種Ad-H即可誘導高水平的病毒特異性抗體和中和抗體，能完全保護山羊免受強毒PPRV的攻擊[22]，阻斷病毒的傳播.Holzer等測定發(fā)現(xiàn),0.1PFU劑量的Ad疫苗即可保護東非山羊免受PPRV攻擊[23].Fakri等以羊痘病毒(Sheep and goat pox virus,SGPV)為載體表達H或F蛋白，或同時表達H和F蛋白產(chǎn)生重組山羊痘病毒.在山羊和綿羊身上進行安全性和有效性評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn),同時表達H和F蛋白的重組SGPV疫苗對PPR有較早和較強的免疫力[24].最近，Murr等證實，表達F蛋白的重組新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗可以預防PPR，且具有DIVA疫苗適用性和高耐熱性[25]，值得深入研究.

以上研究表明,利用病毒載體制備的重組亞單位疫苗對羊群具有較強的保護作用，同時符合新型DIVA疫苗開發(fā)原則，但重組亞單位疫苗不能長時間產(chǎn)生高水平抗體，因此，這類疫苗在有效保護周期上存在一定缺陷.

2.2 病毒樣顆粒疫苗

PPRV M蛋白可促進病毒的組裝和釋放，當M蛋白與H、F或N蛋白中的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白共表達時，可自行組裝成形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子極為相似的病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)，并以出芽方式釋放[26-27].VLPs表面具有高度重復的氨基酸(AA)結(jié)構(gòu)，可誘導B細胞活化和產(chǎn)生高滴度抗體，具有較強的免疫原性和生物學活性，免疫動物時不需要添加佐劑.VLPs可通過血清學檢測區(qū)分自然感染和接種疫苗的動物，并且VLPs不含感染性基因組[28-29]，不存在毒力返強的可能，是安全的候選疫苗.桿狀病毒表達系能高效表達多種外源蛋白，通常只感染昆蟲，對人畜不構(gòu)成危害，因此,桿狀病毒廣泛應用于病毒樣顆粒等疫苗的研制.

Liu等將PPRV開放閱讀框(ORF)密碼子優(yōu)化的H和M以及天然N基因插入桿狀病毒中構(gòu)建重組桿狀病毒，通過免疫共沉淀、Western blot等方法檢測到M、H和N蛋白在Sf9昆蟲細胞中共表達，成功構(gòu)建昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)，并通過透射電鏡在細胞膜上觀察到VLPs[30].產(chǎn)生的PPRV-VLPs經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后免疫小鼠和山羊，可激發(fā)較強的體液免疫和細胞免疫，保護小鼠和山羊免受PPRV的攻擊[31].Li等人在昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)中共表達PPRV M和H蛋白或 F蛋白，生成含M和F或M和H蛋白的兩種PPRV VLPs，免疫小鼠和山羊可誘導產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體，并促進淋巴細胞增殖.在不使用佐劑的情況下，含有H基因的 VLPs引起的免疫應答與使用PPRV疫苗引起的免疫應答效果幾乎沒有差異[32].Yan利用昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)共表達PPRV M、H、F和N蛋白，獲得含有4種與保護性免疫有關蛋白的PPRV- VLPs.將這種VLPs免疫小鼠和山羊后誘導特異性抗體和針對PPRV的中和抗體表達，產(chǎn)生保護性免疫[33].隨后，他們又將來自IV系Tibet/30株和II系Nigeria75/1株的這4種基因分別插入桿狀病毒，構(gòu)建兩種重組桿狀病毒，在High Five高表達細胞系中共表達，產(chǎn)生了兩種PPRV -VLPs，免疫小鼠、山羊和綿羊發(fā)現(xiàn)兩種VLPs均能誘導較強的體液免疫應答[34].VLPs疫苗具備生產(chǎn)新型疫苗的全部條件，但是VLPs卻不能在機體內(nèi)復制，保護周期也短.另外,VLPs制備組裝工藝復雜，較大程度地限制了該類疫苗的發(fā)展．

2.3 聯(lián)合疫苗

聯(lián)合疫苗可誘導中和反應對抗多種小反芻動物疫病，而PPRV易與其他病毒發(fā)生并發(fā)感染，如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)[7]、藍舌病病毒(Luetongue virus，BTV)[35]和山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)[36]等，因此聯(lián)合疫苗的研發(fā)就顯得很有必要.Hosamani等用PPRV弱毒株和GTPV研發(fā)的聯(lián)合疫苗，免疫山羊后可在山羊體內(nèi)誘導保護性免疫反應，且在各組分疫苗間不存在免疫原性干擾[37].Wang等發(fā)現(xiàn)，Ad-H和Ad-F聯(lián)合免疫能對山羊產(chǎn)生很好的保護作用，誘導產(chǎn)生的免疫反應強于單獨使用Ad-H或Ad-F免疫[22-38].

反向遺傳學操作系統(tǒng)具有開發(fā)聯(lián)合疫苗的巨大潛力.該系統(tǒng)利用反向遺傳學等技術(shù)拯救出感染性基因定點突變的RNA減毒病毒株，獲得反向遺傳學致弱的活疫苗株.2012年，Hu等利用“分段克隆”的方法克隆出PPRV基因組全長 cDNA，首次建立了PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)拯救出綠色熒光蛋白(GFP)標記的重組PPRV，并且GFP可在10代以內(nèi)穩(wěn)定表達[39].Yin隨之利用PPRV操作系統(tǒng)，以PPRV為載體構(gòu)建表達外源FMDVVP1的重組病毒.該重組病毒株在山羊體內(nèi)誘導產(chǎn)生PPRV和FMDV的中和抗體，抵抗FMDV和PPRV的攻擊，為新型PPRV和FMDV雙重活疫苗的研究開發(fā)奠定了基礎[40].Liu構(gòu)建反向遺傳系統(tǒng)并在體外拯救表達細粒棘球絳蟲EG95抗原的重組PPRV.雖然重組PPRV復制緩慢，但能有效地表達細粒棘球絳蟲EG95抗原[41]，值得進一步研究.

利用反向遺傳操作系統(tǒng)制備的聯(lián)合疫苗毒力返強可能性小，安全性更高，且兼具減毒活疫苗的優(yōu)點，但不足之處是該疫苗不具備DIVA性能.雖然耐熱的新型疫苗是控制和根除該病的關鍵，但聯(lián)合疫苗可大大降低疫苗接種成本，在小反芻動物多種疫病流行區(qū)具顯著優(yōu)勢.利用反向遺傳操作系統(tǒng)還可針對基因突變的PPRV制備相應的PPRV反向遺傳致弱活疫苗，是解決PPRV遺傳進化比較有效的措施.

2.4 滅活疫苗

Chen等用含有表達H或F蛋白的重組羊痘病毒疫苗免疫山羊，發(fā)現(xiàn)該疫苗可刺激產(chǎn)生高水平保護性免疫，但在已有抗羊痘病毒抗體存在的情況下，該疫苗對PPRV的抗體反應水平會降低，不能抵抗PPRV強毒的攻擊，甚至出現(xiàn)臨床癥狀[42].滅活疫苗通常不受已有抗體的影響，因此開發(fā)滅活疫苗具有一定的優(yōu)勢.Cosseddu等開發(fā)了一種針對PPRV的滅活疫苗，該疫苗免疫山羊36天后鼻腔感染強毒PPRV.臨床顯示該疫苗對PPRV的感染和復制有阻斷作用[43].在PPRV非流行地區(qū)，結(jié)合佐劑菊粉和TLR9寡核苷酸激活劑的PPRV滅活疫苗具有很強的吸引力，是減毒活疫苗很好的替代品[44].但滅活疫苗誘導的抗體滴度易受時間影響，需定期接種加強其免疫效果，不利于大規(guī)模使用.

3 總結(jié)與展望

小反芻獸疫嚴重威脅著我國的動物衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)的發(fā)展，需要采取嚴厲的強制預防控制措施.目前控制該病最理想的方法是接種疫苗，因此研制安全、有效、熱穩(wěn)定性高的DIVA疫苗是現(xiàn)今研究工作的首要任務.安全可靠、可復制的動物模型不僅可以進行PPR臨床癥狀和發(fā)病機制的研究，還可以建立評估疫苗活性和效價的動物模型，對PPR疫苗的開發(fā)具有重要意義，對聯(lián)合疫苗有效性的評估也極為重要.因為制備聯(lián)合疫苗時，需進行大量動物試驗證明各個免疫成分之間互不干擾，方可進行本體試驗.Ronchi等認為大鼠模型是預測山羊接種疫苗反應的有用模型[44].最近Enchery等建立了山羊攻毒模型，并利用該模型成功評估了減毒疫苗的活性[45].成功建立可靠的動物模型，會使我們離根除PPR目標更近一步.總之，要實現(xiàn)2030年全面消除PPR的最終目標，在PPR疫苗尚不成熟的今天，應積極加強對抵抗和防御外來病的宣傳和教育，同時建立PPRV的動物模型，以便于PPRV病原學的深入研究，明晰其分子致病機制和臨床癥狀，建立高效、快速的病原檢測新方法，開發(fā)出高效耐熱的DIVA疫苗.