用于黃曲霉素B1檢測的表面增強(qiáng)型熒光光學(xué)傳感器

陳海虹，張 玲

（上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

在濕熱的環(huán)境中，農(nóng)副產(chǎn)品及動物飼料的表面極其容易產(chǎn)生霉菌。霉菌的次生代謝產(chǎn)物是真菌毒素，黃曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）作為真菌毒素的一種，它的毒性最強(qiáng)且具有強(qiáng)致癌性，嚴(yán)重影響人體健康[1-4]。為了防止對動物和人體產(chǎn)生負(fù)面影響，許多國家規(guī)定了飼料和農(nóng)副產(chǎn)品中AFB1的含量。歐盟規(guī)定直接供人類食用的食物中AFB1含量不得超過2 μg/kg，日本規(guī)定不得超過10 μg/kg，中國規(guī)定不得超過20 μg/kg。因此，針對微量AFB1的檢測對于公共衛(wèi)生及食品安全至關(guān)重要。

目前，常規(guī)的AFB1檢測方法主要有高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography,HPLC）[5]，液相色譜/質(zhì)譜法（liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS）[6]，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）[7]和電化學(xué)法（electrochemical method, EM）[8]等。以上幾種檢測分析方法，靈敏度較高，重復(fù)性較好，但是處理樣品的手段相對較繁瑣，并且需要昂貴的儀器和專業(yè)的檢測人員操作，因此需要開發(fā)一種便捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測方式。表面增強(qiáng)熒光（surface-enhance fluorescence, SEF）是利用金屬納米顆粒和納米結(jié)構(gòu)金屬薄膜等納米金屬材料在光的激發(fā)下產(chǎn)生局域表面等離子體共振來提高熒光團(tuán)的發(fā)光效率。它被廣泛應(yīng)用于生物傳感[9]、醫(yī)學(xué)成像[10]及光電子器件[11]等領(lǐng)域。納米多孔金（nanoporous gold, NPG）是一種新型的納米金屬材料，在三維結(jié)構(gòu)上具有雙連續(xù)貫通無序的納米網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)。與其他金屬納米結(jié)構(gòu)比較，它具有高比表面積，高活性位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)尺寸連續(xù)可調(diào)并且穩(wěn)定性較好[12-13]。正是由于它的特殊結(jié)構(gòu)，使得其在受到光激發(fā)時(shí)可以產(chǎn)生比較強(qiáng)的局域電磁場，從而提高熒光團(tuán)發(fā)光效率。

利用納米多孔金作為熒光增強(qiáng)基底進(jìn)行AFB1檢測，將標(biāo)記有花氰素（Cy5）的核酸適體DNA1與另一條與DNA1互補(bǔ)的核酸適體DNA2共同組裝在NPG表面，形成功能化的檢測芯片。通過AFB1與DNA1競爭結(jié)合導(dǎo)致的Cy5熒光信號強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對黃曲霉素B1的痕量檢測，檢測極限高達(dá)10-7μg/L，并且基底表現(xiàn)出4個(gè)量級的動態(tài)響應(yīng)范圍，可用于AFB1的定性定量檢測。

1 實(shí)驗(yàn)原理

利用Cy5標(biāo)記的AFB1適配體即在3′端修飾一個(gè) Cy5分子（5′-GTTGG GCA CGT GTT GTC TCT CTG TGT CTC GTG CCC TTC GCT AGG CCC-3′-cy5, Cy5-DNA1）和在 5′端修飾硫醇鍵的（SH-5′-CAGAGAGACAACACGTGCCCAA C-3′, SH-DNA2）[14]AFB1 互補(bǔ)適配體，開發(fā)了一種新型的基于NPG的表面增強(qiáng)熒光傳感器用于AFB1檢測（見圖1）。金和硫醇間存在特殊的化學(xué)鍵，因而在NPG表面可以固定大量的SH-DNA2。根據(jù)堿基配對原則，Cy5標(biāo)記的DNA1將與DNA2形成核酸雙鏈，依附在NPG表面。未加入AFB1狀態(tài)下，基于NPG局域電磁場增強(qiáng)特性，可得到來自熒光標(biāo)記分子Cy5較強(qiáng)的熒光信號；加入AFB1分子后，由于AFB1與DNA1序列存在競爭結(jié)合DNA2的特性，導(dǎo)致DNA1與DNA2之間的鍵合斷裂，而AFB1與DNA2鍵合留于NPG表面，隨著AFB1量的增加，位于NPG表面的Cy5標(biāo)記的DNA1逐漸減少，導(dǎo)致來自Cy5的熒光信號減弱。因此，通過測量Cy5的熒光強(qiáng)度可間接判斷溶液中AFB1的質(zhì)量濃度。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 多孔金基底制備

圖 1 AFB1 光學(xué)檢測芯片原理圖Fig. 1 The schematic diagram of the optical sensor of AFB1

實(shí)驗(yàn)所用的多孔金基底采用一步脫合金法制備。根據(jù)金屬在酸中的活潑性差異，將金銀合金浸泡在濃硝酸溶液中，Ag原子被選擇性腐蝕后以離子形式融入硝酸，殘留的Au原子經(jīng)過自由擴(kuò)散組裝成具有連續(xù)韌帶和孔洞的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其韌帶和孔洞大小可通過控制前軀體合金成分、 腐蝕電位、脫合金時(shí)間及后期退火進(jìn)行調(diào)控。實(shí)驗(yàn)采用100 nm厚的Ag65Au35（原子百分比為Ag65%，Au35%）薄膜為前軀體，在室溫下使用65%濃硝酸進(jìn)行自由脫合金反應(yīng)，通過控制脫合金時(shí)間得到不同孔徑的NPG薄膜，然后將NPG薄膜反復(fù)浸泡在超純水中清洗多次以去除殘留的酸液。最后將NPG固定在塑料基板（polymer）上干燥備用。

2.2 多孔金基底表面功能化

制作用于AFB1檢測的生物傳感器通過在4℃環(huán)境中，將NPG薄膜先后浸泡在10 mol/L SHDNA2 磷酸緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）和20 mol/L Cy5-DNA1 PBS中各12 h進(jìn)行功能化處理（見圖1）。利用硫醇鍵將DNA2固定在NPG表面，然后通過浸泡使DNA1與DNA2之間形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，共同組裝在多孔金表面，形成功能化的基底。將已經(jīng)修飾好的基底取出，在去離子水中反復(fù)浸泡，清洗掉游離態(tài)的核酸適配子，放在PBS中4℃保存待測。

2.3 熒光光譜采集

采用 Nikon顯微鏡和上海復(fù)享NOVA制冷型光譜儀進(jìn)行熒光光譜檢測，測試系統(tǒng)及測試方法如圖2所示。在熒光光譜檢測過程中，將光學(xué)基底置于磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.4）中保持DNA的活性。通過滴加不同質(zhì)量濃度的AFB1溶液來改變測試環(huán)境中的AFB1濃度。由于熒光標(biāo)記分子Cy5在可見光波段的吸收峰值位于650 nm左右[12]，基于共振效應(yīng)，使用紅色激光可以得到更好的增強(qiáng)效果。因此，以632 nm激光作為激發(fā)波長，激發(fā)功率為0.03 mW，采集時(shí)間為120 s，每條譜線為基底表面5個(gè)不同位點(diǎn)的平均光譜。

3 結(jié)果和討論

由于NPG的熒光增強(qiáng)特性與孔徑相關(guān)，為了使熒光信號盡可能放大，制備了不同孔徑的NPG薄膜，并對其熒光增強(qiáng)特性進(jìn)行比較。圖3（a）～（c）分別為腐蝕時(shí)間為 1，5，10 min所得NPG的掃描電鏡圖（scanning electron microscope, SEM）。腐蝕1 min的NPG孔徑約為5 nm，腐蝕10 min的NPG孔徑約為13 nm，并且孔狀結(jié)構(gòu)均勻。圖3（d）為固定在不同孔徑多孔金表面的Cy5熒光光譜，由圖可見，Cy5熒光信號強(qiáng)度隨著多孔金孔徑的增大而增強(qiáng)。當(dāng)NPG孔徑約為13 nm時(shí)，多孔金基底表現(xiàn)出更好的熒光增強(qiáng)特性。

圖 2 黃曲霉素B1的熒光光譜測試系統(tǒng)及方法Fig. 2 Fluorescence spectrum system and method of testing aflatoxin B1

圖 3 不同腐蝕時(shí)間的NPG基底掃描電鏡圖及其熒光增強(qiáng)特性譜線Fig. 3 The SEM of NPG with different corrosion time and its fluorescence enhancement spectra

圖 4 退火對基底結(jié)構(gòu)及熒光增強(qiáng)特性的影響Fig. 4 Annealing influnce on the microstructure and SEF property of substrate

為了增強(qiáng)100 nm厚的NPG薄膜與支撐基板polymer之間的結(jié)合力，提高芯片整體的穩(wěn)定性和可操作性，采用低溫退火的方式適度軟化polymer增強(qiáng)附著力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)NPG薄膜與polymer一體化。圖4（a）為將固定在polymer上的13 nm NPG（NPG13） 置于真空干燥箱中，在100 ℃退火2 h之后所得基底的掃描電鏡圖。通過比較圖3（c）和圖4（a）發(fā)現(xiàn)，退火后的 NPG孔徑輕度粗化，從13 nm（NPG13）擴(kuò)大到了16 nm（NPG16）。為了確認(rèn)退火是否影響NPG的熒光增強(qiáng)特性，對退火后的NPG16表面進(jìn)行核酸適體功能化處理。組裝了SH-DNA2和Cy5-DNA1序列之后的NPG16表面的熒光光譜顯示在圖4（b）中，比較退火前后來自Cy5的熒光信號可見，退火在一定程度上可以進(jìn)一步提高芯片的熒光增強(qiáng)特性。同時(shí)比較圖3（c）和圖4（a）可以發(fā)現(xiàn)，退火之后的NPG表面比退火前更加均勻。這一點(diǎn)通過在同一樣品上不同位置Cy5的熒光光譜（見圖 4（c）和圖 4（d））可以得到進(jìn)一步的印證。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，為了保證光學(xué)芯片的均勻性以及耐用性，選擇退火后的NPG16作為光學(xué)芯片的基底材料。

以NPG16為增強(qiáng)基底，通過核酸適體進(jìn)行表面功能化，隨后浸泡在不同濃度的AFB1中進(jìn)行熒光光譜檢測，觀察熒光強(qiáng)度變化與AFB1之間的關(guān)系。當(dāng)檢測環(huán)境中沒有AFB1時(shí)，Cy5-DNA1通過堿基配對原則與固定在NPG表面的SH-DNA2形成穩(wěn)定的核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)，測得熒光光譜強(qiáng)度為I0。當(dāng)加入AFB1后，由于AFB1和Cy5-DNA1產(chǎn)生競爭性結(jié)合，SH-DNA2和Cy5-DNA1中的配對堿基發(fā)生解離，游離態(tài)Cy5-DNA1遠(yuǎn)離NPG表面，導(dǎo)致Cy5的熒光強(qiáng)度減弱，此時(shí)測得熒光光譜強(qiáng)度為I。因此，Cy5的熒光強(qiáng)度變化與環(huán)境中AFB1的濃度相關(guān)。圖5（a）為浸泡在PBS及不同濃度的AFB1溶液中芯片表面檢測到的來自于Cy5的熒光光譜。由圖可見，隨著AFB1的質(zhì)量濃度的增加，來自于Cy5的熒光信號越來越弱，表明越來越多的Cy5-DNA1與DNA2解離，游離到溶液中，導(dǎo)致基底對其失去增強(qiáng)特性，引發(fā)基底表面整體熒光信號的衰減。為了清楚的顯示熒光強(qiáng)度與AFB1濃度之間的關(guān)系，我們對不同環(huán)境下基底表面的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了歸一化處理（見圖5（b）），以PBS中來自Cy5的665 nm峰為參照。由圖5（b）可見，當(dāng)溶液中存在質(zhì)量濃度為10-7μg/L的AFB1時(shí)，熒光強(qiáng)度衰減了近10%；當(dāng)溶液中AFB1質(zhì)量濃度提高到10-6μg/L時(shí)，熒光強(qiáng)度衰減了20%；隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸衰減，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為10-2μg/L時(shí)，熒光強(qiáng)度基本變?yōu)槌跏紡?qiáng)度的一半。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在AFBI質(zhì)量濃度低時(shí)，芯片表現(xiàn)出更好的靈敏度，而隨著AFBI質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度衰減比例有所減小，分析主要原因是，基底表面組裝的核酸適體數(shù)量有限，隨著AFB1質(zhì)量濃度的提高，Cy5-DNA1與AFB1的數(shù)量差異在擴(kuò)大，基底本身在向飽和狀態(tài)轉(zhuǎn)化，因此衰減速率有所下降?；谀壳岸嗫捉鸹妆砻婀δ芑瘲l件，在10-6μg/L到10-2μg/L動態(tài)范圍內(nèi)，熒光信號強(qiáng)度與AFB1質(zhì)量濃度表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，檢測極限可達(dá)10-7μg/L，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)檢測技術(shù)的檢測極限3.3×10-4μg/L[8]和同類熒光檢測技術(shù)的檢測極限3×10-4μg/L[15]?？梢灶A(yù)見，通過控制多孔金表面組裝核酸適體的數(shù)量，可進(jìn)一步提高檢測靈敏度和擴(kuò)大檢測動態(tài)響應(yīng)范圍。

圖 5 Cy5 熒光強(qiáng)度與 AFB1 質(zhì)量濃度關(guān)系圖Fig. 5 Relationshio between Cy5 fluorescence intensity and AFB1 mass concentration

4 結(jié) 論

本文利用AFB1和Cy5-DNA1之間的競爭結(jié)合關(guān)系，成功研制了一種新型表面增強(qiáng)熒光基底，實(shí)現(xiàn)了對AFB1的痕量檢測?；谶@個(gè)新型光學(xué)基底，檢測極限達(dá)到10-7μg/L，遠(yuǎn)低于直接供人類食用的食品中AFB1標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，基底表現(xiàn)出4個(gè)量級的線性動態(tài)響應(yīng)范圍，為實(shí)現(xiàn)不同濃度的AFB1檢測提供了可能性。該方法可通過改變特異性核酸適體拓展到其他真菌毒素的檢測，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。