采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測臍橙果皮中抑霉唑殘留

張莎 劉木華 陳金印 趙進(jìn)輝

摘要：由于采后處理過程中臍橙保鮮劑抑霉唑易通過果皮滲進(jìn)果肉中殘留，不慎食用后會對人體產(chǎn)生危害。因此，本研究探索一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy ，SERS）的臍橙果皮中抑霉唑殘留的快速檢測方法。首先對SERS 檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，分別確定了最優(yōu)的檢測條件為反應(yīng)時間2 min ，金膠加入量400μL ，NaBr作為電解質(zhì)溶液且加入量為25μL ?；谝陨献顑?yōu)檢測條件，以自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法（Adaptive Iterative Reweighted Penalized Least Squares ，air PLS）、air PLS+歸一化、 air PLS+基線校正、air PLS+一階導(dǎo)數(shù)、air PLS+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（Standard Normal Distribution ，SNV）和 air? PLS+多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction ，MSC）處理后的6組光譜數(shù)據(jù)為研究對象，分別采用這 6種光譜預(yù)處理法建立支持向量回歸（Support Vector Regression ，SVR）模型并對預(yù)測性能進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)， air PLS 方法所建立模型的預(yù)測集相關(guān)系數(shù)（Coefficient of the Determinant for the Prediction Set ，RP ）最大，預(yù)測集均方根誤差（Root-Mean-Square Error of Prediction ，RMSEP）最小。對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（Prin?cipal Component Analysis ，PCA）特征提取，選擇前7個主成分得分作為 SVR 預(yù)測模型的輸入值。采用 SVR、多元線性回歸（Multiple Linear Regression ，MLR）和偏最小二乘回歸（Partial Least Squares Regression， PLSR）三種建模方法分析比較其對應(yīng)的預(yù)測性能，其中SVR 模型的預(yù)測集RP 可高達(dá)0.9156，預(yù)測集RMSEP? 為4.8407 mg/kg ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation ，RPD）為2.3103，表明基于 SVR 算法對臍橙表面抑霉唑殘留的預(yù)測值越接近實(shí)測值，越能有效提高模型預(yù)測準(zhǔn)確性。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用SERS 結(jié)合PCA? 及SVR 建模，可實(shí)現(xiàn)對臍橙果皮中抑霉唑殘留的快速檢測。

關(guān)鍵詞：臍橙;抑霉唑;表面增強(qiáng)拉曼光譜;支持向量回歸;多元線性回歸;偏最小二乘回歸

中圖分類號： O433.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：202106-SA002

引用格式：張莎， 劉木華， 陳金印， 趙進(jìn)輝. 采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測臍橙果皮中抑霉唑殘留[J].智慧農(nóng)業(yè)（中英文）， 2021， 3（4）：42-52.

ZHANG Sha， LIU Muhua， CHEN Jinyin， ZHAO Jinhui. Rapid detection of imazalil residues in navel orange peel using surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Smart Agriculture， 2021， 3（4）：42-52.（in Chinese with English abstract）

1? 引言

贛南臍橙作為中國贛州地理標(biāo)志性產(chǎn)品，帶動了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展，深受當(dāng)?shù)卣匾?，該產(chǎn)地也成為了全國最大的臍橙生產(chǎn)區(qū)[1]。臍橙在貯藏過程中易受病原菌侵害，導(dǎo)致其腐爛，造成經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，采用化學(xué)保鮮劑是柑橘類水果儲存中病害防治相對成熟、效果較好的保鮮方式。抑霉唑（Imazalil，IMZ）和咪鮮胺等化學(xué)保鮮劑主要用來防治臍橙的青霉病和綠霉病[2，3]，但該類保鮮劑長期使用容易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而引起保鮮效率的折損。不少商販為了達(dá)到保鮮效果，在貯藏過程中加大保鮮劑的使用劑量，造成臍橙中抑霉唑過量殘留。而且，即便是少量的抑霉唑殘留也會使動物和人類的肝臟損傷，甚至可能致癌[4， 5]。為此，中國規(guī)定了臍橙中抑霉唑保鮮劑殘留的最大限量為5 mg/kg[6]。為了確保臍橙的食用安全品質(zhì)，檢測臍橙果皮中抑霉唑的殘留量具有重要的實(shí)際意義。

目前常用的抑霉唑殘留檢測方法主要有氣相色譜法（Gas Chromatography ，GC）[7， 8]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC）[9， 10]、質(zhì)譜法（Mass Spectrometry， MS）[7， 9]和超高效液相色譜法（Ultra-Performance Liquid Chromatography，UPLC）[10]等。以上方法主要優(yōu)點(diǎn)在于再現(xiàn)性好、精確性和敏感性高，但所需要的儀器設(shè)備較昂貴[11]，試驗(yàn)操作繁瑣，耗時長，無法實(shí)現(xiàn)對抑霉唑殘留量的快速檢測，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。因此，有必要探索一種可以快速檢測臍橙果皮中抑霉唑殘留的方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy ，SERS）是一種當(dāng)入射激光照射到金或銀等粗糙金屬表面時，在其表面會激發(fā)出等離子體并在粗糙金屬粒子的覆蓋區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生共振，使其表面產(chǎn)生比普通拉曼信號強(qiáng)4～11個數(shù)量級的信號強(qiáng)度的技術(shù)，該方法具有方便快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單和可適用于現(xiàn)場分析的優(yōu)點(diǎn)[12， 13]。Zhao 等[11]采用 SERS 技術(shù)制備了柔性襯底，對蘋果表面抑霉唑殘留進(jìn)行原位檢測，在蘋果上檢測到的最低濃度可達(dá)0.073 mg/kg 。該研究表明，SERS方法具有較高的靈敏度。抑霉唑在水果采后保鮮的過程起到非常重要的作用。為避免由于臍橙果皮抑霉唑殘留問題對人體造成傷害，采用 SERS技術(shù)檢測臍橙果皮中抑霉唑殘留具有重要意義。本研究主要以臍橙為對象，采用自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法（Adaptive? Iterative? Reweighted? Penalized? LeastSquares，air PLS）對含不同濃度的抑霉唑的臍橙果皮的 SERS光譜進(jìn)行預(yù)處理，并選擇前7個主成分得分值作為支持向量回歸（Support VectorRegression，SVR）模型的輸入值，建立 SVR 預(yù)測模型對臍橙果皮中的抑霉唑殘留量進(jìn)行預(yù)測。

2? 材料與方法

2.1 儀器與設(shè)備

便攜式拉曼光譜儀系統(tǒng)主要包括QE65Pro型拉曼光譜儀（美國海洋光學(xué)公司）、785 nm 激光器、光纖和采樣附件等; DXRTM 顯微拉曼光譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）;磁力攪拌器（LC-DMS-H ，上海力辰邦西儀器科技有限公司）;數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE 型，昆山市超聲儀器有限公司）;電子天平（FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（美國TeLedyne水質(zhì)公司）。

2.2 材料與試劑

本研究所用臍橙購于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水果店。研究所用試劑包括三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O≥49.0%，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司），抑霉唑乳油（500 g/L ，江蘇龍燈化學(xué)有限公司），抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品（IMZ ，純度≥99%，阿拉?。瑱幟仕崛c（C6H5Na3O7·2H2O ，99%，西隴化工股份有限公司），溴化鈣（CaBr2，≥98%，阿拉?。?，溴化鈉（NaBr，99%，阿拉?。?，氯化鈣（CaCl2，分析純，純度98%），氯化鈉（Na‐Cl ，99.5%，西隴化工股份有限公司），以及實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

2.3 樣本制備

（1）抑霉唑原液配制。取100μL 的抑霉唑乳油（500 g/L）置于100 mL 容量瓶中，加入62.5 mL 的超純水均勻混合，得到800 mg/L的抑霉唑原液。

（2）抑霉唑工作溶液制備。取不同體積的乳油（500 g/L）用超純水稀釋成不同質(zhì)量濃度的抑霉唑工作溶液（250～500 mg/L）。

（3）樣本制備。將臍橙的果皮用超純水洗凈，晾干后將果皮切成若干個面積為1.5 cm×1.5 cm 的臍橙小塊，對其進(jìn)行稱重（a ，單位：g）。

在條件優(yōu)化試驗(yàn)中，將切好的臍橙小塊浸泡于抑霉唑溶液（800 mg/L）中，90 s 后撈出晾干，再對其稱重（b ，單位：g），得到含40.34 mg/kg 抑霉唑的臍橙果皮樣本。

在定量試驗(yàn)中，將切好的65個臍橙小塊浸泡于抑霉唑溶液（250～500 mg/L）中，90 s后撈出晾干，再對其稱重（b ，單位： g），得到含抑霉唑的臍橙果皮樣本（1.43～40.81 mg/kg）。未浸泡在抑霉唑中的臍橙果皮樣本為空白臍橙果皮樣本。其中，在條件優(yōu)化試驗(yàn)部分與定量試驗(yàn)部分中，a 為臍橙果皮的初始重量，b 為浸泡抑霉唑溶液且晾干后的重量; b-a可得到臍橙果皮中抑霉唑的重量，g;設(shè) c 為抑霉唑溶液的濃度， mg/kg，則（b-a）×c為臍橙果皮抑霉唑?qū)嶋H吸收抑霉唑的重量，mg;（b-a）×c/b則為每塊臍橙果皮上實(shí)際吸收的抑霉唑的濃度，mg/kg。

（4）金膠制備。取3? mL 濃度為1%的 HAuCL4溶液于150 mL 的燒杯中，再慢慢加入47 mL超純水，混合均勻，將混合液放至磁力攪拌器中加熱到沸騰。沸騰后立即加入2 mL 濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，并攪拌8 min 后，冷卻至室溫形成金膠溶液備用[14， 15]。

（5）電解質(zhì)溶液制備。取0.1 g CaBr2、0.55 g

CaCl2、5.14 g NaBr和2.9 g NaCl分別置于棕色的 50 mL容量瓶中，先加入少量水溶解，再定容至 50 mL ，可分別得到 0.01 mol/L 的 CaBr2溶液、0.1 mol/L CaCl2 溶液、 1 mol/L NaBr和1 mol/L? NaCl溶液。

2.4 拉曼光譜采集

抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜采集。取適量的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品于載玻片上，用 DXRTM 顯微拉曼光譜儀采集其拉曼光譜。本研究主要分析400～1800 cm-1 波段的拉曼光譜。

定性試驗(yàn)中臍橙果皮 SERS光譜采集。將400μL納米金膠和25μL NaBr溶液充分混合后噴到含40.34 mg/kg 抑霉唑的臍橙小塊上，待金膠與抑霉唑分子反應(yīng)2 min后，采集其 SERS光譜。每個優(yōu)化條件下，設(shè)置5個平行樣，取其平均值為該條件下的拉曼光譜。

定量試驗(yàn)中臍橙果皮 SERS光譜采集。將400μL納米金膠和25μL NaBr溶液充分混合后噴到含抑霉唑的臍橙小塊（1.43～40.81 mg/kg）上，采集臍橙的 SERS光譜。每個濃度下的臍橙樣本采集5條拉曼光譜作為平行樣，取其平均值作為該樣本的拉曼光譜。

其中，DXRTM顯微拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置為：激光能量5 mW，激發(fā)波長780nm，物鏡的放大倍數(shù)選擇10倍，采集曝光時間10 s ，預(yù)覽采集時間10 s ，樣品曝光10次，背景曝光16次。便攜式拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置為：積分時間為60 s ，平均次數(shù)為2，平滑度為1。

2.5 SERS檢測試驗(yàn)方法

2.5.1?? 定性檢測

通過比較空白臍橙果皮和含抑霉唑的臍橙果皮（40.34 mg/kg）的 SERS 光譜，得到 983和1047 cm-1 波段作為特征峰鑒別臍橙果皮中是否殘留抑霉唑。因此，本研究通過比較983和1047 cm-1 波段處的 SERS信號強(qiáng)度來確定最佳的檢測條件。

為研究不同反應(yīng)時間對 SERS 強(qiáng)度的影響，

將400μL 金膠與25μL 的NaBr溶液混合均勻后噴灑到含40.34 mg/kg 抑霉唑的臍橙樣本上，分別采集反應(yīng)時間為 0、2、4、6和 8 min 時的SERS 光譜。通過比較983和 1047 cm-1 波段處的SERS信號強(qiáng)度與反應(yīng)時間的關(guān)系來確定抑霉唑分子與金膠的最佳反應(yīng)時間。

為研究不同金膠加入量對 SERS 強(qiáng)度的影響，分別將80、240、400、560和 720μL 的金膠與25μL 的NaBr溶液混合均勻后噴灑到含40.34 mg/kg抑霉唑的臍橙樣本上，反應(yīng)2 min后采集其 SERS光譜。通過比較983和 1047 cm-1 波段處的 SERS信號強(qiáng)度與金膠加入量的關(guān)系來確定最佳的金膠量。

為研究不同電解質(zhì)溶液的加入量對 SERS強(qiáng)度的影響，將400μL 金膠分別與25μL 的 CaBr2溶液、CaCl2溶液、NaBr溶液和 NaCl 溶液混合均勻后噴灑到含40.34 mg/kg 抑霉唑的臍橙樣本上，反應(yīng)2 min 后采集其 SERS 光譜。通過比較983和 1047 cm-1 波段處的 SERS信號強(qiáng)度與電解質(zhì)溶液（CaBr2、CaCl2、NaBr和 NaCl）的直方圖來確定最佳的電解質(zhì)溶液。

為了研究不同NaBr加入量對 SERS 強(qiáng)度的影響，將400μL 金膠分別與0 、10、15、20、25、30μL 的NaBr溶液混合均勻后噴灑到含 40.34 mg/kg抑霉唑的臍橙樣本上，反應(yīng)2 min后采集其 SERS光譜。通過比較983和 1047 cm-1 波段處的 SERS信號強(qiáng)度與NaBr加入量的折線圖來確定最佳的電解質(zhì)溶液。

2.5.2? 定量檢測

將400μL 金膠與 25μL 的NaBr溶液混合均勻后噴灑到含抑霉唑的臍橙樣本（1.43～ 40.81 mg/kg）上，反應(yīng)2 min后采集其拉曼光譜。得到65個含抑霉唑的臍橙樣本，從中隨機(jī)挑選35個建立預(yù)測模型，剩余的30個臍橙樣本則用作預(yù)測集，用來評估該模型的預(yù)測性能。

2.6 抑霉唑理論拉曼光譜計算

為對比理論數(shù)據(jù)結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果之間的一致性，采用密度泛函理論（Density Functional Theory ，DFT）計算方法對抑霉唑分子的振動歸屬進(jìn)行理論運(yùn)算分析。

抑霉唑的3D分子結(jié)構(gòu)采用Gauss View 5.0構(gòu)造，Gaussian 09W軟件計算理論抑霉唑分子的拉曼光譜頻率，在計算時采用 DFT 方法中的B3LYP/6-31G （d ，p）基組。C 、H 、Cl 、N和 O原子也采用6-31G （d ，p）基組，在 Gaussian 09中顯示計算結(jié)果。對拉曼位移用該機(jī)組相對應(yīng)的校正系數(shù)（0.961）校正。其中基組為該電子體系內(nèi)軌道的數(shù)學(xué)描述，“6”解釋為內(nèi)層軌道的函數(shù)數(shù)量;而一個基組中含3個高斯函數(shù)（Gauss‐ian Type? Orbital ， GTO），每一個 Slater 函數(shù)（Slater Type Orbital ， STO）由 6個 GTO 展開，“31”解釋為兩組 STO 描述的價層的軌道;“d”和“p”分別是對分子中的C 、Cl 、N 、O原子和H原子做的極化函數(shù)[16]。

3? 結(jié)果與分析

3.1 抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜分析

抑霉唑的分子式為 C14H14Cl2N2O ，由1 個烯丙氧基連接1個二氯苯基官能團(tuán)組成。優(yōu)化后得到的抑霉唑分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示，主要包括 C、C-H 、C=C-H 、C-O 、N=C-N 、C-N 、N-C-H 和C-N-C等基團(tuán)。

圖2 （a）為理論計算的抑霉唑拉曼光譜，圖2 （b）為實(shí)際測得的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜。通過對比兩者的特征峰歸屬可發(fā)現(xiàn)，1176和1378 cm-1 波段處特征峰的拉曼信號強(qiáng)度較弱。這可能是由于這兩個位移處分別在苯環(huán)上有微弱的面外彎曲和面內(nèi)彎曲振動所引起。結(jié)合表1和圖2 可得，抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品在690 cm-1 波段處的特征峰是由于苯環(huán)彎曲振動、CH2面內(nèi)搖擺、C-C? 面外彎曲、二氯苯基面外彎曲共同作用產(chǎn)生的;983 cm-1 波段處的振動可能是由于苯環(huán)彎曲振動、二氯苯基上 C=N-C 和 C-N-C 與 C=C-N 的彎曲振動共同作用產(chǎn)生;1041 cm-1 處的峰是由C-H剪式振動、C=C-H 面外彎曲振動和CH2面內(nèi)彎曲振動共同作用產(chǎn)生。圖2中理論計算光譜與標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜的特征峰匹配可發(fā)現(xiàn)，最小偏差為0，最大偏差為10。這可能是由于實(shí)際測量拉曼光譜的標(biāo)準(zhǔn)品為固體粉末，其之間存在相互作用力，而理論計算時的形態(tài)為理想的氣態(tài)單分子，忽略了分子間作用力?；诖?，理論計算的抑霉唑拉曼光譜很好地印證了實(shí)測的抑霉唑拉曼光譜的正確性，可以將實(shí)測的抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜作為后續(xù)分析臍橙表面抑霉唑殘留的參考依據(jù)。

3.2 臍橙果皮中抑霉唑的SERS光譜分析

由圖 3可知，含抑霉唑的臍橙樣本在983與1047 cm-1 波段處有區(qū)別于空白臍橙樣本的拉曼特征峰。而抑霉唑標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜在983與1041 cm-1 波段處均有特征峰，并在1041 cm-1 波段處有6 cm-1 的偏差，這可能是由于臍橙本身較強(qiáng)的背景峰影響導(dǎo)致的。因此，可以將這兩處特征峰作為鑒別臍橙果皮中是否含抑霉唑的依據(jù)。

3.3 樣本SERS強(qiáng)度檢測條件優(yōu)化

由圖4可知臍橙與金膠和NaBr溶液混合物的反應(yīng)時間不同，SERS信號強(qiáng)度不同。隨著反應(yīng)時間的增長，983和 1047 cm-1 處的 SERS 強(qiáng)度均呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是剛開始吸附時，臍橙果皮的抑霉唑與金膠及NaBr溶液充分混合，使得該活性位點(diǎn)處的 SERS 信號得以迅速增強(qiáng)[17]。吸附時間過長會使金膠納米粒子凝聚過度從而產(chǎn)生沉淀，降低抑霉唑與金膠結(jié)合的效率[18]。但是由于0 min 的反應(yīng)時間在實(shí)際操作中比較困難，故本研究選擇2min作為最優(yōu)的反應(yīng)時間。

SERS 主要是通過分子吸附在金和銀等粗糙金屬的表面，從而使局部表面產(chǎn)生等離激元共振效應(yīng)，對 SERS 強(qiáng)度起到增強(qiáng)的效果[19]。由圖5 可看出，隨著金膠加入量的增大，983與 1047 cm-1 波段處的拉曼特征峰強(qiáng)度呈先減小后增大再次減小的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能的原因是當(dāng)金膠的量增大到一定程度時，有更多的抑霉唑分子吸附在納米金膠顆粒的表面，使得983 cm-1?? 的特征峰在560μL 時的 SERS 信號達(dá)到最強(qiáng)，1047 cm-1 的特征峰在400μL時的 SERS信號達(dá)到最強(qiáng)。而在金膠加入量為400μL時983 cm-1 波段處的 SERS強(qiáng)度為次強(qiáng)點(diǎn)，僅次于560μL 處的 SERS 強(qiáng)度。綜合考慮，本研究選擇最優(yōu)金膠加入量為400μL。

電解質(zhì)溶液對 SERS強(qiáng)度的增強(qiáng)效果取決于離子對金膠表面狀態(tài)的影響及離子對金膠納米粒子的吸附能力[20]。圖6 可看出，金膠與 CaBr2的混合溶液在983 cm-1 波段處的 SERS 強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，金膠與NaBr的混合溶液在1047 cm-1 波段處的 SERS強(qiáng)度最強(qiáng)。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于氯離子的鹽析能力大于溴離子的鹽析能力，導(dǎo)致溴離子與金屬粒子的表面絡(luò)合能力強(qiáng)于氯離子，結(jié)果表明含溴離子的化合物（NaBr和 Ca‐Br2）對 SERS強(qiáng)度的增強(qiáng)效果明顯大于含氯離子的化合物（NaCl 和 CaCl2）對 SERS 強(qiáng)度的增強(qiáng)效果[21]。其次，NaBr在983 cm-1 特征峰處的SERS強(qiáng)度僅次于CaBr2。綜合考慮，本研究選擇NaBr作為最優(yōu)的電解質(zhì)溶液。

在納米金膠溶液中加入不同量的NaBr，可能會對 SERS信號產(chǎn)生影響，因此有必要對電解質(zhì)溶液的加入量進(jìn)行優(yōu)化[22]。從圖7可看出，當(dāng)NaBr加入量為 10μL 時， 1047 cm-1 波段處的 SERS信號強(qiáng)度達(dá)到局部最高。當(dāng)NaBr加入量增大到25μL時，983 cm-1 波段處的 SERS強(qiáng)度達(dá)到最高點(diǎn)，而1047 cm-1 波段處雖未達(dá)到最強(qiáng)，卻僅次于最強(qiáng)點(diǎn)?？赡艿脑蚴钱?dāng)鹵族元素的量高到足以聚合時，使局部的電磁場增強(qiáng)，從而增強(qiáng) SERS信號。而當(dāng)加入過量NaBr后，會加劇金納米粒子的聚集從而發(fā)生沉淀[21]，進(jìn)而降低 SERS 信號強(qiáng)度。因此本試驗(yàn)確定了NaBr溶液的最佳加入量為25μL。

3.4 光譜預(yù)處理

為減少光譜分析過程中受到噪聲、基線漂移等因素干擾，在建立模型之前有必要對原始光譜進(jìn)行光譜預(yù)處理[23]。目前常用的光譜預(yù)處理方法主要有 air PLS 、歸一化、基線校正、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（Standard Normal Distribution ，SNV）和多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction ，MSC）等[23，24]。其中基線校正、一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)的作用主要是扣除漂移或背景對結(jié)果的影響，在改變了原始數(shù)據(jù)相關(guān)性的變化趨勢的同時，也有效提高了某些位置光譜的相關(guān)性。在光譜數(shù)據(jù)分析時，樣本的誤差表現(xiàn)在無規(guī)則分布或樣本顆粒大小各異，而MSC 和 SNV可以消除該誤差對光譜分析結(jié)果的影響，還能夠提高原始光譜與預(yù)處理后光譜之間的相關(guān)性。歸一化能夠消除由于尺寸差異過大對分析結(jié)果帶來的誤差[23]。因此，本研究以自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法（Adaptive Iterative Re‐weighted Penalized Least Squares ，air PLS）、airPLS+歸一化、air PLS+基線校正、air PLS+一階導(dǎo)數(shù)、air PLS+SNV 和 air PLS+MSC 處理后的6組光譜數(shù)據(jù)為研究對象，分別采用這6組光譜預(yù)處理法建立 SVR模型并進(jìn)行預(yù)測性能的比較。

由表2 可知，air PLS 、air PLS+SNV 、air‐PLS+MSC 三組光譜預(yù)處理方法所建立模型的訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)（Coefficient of Determination forthe Training Set ，RT ）的值均達(dá)到0.96以上。且三者的訓(xùn)練集均方根誤差（Root-Mean-SquareError of Training set ，RMSEC）的值相差不大，穩(wěn)定在3.7附近。然后對該三種方法的預(yù)測集相關(guān)系數(shù)（Coefficient of the Determinant for the Pre‐diction Set ，RP ）進(jìn)行比較，air PLS 方法建立模型預(yù)測的預(yù)測集RP 為最大，預(yù)測集均方根誤差（Root-Mean-Square Error of Prediction ，RMSEP）為最小。因此，本研究最終選擇 air PLS 作為臍橙表面抑霉唑殘留的 SVR預(yù)測模型的光譜預(yù)處理方法。

3.5 PCA特征提取

建立模型之前對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（Principal? Component Analysis ， PCA）特征提取。一般來說，主成分分析時主成分的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到90%以上即可作為主要光譜信息的特征[25]。由表3可知，前7個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率已達(dá)91.94%。因此，選擇前7個主成分的得分值作為 SVR預(yù)測模型的輸入值。

3.6 預(yù)測模型的建立以及預(yù)測性能分析

為評價模型的預(yù)測精度和效果，采用了 SVR 、多元線性回歸（Multiple Linear Regression ，MLR）和偏最小二乘回歸（Partial Least Squares Regression ，PLSR）三種建模方法進(jìn)行分析比較。其中，SVR 預(yù)測模型的類型為epsilon SVR ，核函數(shù)為徑向基核函數(shù)，epsilon 值為0.1，懲罰因子C值為10。

通常選擇 RP 、 RMSEP 和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation ，RPD）的值來評價模型性能。其中，RP 和RMSEP分別用來解釋真實(shí)值與預(yù)測值的相關(guān)性和精確度的能力。RP 越大，RMSEP越小則說明該模型的擬合程度越好，準(zhǔn)確性越高[25]。RPD 值則是對模型預(yù)測能力的評估，RPD 值越大（不小于1），說明預(yù)測效果越好，其預(yù)測結(jié)果越接近實(shí)測值[25]。

由表4可得，基于 SVR建立模型預(yù)測的RP 為 SVR 、MLR 、PLSR三者中的最大，RMSEP為最小。因此，基于 SVR算法對臍橙表面抑霉唑殘留的預(yù)測值越接近實(shí)測值，能有效提高模型預(yù)測準(zhǔn)確性。其中，最低檢出限為1.43 mg/kg （國家于《GB 2763-2019食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定抑霉唑在臍橙中殘留最大限量為5 mg/kg）。

為進(jìn)一步做預(yù)測分析，在隨機(jī)挑選35個樣本建立模型之后，剩余的30個樣本作為預(yù)測集進(jìn)行驗(yàn)證，即臍橙果皮抑霉唑殘留濃度分別為38.93、30.45、21.53、14.63、9.24和 4.05 mg/kg的樣本，實(shí)測的真實(shí)值與預(yù)測值之間的關(guān)系如圖8，RP 為0.9156，RMSEP為4.8407 mg/kg。

4? 結(jié)論

本研究探索了SERS技術(shù)在檢測臍橙果皮中抑霉唑農(nóng)藥殘留的可行性。首先通過對比983和1047 cm-1 兩處波段的 SERS強(qiáng)度，進(jìn)行抑霉唑殘留的 SERS檢測條件優(yōu)化，分別確定了最優(yōu)的檢測條件（2 min 的反應(yīng)時間，400μL 的金膠加入量，NaBr作為電解質(zhì)溶液且添加量為25μL）。在最優(yōu)條件下，對含抑霉唑的臍橙果皮拉曼光譜采用6組不同的光譜預(yù)處理方法，分別對這6組光譜所建立模型的預(yù)測性能進(jìn)行對比，最終采用 air PLS 的光譜預(yù)處理方法。經(jīng)過 PCA 的特征提取，選擇前7個主成分得分作為臍橙果皮抑霉唑殘留的 SVR預(yù)測模型的輸入值。最后 SVR 預(yù)測模型的RP 可達(dá)0.9156，RMSEP 為4.8407 mg/kg， RPD 為2.3103。由于本研究所采用的計算實(shí)際殘留濃度的方法為稱重法，揮發(fā)時間不一致容易造成稱量誤差，進(jìn)而影響最終實(shí)際殘留濃度的計算。因此實(shí)際殘留濃度的計算方法還有待進(jìn)一步改善。研究結(jié)果表明，SERS 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)臍橙果皮抑霉唑殘留的快速檢測。

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Rapid Detection of Imazalil Residues in Navel Orange Peel Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy

ZHANG Sha1，2， LIU Muhua1，2， CHEN Jinyin2， ZHAO Jinhui1，2*

（1. College of Engineering， Jiangxi Agricultural University/Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment in JiangxiProvince， Nanchang 330045， China;2. Jiangxi Provincial Collaborative Innovation Center of Key Technologies and Qualityand Safety in Post-Harvest Processing of Fruits and Vegetables， Nanchang 330045， China）

Abstract： Imazalil， a preservative for navel orange in the process of postharvest processing， is easy to seep into the flesh through the peel and produce residues in the flesh， which is vulnerable to cause endanger to human body if it was eaten accidentally. Base on this， a fast detection method of imazalil residues in navel orange peel ，namely surface-enhanced Raman spectroscopy （SERS） was proposed in this study. Firstly， the SERS detection conditions of imazalil residues in navel orange peel were optimized， and the optimal detection conditions were determined as follows： Reaction time of 2 min， gold colloid of 400μL， NaBr as electrolyte solution， NaBr dosage of 25μL. Based on the above optimal conditions， 6 groups of spectral data processed by adaptive iterative penalized least squares （air PLS）， air PLS combination with normalization， air PLS combination with baseline correction， air PLS combination with first derivative， air PLS combination with standard normal distribution （SNV）， air PLS combination with multiplicative scatter correction （MSC） were used to establish support vector regression （SVR） models and compare the models prediction performance. And air PLS method was selected as the spectral pretreatment method， because the value of correlation coefficient computed value of prediction set （RP） is the largest， and the value of root mean square error calculated value of the prediction set （RMSEP） is the smallest. Then， principal component analysis （PCA） was used to extract the features from spectral data， and the first seven principal component scores were selected as the input values of SVR prediction model. SVR， multiple linear regression （MLR） and partial least squares regression （PLSR） were used to analyze and compare the prediction performances. The RP? value of prediction set of SVR prediction model could reach 0.9156， the RMSEP value of their prediction set was 4.8407 mg/kg， and the relative standard deviation computation value （RPD） was 2.3103， which indicated that the closer the predicted value of imazalil residue on navel orange surface based on SVR algorithm was to the measured value， the more effective the prediction accuracy of the model could be. The above data indicated that the speedy detection of imazalil residues in navel orange peel could be emploied by SERS coupled with PCA and SVR modeling method.