魯斯可皂苷元通過抑制p38MAPK途徑及心肌細(xì)胞焦亡改善小鼠阿霉素心肌病

劉長召，呂瑾

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院內(nèi)科心血管病中心，湖北 恩施 445000)

蒽環(huán)類化合物阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前臨床上常用的抗腫瘤化療藥物之一，被廣泛應(yīng)用于急性白血病、惡性淋巴瘤及實(shí)體瘤的臨床治療中。但DOX在用藥后會(huì)出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，特別是劑量依賴的心臟毒性限制了其長期使用。由DOX誘發(fā)的心臟毒性通?？蓪?dǎo)致不可逆的心肌損傷，進(jìn)而使患者發(fā)生充血性心力衰竭，甚至死亡[1,2]。DOX心肌病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種信號(hào)通路的異常改變及多種形式的心肌細(xì)胞死亡。如在DOX心肌病的發(fā)生過程中，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信號(hào)通路被異常激活，進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[3]。DOX也可通過激活紅系衍生的核因子2相關(guān)因子，介導(dǎo)血紅素降解增多和心肌細(xì)胞線粒體鐵過載，最終誘發(fā)心肌細(xì)胞鐵死亡[4]。此外，最新的研究表明，NLR家族Pyrin域蛋白3[NO-like-binding domain (NOD)-like receptor protein 3，NLRP3]炎癥小體激活介導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡也是誘發(fā)小鼠DOX心肌病的重要機(jī)制之一[5]。因此，靶向抑制上述過程對減輕DOX心肌損傷具有重要意義。魯斯可皂苷元(ruscogenin，Rus)是從植物麥冬中提取的一種重要的甾體皂苷元，具有多重藥理作用。如Rus可通過阻斷Toll樣受體4激活，進(jìn)而抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。Rus還可通過抑制NLRP3炎癥小體激活和p38MAPK通路來減輕腦缺血誘導(dǎo)的血腦屏障功能障礙[7,8]。但Rus是否可通過抑制NLRP3炎癥小體激活和p38MAPK途徑發(fā)揮抗DOX心肌損傷作用目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過構(gòu)建急性DOX心肌損傷的小鼠模型，觀察并探究了Rus對小鼠心功能、心肌細(xì)胞凋亡的影響及潛在機(jī)制，旨在為今后DOX心肌疾病的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一抗：Bax(貨號(hào)：ab32503，1∶5 000)、Bcl-2(貨號(hào)：ab182858，1∶1 000)、NLRP3(貨號(hào)：ab263899，1∶1 000)、含有caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白 (apoptotic speck protein containing a caspase recuitmant domain, ASC，貨號(hào)：ab155970，1∶1000)、p38蛋白磷酸化(phosphorylated-p38，P-p38,貨號(hào)：ab178867，1∶1 000)、總p38(total-p38貨號(hào)：ab170099，1∶5 000)及GAPDH(貨號(hào)：ab181602，1∶5 000)均購自于美國Abcam公司；二抗：羊抗兔IgG(批號(hào)：926-32211)購于美國LICOR公司；ruscogenin(目錄號(hào)：HY-N0496)購自于上海Med Chem Express公司，純度>98%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及膿毒癥心肌損傷模型的建立

本實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，體質(zhì)量250～300 g，購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)所有操作獲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將32只小鼠隨機(jī)分為空白對照組(Sham組)、Rus組、DOX組、DOX+Rus組，每組8只。DOX組和DOX+Rus組小鼠接受單次腹腔注射DOX(15 mg/kg)的方式構(gòu)建急性DOX心臟毒性模型。Rus及DOX+Rus組小鼠于DOX注射當(dāng)天開始，每天下午15∶00給予10 mg/kg的Rus灌胃處理，持續(xù)7 d。

1.3 多普勒超聲評價(jià)小鼠心功能

4組小鼠通過吸入濃度為1.5%的異氟烷進(jìn)行麻醉，使用剃毛器小心剔去小鼠心前區(qū)毛發(fā)，并將小鼠放置于恒溫加熱板。隨后采用MyLab 30CV多普勒超聲診斷儀器檢測4組小鼠的心功能指標(biāo)。在靠近乳頭肌水平的胸骨旁長軸和胸骨旁短軸上以2D模式成像后，記錄1個(gè)2D引導(dǎo)的穿過左心室前壁和后壁M型超聲，隨后收集并計(jì)算心臟的形態(tài)學(xué)參數(shù)，包括心率(heart rate，HR)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、短軸縮短率(fraction shortening，F(xiàn)S)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)。上述參數(shù)最終取4個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

首先，提取4組小鼠左心室組織樣本中總RNA，具體步驟如下：在低溫環(huán)境下，每個(gè)樣本取20～30 mg心肌組織剪碎并研磨，提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)檢測所獲RNA的濃度及純度。其次，進(jìn)行Avian Myeloblastosis Virus(AMV)逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟如下：取0.65 ml EP管，加入4.5 μl DEPC水，1.0 μl引物及1.0 μl模板RNA。離心并沸水浴后加入0.5 μl DNTP，2.0 μl 5 × Buffer及1.0 μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，離心后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。最后，對各樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。將上述步驟中獲取的cDNA加60.0 μl DEPC水稀釋后，配置如下反應(yīng)體系：正向引物及反向引物各0.5 μl；DEPC水，8.0 μl；SyBr Green 10.0 μl。最終以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used in qRT-PCR

1.5 血清乳酸脫氫酶水平檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取4組小鼠眼眶血1 ml，4 ℃條件下以3 500 轉(zhuǎn)/min離心5 min，分離血漿，取上層血清，采用血清乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒，按試劑盒說明書操作，應(yīng)用雙抗體夾心法測定血清中LDH水平。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測

將4組小鼠心室肌組織在裂解緩沖液中充分研磨后進(jìn)行超聲裂解。充分裂解后，離心吸取上清，依次分裝至預(yù)先準(zhǔn)備好的EP管，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法測量總蛋白濃度，并定容至各樣本等濃度。分裝后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?組總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用12%分離膠，5%濃縮膠，待電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)入醋酸纖維素膜中，分別用抗Bax、Bcl-2、NLRP3、ASC、T-p38和P-p38的一抗孵育過夜(4 ℃)，隨后于二抗(羊抗兔 IgG)稀釋液中避光孵育，置于搖床上50 min，利用Odyssey掃膜儀對蛋白條帶掃描并進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Rus對DOX所致心功能不全的保護(hù)作用

4組小鼠心率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Sham組及Rus組心功能各項(xiàng)指標(biāo)EF、FS、LVEDD和LVESD比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；與Sham組相比，DOX組小鼠EF和FS明顯降低，LVEDD和LVESD明顯升高(均P<0.05)；但經(jīng)Rus處理后，DOX小鼠的EF和FS明顯升高，而LVEDD和LVESD則明顯降低(均P<0.05，表2)。

2.2 Rus抑制DOX所致的心肌損傷

與Sham組小鼠相比，DOX組小鼠血清中LDH的含量明顯增高(P<0.05)，但Rus干預(yù)可明顯抑制DOX小鼠血清中LDH的水平(P<0.05，圖1)。

2.3 Rus抑制DOX所致的心肌細(xì)胞凋亡

與Sham組相比，DOX組小鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax與抑凋亡蛋白Bcl-2的比值明顯增高(P<0.05)；相反，經(jīng)Rus干預(yù)后，DOX心肌病小鼠心肌組織Bax和Bcl-2比值明顯降低(P<0.05，圖2A、B)。

2.4 Rus通過抑制NLRP3炎癥小體激活改善小鼠DOX心肌病

DOX可使小鼠心肌組織中NLRP3和ASC的表達(dá)水平明顯增加(均P<0.05，圖3A～C)，Rus干預(yù)可明顯降低NLRP3的表達(dá)水平(P<0.05)，但不影響ASC的表達(dá)水平(P>0.05，圖3A～C)。qRT-PCR結(jié)果顯示，DOX注射后，小鼠心肌組織中細(xì)胞焦亡標(biāo)志物Caspase 1，IL-1β和IL-18的mRNA表達(dá)水平明顯增加(均P<0.05)，Rus干預(yù)可明顯抑制上述基因的mRNA表達(dá)(均P<0.05，圖4A～C)。

表2 4組小鼠心功能指標(biāo)比較

圖1 4組小鼠血清中LDH的釋放Figure 1 Release of LDH in serum in four groups LDH: lactic dehydrogenase; Rus：ruscogenin; DOX: doxorubicin; Compared with sham group, *P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

2.5 Rus可通過抑制p38MAPK途徑發(fā)揮心臟保護(hù)作用

Rus可明顯抑制DOX所致的小鼠心肌細(xì)胞P-p38磷酸化水平增加(P<0.05，圖5A、B)。

3 討 論

本研究首先觀察了Rus對DOX心肌病的保護(hù)作用，并進(jìn)一步闡明了Rus抗DOX所致心臟毒性的潛在機(jī)制。DOX心肌病最常見的心功能不全表現(xiàn)為EF和FS下降，同時(shí)心臟結(jié)構(gòu)也會(huì)出現(xiàn)一定程度的改變，表現(xiàn)為LVEDD和LVESD水平升高[9]。本研究結(jié)果顯示，Rus可明顯逆轉(zhuǎn)DOX誘導(dǎo)的心臟結(jié)構(gòu)改變和功能異常。Bax和Bcl-2共同隸屬于Bcl-2基因家族。Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax不僅具有間接拮抗Bcl-2的抑凋亡作用，還可直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。DOX在進(jìn)入心肌細(xì)胞后，可造成線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙，導(dǎo)致大量促凋亡介質(zhì)釋放到胞漿中，啟動(dòng)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11]。本研究中，Rus干預(yù)后DOX心肌病小鼠心室組織中Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Bcl-2蛋白水平則明顯升高，表明Rus可抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

圖2 4組小鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況Figure 2 Levels of apoptosis-related proteins in four groups A: Western blotting; B: statistical analysis. Rus：ruscogenin; DOX: doxorubicin; TUNEL: terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling. Compared with sham group,*P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

圖3 4組小鼠心肌組織中NLRP3和ASC的表達(dá)Figure 3 Expression of NLRP3 and ASC in four groups Rus: ruscogenin; DOX: doxorubicin; NLRP3: NO-like binding domain-like receptor protein 3; ASC: apoptotic speck protein containing a caspase recruitment domain. Compared with sham group, *P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

圖4 4組小鼠心肌組織中IL-1β，IL-18 and caspase 1的基因表達(dá)Figure 4 Levels of inflammasome-related proteins in four groups Rus：ruscogenin; DOX: doxorubicin; IL-1β: interleukin-1β; IL-18: interleukin-18. Compared with sham group, *P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

圖5 4組小鼠心肌組織p38MAPK信號(hào)通路的激活狀況Figure 5 Activation of p38MAPK signaling pathway in four groups p38-MAPK: p38 mitogen-activated protein kinase; Rus: ruscogenin; DOX: doxorubicin; P-p38: phosphorylated-p38; T-p38: total-p38. Compared with sham group,*P<0.05; compared with DOX group, #P<0.05.

NLRP3在天然免疫調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。完整的NLRP3炎癥小體主要包括NLRP3，Caspase 1和ASC 3個(gè)成員[12]。DOX在進(jìn)入心肌細(xì)胞后，可通過激活NLRP3炎癥小體，招募并活化下游的Caspase 1，Caspase 1切割并激活I(lǐng)L-1β和IL-18，進(jìn)而切割并活化Gasdermin蛋白，使之轉(zhuǎn)位到膜上，形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，發(fā)生細(xì)胞焦亡[5，12]。Caspase 1作為在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一種半胱天冬酶，可促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[13]。本研究中，發(fā)生DOX心肌病小鼠心肌細(xì)胞凋亡和焦亡水平均明顯升高，但經(jīng)Rus干預(yù)后，NLRP3的蛋白表達(dá)水平明顯被抑制，心肌細(xì)胞焦亡隨之被抑制。由此推測，抑制NLRP3蛋白表達(dá)可能是Rus抗心肌細(xì)胞凋亡和焦亡的主要機(jī)制之一。

p38MAPK信號(hào)通路對細(xì)胞各種應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生具有重要意義，也與各種心肌損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抑制p38MAPK途徑的激活是防治DOX心肌病的重要策略之一[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rus干預(yù)可明顯降低DOX心肌病小鼠心肌組織中p38蛋白的磷酸化，從而阻斷p38MAPK途徑。由此推測，Rus抗DOX心肌病的另一種機(jī)制可能與p38MAPK途徑的抑制有關(guān)。

本研究首次證實(shí)了Rus可減輕小鼠DOX心臟毒性。Rus可能通過同時(shí)抑制NLRP3小體激活和p38MAPK通路的激活，進(jìn)而抑制小鼠心肌細(xì)胞凋亡，最終改善小鼠心臟功能。但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探討Rus精確的分子靶點(diǎn)。