高鹽飲食抑制細胞自噬損傷腸屏障功能的研究

雷 超 劉 聰 李曉媚 李 晨 劉志華 劉 亭

腸屏障功能損傷與多種慢性疾病如2型糖尿病、高血壓的發(fā)展有關，因其屏障功能受損時，腸道內(nèi)共生菌產(chǎn)生的脂多糖、肽聚糖和其他毒素甚至細菌都可以穿過腸道進入外周血液循環(huán)產(chǎn)生慢性炎癥[1-2]，從而危害人體健康，因此維護腸屏障的正常功能對人類健康顯得至關重要。在腸道內(nèi)，腸屏障、腸道菌群和免疫系統(tǒng)三者之間維持著相對平衡，細胞自噬通過參與機體抵御腸道菌群侵襲、保持腸屏障完整性從而調(diào)節(jié)腸屏障功能的穩(wěn)態(tài)，細胞自噬是細胞質(zhì)的降解方式之一，通過這種方式細胞內(nèi)的受損物質(zhì)被運送到溶酶體降解，之后為細胞提供能量或合成大分子前體物質(zhì)[4]，當細胞自噬功能紊亂時，腸上皮細胞受損并影響屏障功能[5]，探究細胞自噬功能失調(diào)機制和影響的因素是闡明腸屏障穩(wěn)態(tài)機制的迫切需要。

中國大部分人的每日鹽攝入量都大于其生理需要量，過量的鹽攝入量對人體健康的危害越來越被人們所重視[6]，近期的研究顯示高鹽飲食損傷腸上皮物理屏障[7]，然而高鹽飲食對腸屏障功能損傷的影響還未得到充分研究，其具體機制仍不清楚。此外有研究發(fā)現(xiàn)高鹽狀態(tài)可誘導低氧誘導因子1(HIF1A)介導的細胞自噬，同時細胞內(nèi)Na+濃度升高可觸發(fā)活性氧(ROS)依賴性的細胞自噬上調(diào)，關于高鹽飲食是否通過調(diào)節(jié)細胞自噬影響腸屏障的功能未見報道，本研究通過細胞和動物實驗探索高鹽飲食是否與腸屏障損傷有關，并探索細胞自噬是否參與調(diào)控腸屏障穩(wěn)態(tài)，為腸屏障功能受損的防治提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級5周大的雄性C57BL/6小鼠購買于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗之前先適應性喂養(yǎng)7天，小鼠均喂養(yǎng)相同的飲用水和維持飼料或高鹽維持飼料，室溫維持在(22±2)℃，保持每天12個小時的光照，喂養(yǎng)12周后腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉處死取結腸組織于-80 ℃凍存，取一小部分腸組織用于HE染色。實驗通過了廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院實驗動物倫理委員會的動物倫理審查。

1.2 主要試劑

喂養(yǎng)老鼠的普通維持飼料和高鹽飼料均購買于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，普通飼料和高鹽飼料的NaCl含量分別為0.2%，8%，氯化鈉(NaCl)購買于廣州化學試劑廠，western blotting 鼠抗，兔抗，小鼠抗 β-actin 抗體，鼠抗ZO-1抗體，鼠抗Atg5抗體，兔抗LC3II/I抗體均購自abcam公司，F(xiàn)ITC標記葡聚糖購買于上海西寶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FITC-dextran實驗 小鼠喂養(yǎng)12周后，隔夜禁食不禁水，第二日清晨將FITC-dextran溶于水，并以100 mg/kg的量給小鼠灌胃，4小時后經(jīng)小鼠腹主動脈取800 μL全血，以200 g轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層無色血漿100 μL用于熒光強度測定。

1.3.2 HE染色觀察腸組織形態(tài)學變化 取一部分腸組織用冷生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中固定，24 h后將其修剪后置于包埋盒中脫水過夜; 次日進行浸蠟、包埋，冷凝后進行組織切片、烤片; 將切片進行脫蠟水化并染色，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片; 在光學顯微鏡下觀察腸組織形態(tài)學變化。

1.3.3 Western blotting 使用 RIPA 提取腸組織裂解物，使用SDS-PAGE分離膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，使用 5%胎牛血清 4℃封閉膜過夜。分別孵育 ZO-1、Occludin、Atg5 及 LC3II/I一抗(濃度 1 ∶1000)及二抗(1 ∶5 000)，最后用 ECL 底物試劑盒檢測，重復 3次實驗。

1.3.4 細胞培養(yǎng)和氯化鈉處理 使用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)腸癌細胞株Coco2，置于 37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育。取處于對數(shù)生長期的細胞株至添加了0,50,80,100 mmol/L濃度NaCl的培養(yǎng)基，待細胞生長密度約為 70%時收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.5 細胞轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期的腸癌細胞株coco2，待細胞生長密度約為 70%時進行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng) 48 h 后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 腸通透性的變化

高鹽飲食對小鼠腸屏障通透性的影響見圖1，F(xiàn)ITC通透性結果顯示，與正常飲食組小鼠相比，高鹽飲食組小鼠血漿FITC-dextran濃度明顯升高(P<0.05)。

圖1 NSD組和HSD組小鼠FITC-dextran法測定腸通透性結果,NSD(正常飲食組)，HSD(高鹽飲食組)

圖2 NSD組和HSD組小鼠結腸組織的HE染色觀察,NSD(正常飲食組)，HSD(高鹽飲食組)

2.2 結腸組織HE染色變化

高鹽飲食對結腸組織形態(tài)學的影響見圖3，HE 染色可見正常飲食組小鼠結腸上皮絨毛光滑平整，杯狀細胞較多，高鹽飲食組小鼠結腸上皮絨毛缺損不平整，杯狀細胞減少。

2.3 結腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達變化

高鹽飲食對結腸緊密連接蛋白的影響見圖3，Western blot結果顯示，與正常飲食組小鼠相比，高鹽飲食組小鼠ZO-1、Occludin表達明顯降低(P<0.05)。

2.4 結腸組織中細胞自噬變化

高鹽飲食對結腸自噬相關蛋白的影響見圖4，Western blot結果顯示，與正常飲食組小鼠相比，高鹽飲食組小鼠ATG5、LC3II/I 表達明顯降低(P<0.05)。

2.5 NaCl對coco2結腸癌細胞自噬的影響

添加到培養(yǎng)基中的NaCl濃度梯度分別是0、50、80、100mmol/L，NaCl對Coco2細胞腸屏障和自噬蛋白表達的影響見圖5，Western blot結果顯示，隨著NaCl濃度的遞增，ATG5、LC3II/I比值呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢，此與動物實驗的結果一致。

2.6 敲低Atg5表達對ZO-1、Occludin的影響

細胞自噬對腸緊密連接的影響見圖6，Western bolt結果顯示，coco2細胞株敲低ATG5表達后，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達均明顯下降(P<0.05)。

3 討論

結腸作為腸道內(nèi)菌群定植的主要部位，結腸上皮面臨著體內(nèi)共生菌和飲食中多種物質(zhì)的刺激，因此健康的飲食習慣對維持結腸屏障穩(wěn)態(tài)至關重要，而不健康的飲食習慣如高鹽飲食、高脂飲食已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可通過影響腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)進一步對機體產(chǎn)生不利的影響，近年來研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食誘導小鼠腸Th17/Treg失衡,表現(xiàn)為增加腸道固有層Th17細胞的反應性、降低Treg細胞的免疫抑制功能，從而使結腸上皮層促炎性介質(zhì)聚集損傷腸上皮屏障[8]，之后Jingjuan Hu等觀察到高鹽飲食影響了結腸上皮物理屏障，如ZO-1、Occludin蛋白表達下降，Claudin-2蛋白表達增加[7]。參照前期高鹽飲食有害作用的研究文獻[9-10]，其中實驗組大多選用氯化鈉濃度為8%的飼料，因此本研究采用含濃度為8%的氯化鈉的高鹽飲食飼料喂養(yǎng)小鼠，同時并未在小鼠飲用水中添加氯化鈉，以期更好地模擬中國人的高鹽飲食習慣，結果不僅顯示緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達下降，而且結腸組織HE染色發(fā)現(xiàn)高鹽飲食導致結腸上皮形態(tài)學變化，如絨毛缺損，杯狀細胞減少，然而前期的其它研究并未發(fā)現(xiàn)這一表型，可能原因是本研究高鹽飲食喂養(yǎng)時間長達4個月，明顯長于前期研究，2個月或3個月時結腸組織形態(tài)學還未發(fā)生明顯變化。另外本研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食增加了腸屏障通透性，這暗示高鹽飲食損傷腸屏障不僅影響到腸內(nèi)組織，增加的通透性可能為腸道菌群和其產(chǎn)生的代謝物進入外周血液循環(huán)影響機體其它系統(tǒng)提供了機會。

圖3 NSD組和HSD組小鼠結腸組織ZO-1、Occludin的蛋白水平變化,NSD(正常飲食組)，HSD(高鹽飲食組)

圖4 NSD組和HSD組小鼠結腸組織LC3II/I、ATG5的蛋白水平變化,NSD(正常飲食組)，HSD(高鹽飲食組)

圖5 Western blot檢測Coco2細胞在不同濃度NaCl處理下自噬相關蛋白LC3II/I、ATG5表達的變化,NSD(正常飲食組)，HSD(高鹽飲食組)

圖6 敲低ATG5表達后Western blot檢測Coco2細胞緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達的變化,NSD(正常飲食組)，HSD(高鹽飲食組)

細胞自噬與細胞凋亡、細胞衰老一樣，是十分重要的生物學現(xiàn)象[11]，細胞自噬是高度保守的通過溶酶體介導對受損的蛋白質(zhì)和細胞器分解和循環(huán)利用的過程[12],細胞自噬被過度上調(diào)或下調(diào)都會產(chǎn)生不利的影響。研究報道高鹽飲食或影響細胞自噬，長期高鹽攝入加速誘導的高血壓性左心室功能惡化與細胞自噬水平過度上調(diào)有關,其具體機制可能由于心肌間質(zhì)高滲誘導細胞內(nèi)Na+濃度升高觸發(fā)活性氧(ROS)依賴性的自噬上調(diào)[13-14]。Tomohiro Osanai等報道高鹽飲食通過抑制ATG7表達下調(diào)小鼠心臟、肝臟、腎臟組織的細胞自噬水平[16]，高鹽飲食與細胞自噬的關系在腸組織還未得到研究，本研究在細胞和動物水平上發(fā)現(xiàn)高鹽降低了LC3II/LC3I比值，因為LC3II蛋白與自噬體數(shù)量相關，微管相關蛋白輕鏈3 (LC3)目前被廣泛用于監(jiān)測細胞自噬，其中方法之一是檢測LC3轉(zhuǎn)換率(LC3II/LC3I)，因此本研究結果暗示高鹽飲食降低了結腸組織的細胞自噬水平，這一過程或許是通過下調(diào)ATG5的表達，自噬體的形成需要30種自噬相關蛋白(ATGs)的參與，其中ATG5和ATG7是誘導自噬體形成的重要調(diào)控蛋白[17]，ATG5可與清道夫蛋白RACK1結合啟動自噬體形成[18]，也可與ATG12、ATG16結合形成復合物，有助于自噬體膜的延伸和成熟[19]。

腸上皮細胞對外源物質(zhì)的耐受和防御平衡是維持穩(wěn)態(tài)的重要基礎，同時與機體其它組織細胞不同的是，腸上皮細胞經(jīng)歷著周期較快的更新和再生，這一過程與細胞自噬密不可分，細胞自噬通過調(diào)節(jié)腸上皮細胞的功能對維持這一穩(wěn)態(tài)起著重要作用[19]，Prashant等首先報道細胞自噬通過靶向降解緊密連接蛋白Claudin-2降低細胞旁小的溶質(zhì)和離子通道從而減少腸屏障通透性[20]，隨后張琮等在結腸炎動物模型上發(fā)現(xiàn)自噬降解過程受抑制是導致緊密連接蛋白claudin-2上調(diào)和腸屏障損傷的重要原因[21]，此外claudin-1和ZO-1的表達也被發(fā)現(xiàn)受到自噬調(diào)節(jié)[22]。與前期的研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)在Coco2細胞敲低ATG5表達抑制細胞自噬后，緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達下調(diào)，由此可見，ATG5通路有關的細胞自噬與腸屏障功能具有密切的調(diào)控關系。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)長期高鹽飲食損傷了腸上皮屏障，這一表型與ATG5介導的細胞自噬受抑制密切相關，然而關于細胞自噬調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的方式尚不清楚，具體機制還需要進一步深入研究。