非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中免疫微環(huán)境變化及其臨床意義

申宇嘉，傅小龍

1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院放療科，上海 200030；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是常見的惡性腫瘤，2年相對生存率約為42%［1］。惡性腫瘤不是腫瘤細(xì)胞簡單的堆積，而是腫瘤細(xì)胞生活在由成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)、微血管以及眾多驅(qū)動(dòng)分子構(gòu)成的微環(huán)境中。腫瘤與其微環(huán)境存在著制約和反制約的關(guān)系，其中免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分。Burnet［2］于1970年提出“免疫監(jiān)視”概念：免疫系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別和消滅癌細(xì)胞，從而防止腫瘤的發(fā)展。之后的多項(xiàng)研究［3-5］將其概念擴(kuò)展為“免疫編輯”：免疫細(xì)胞通過與腫瘤細(xì)胞的相互作用，對腫瘤的生長發(fā)育施加選擇性壓力，腫瘤免疫原性被免疫系統(tǒng)編輯，包括消除、平衡和逃逸3個(gè)連續(xù)階段。在消除期，免疫細(xì)胞通過激活先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)消除免疫原性腫瘤。在消除期存活的少數(shù)變異型腫瘤細(xì)胞進(jìn)入平衡期，由于不斷的免疫壓力，部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生遺傳或表觀遺傳改變，腫瘤細(xì)胞免疫原性被適應(yīng)性免疫系統(tǒng)編輯，獲得規(guī)避免疫識(shí)別的能力，進(jìn)入逃逸期，最終發(fā)展為臨床可檢測到的腫瘤。腫瘤免疫微環(huán)境分析是研究腫瘤免疫逃逸機(jī)制的必經(jīng)之路。本文就NSCLC微環(huán)境中免疫細(xì)胞的性質(zhì)、密度、免疫功能定向和空間分布在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展不同階段的變化進(jìn)行綜述，進(jìn)一步闡述免疫與NSCLC腫瘤細(xì)胞相互作用在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演的角色及其臨床意義。

1 NSCLC免疫微環(huán)境概述

2018年Nature Medicine雜志首次展示肺癌細(xì)胞圖譜，Lambrechts等［6］使用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)在原發(fā)性非轉(zhuǎn)移性肺腫瘤患者中共鑒定出52個(gè)基質(zhì)細(xì)胞亞群，反映了腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，主要細(xì)胞類型包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肺泡細(xì)胞和上皮細(xì)胞。NSCLC免疫微環(huán)境中的免疫浸潤細(xì)胞包括適應(yīng)性和先天性免疫細(xì)胞［7］。Stankovic等［8］在NSCLC中發(fā)現(xiàn)了13種不同的免疫細(xì)胞類型組成超過95%的CD45+白細(xì)胞：B細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，雙陰性T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，漿細(xì)胞樣、CD1c+髓樣及CD141+髓樣樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，以及肥大細(xì)胞。

1.1 先天性免疫細(xì)胞

DC作為一種專職抗原提呈細(xì)胞，其成熟狀態(tài)與抗腫瘤效應(yīng)密切相關(guān)。成熟DC可以促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的活化和增殖，而未成熟DC具有免疫抑制作用，可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）依賴方式誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）生成，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸［9-10］。NSCLC中DC分為漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和髓樣DC（myeloid DC，mDC），后者根據(jù)表面標(biāo)志分為CD141+DC和CD1c+DC。pDC具有通過產(chǎn)生Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）增強(qiáng)抗腫瘤免疫的潛力，CD1c+DC和CD141+DC用于抗原呈遞和幼稚T細(xì)胞的激活。NSCLC中，CD1c+DC較CD141+DC更常見［8］。

髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是DC、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體，可進(jìn)一步分為粒細(xì)胞樣MDSC（granulocytic or polymorphonuclear MDSC，PMN-MDSC）和單核細(xì)胞樣MDSC（monocytic MDSC，M-MDSC），消耗腫瘤微環(huán)境內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，阻礙免疫細(xì)胞的增殖，同時(shí)造成腫瘤微環(huán)境內(nèi)的氧化應(yīng)激，影響免疫細(xì)胞的活性，具有顯著抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的能力，可抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生［11］。體外實(shí)驗(yàn)［12］證實(shí)，來自人肺鱗狀細(xì)胞癌的MDSC可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡和降低腫瘤細(xì)胞凋亡。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）是影響腫瘤微環(huán)境的重要免疫細(xì)胞之一，主要有兩種類型：M1型巨噬細(xì)胞通過分泌活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IFN等促炎癥因子來發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。M2型巨噬細(xì)胞被腫瘤微環(huán)境所誘導(dǎo)分泌IL-10、CC族趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）-18、CCL-12等抗炎癥因子抑制免疫反應(yīng)，具有促進(jìn)血管生成的作用，從而建立免疫耐受微環(huán)境［13-14］。TAM的定位與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)，一項(xiàng)meta分析［15］指出，腫瘤癌巢中高密度的CD68+TAM是良好的預(yù)后因素，而腫瘤間質(zhì)中高密度的CD68+TAM是不良的預(yù)后因素，因此TAM的位置可能是NSCLC患者的潛在預(yù)后預(yù)測因子。集落刺激因子-1受體（colonystimulating factor-1 receptor，CSF1R）作為介導(dǎo)巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中存活的蛋白，其抑制劑被認(rèn)為是消除TAM的一種治療策略，但Kumar等［16］研究發(fā)現(xiàn)，雖然CSF1R抑制劑有效地消除了TAM，但會(huì)引起腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞釋放趨化因子CXCL1數(shù)量增加，從而招募更多的免疫抑制PMN-MDSC，促進(jìn)腫瘤生長。

腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophil，TAN）可以根據(jù)其對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)作用分為N1和N2 TAN。前者通過其表面Fc受體識(shí)別腫瘤，釋放細(xì)胞毒介質(zhì)從而殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激活先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞［17］。N2 TAN則在慢性炎癥免疫應(yīng)答的過程中釋放有利于血管生成的細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［18-19］。Engblom等［20］研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌分泌可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體來激活成骨細(xì)胞，形成表達(dá)高水平唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素F的中性粒細(xì)胞，后者通過促進(jìn)血管生成、髓細(xì)胞分化、抑制T細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤浸潤。

NK細(xì)胞可直接釋放穿孔素和顆粒酶B破壞靶細(xì)胞，也可通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或死亡受體途徑Fas（CD95）和FasL（CD95L）相互作用介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21-22］。根據(jù)細(xì)胞表面分子表達(dá)與否可將CD56+NK細(xì)胞分為CD16+和CD16-兩個(gè)亞群，前者細(xì)胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B的陽性表達(dá)率顯著高于后組，因此CD16+NK細(xì)胞主要參與免疫調(diào)節(jié)作用。研究［23-24］發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者腫瘤中的NK細(xì)胞顯著減少，主要是由于NK細(xì)胞CD16+亞群水平降低所致。Russick等［25］對比了NSCLC腫瘤區(qū)和非腫瘤區(qū)NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞下調(diào)鞘氨醇-1-磷酸受體1（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1）和CX3C族趨化因子受體1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1），過表達(dá)CXC族趨化因子受體5（CXC chemokine receptor 5，CXCR5）和CXCR6，表明NK細(xì)胞被遷移出腫瘤核心。CTL相關(guān)抗原4（CTL associated antigen-4，CTLA-4）和殺傷細(xì)胞凝集素樣受體抑制分子在腫瘤NK細(xì)胞中升高，證明NSCLC中NK細(xì)胞功能受到抑制，使肺癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。

1.2 適應(yīng)性免疫細(xì)胞

T淋巴細(xì)胞普遍被認(rèn)為在免疫系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)地位［24，26］。T淋巴細(xì)胞主要包括CTL、輔助T細(xì)胞（help T cell，Th）和Treg。Th1/Th2平衡失調(diào)會(huì)造成免疫系統(tǒng)功能紊亂，使腫瘤逃避免疫攻擊，有研究［27］證實(shí)，NSCLC與Th1/Th2漂移密切相關(guān)。CD4+和CD8+T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子發(fā)揮適應(yīng)性免疫效能，而腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)、擴(kuò)增和招募Treg至腫瘤部位［28-29］。Treg具有免疫抑制性和免疫無能性兩大功能特性，其可上調(diào)T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因-3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）等免疫抑制信號(hào)，誘導(dǎo)TGF-β活化，進(jìn)一步促進(jìn)Treg分化，抑制T細(xì)胞活化［30］。

B淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體、誘導(dǎo)T細(xì)胞活化及抗原提呈來調(diào)控免疫反應(yīng)，主要存在于腫瘤的侵襲性邊緣和鄰近瘤床的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structure，TLS）中。B淋巴細(xì)胞在腫瘤中發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，腫瘤浸潤B淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating B lymphocyte，TIL-B）能夠通過抗原提呈，產(chǎn)生抗體或分泌多種細(xì)胞因子正向調(diào)控抗腫瘤免疫，活化的浸潤性B細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)，耗竭的TIL-B與Treg表型相關(guān)［31］。另一方面，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cell，Breg）通過分泌細(xì)胞因子（如IL-10、IL-35、TGF-β）、抑制功能性T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞）、促進(jìn)Treg和表達(dá)抑制性配體如程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）等機(jī)制發(fā)揮免疫抑制作用［32-34］。

2 NSCLC的癌細(xì)胞如何重塑免疫微環(huán)境

Chen等［35］提出“腫瘤-免疫循環(huán)”概念，腫瘤細(xì)胞釋放的抗原被DC捕獲并提呈給T細(xì)胞，啟動(dòng)和活化效應(yīng)T細(xì)胞，在趨化因子引導(dǎo)下，效應(yīng)T細(xì)胞遷移至腫瘤部位，通過T細(xì)胞受體與新抗原-主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）之間的相互作用識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，然而持續(xù)的免疫選擇使腫瘤細(xì)胞獲得了規(guī)避免疫識(shí)別的能力。

腫瘤浸潤發(fā)生后，DC提呈抗原，激活幼稚T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子（如IFN-γ和TNF）促進(jìn)細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。CD8+T淋巴細(xì)胞活化過程中需要共刺激信號(hào)，這些激活/抑制信號(hào)之間的平衡至關(guān)重要。最典型的共刺激信號(hào)是在抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）和活化B細(xì)胞上表達(dá)的B7家族分子（CD80和CD86）和T細(xì)胞上表達(dá)的CD28和CTLA-4之間。CD28在識(shí)別特定抗原后激活效應(yīng)T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞上的CTLA-4表達(dá)［36］。CTLA-4是關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)分子之一，抑制免疫反應(yīng)，與CD28競爭結(jié)合CD80和CD86。

NSCLC的腫瘤細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)CD205和CD103在CD1c+DC上的表達(dá)來影響CD1c+DC亞群的免疫功能，抑制CD40、CD80和CD86等共刺激信號(hào)分子在DC上的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞還可通過在DC中下調(diào)促炎癥因子（IL-12和IL-23）與上調(diào)抗炎癥因子（IL-10、TGF-β）的分泌來誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性CD1c+DC亞群，阻斷CD8+T細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)CD4+Treg產(chǎn)生，形成免疫抑制微環(huán)境［37］。

NSCLC的腫瘤細(xì)胞可分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg，促進(jìn)Treg增殖［38］，同時(shí)分泌趨化因子CCL20，募集FOXP3+Treg到腫瘤微環(huán)境中［39］。Treg表達(dá)的CTLA-4與抗原提呈細(xì)胞上的CD80和CD86結(jié)合，導(dǎo)致其下調(diào)并抑制其T細(xì)胞活化能力［40］，抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺傷作用，介導(dǎo)免疫耐受。腫瘤細(xì)胞還可上調(diào)T細(xì)胞免疫抑制性受體的表達(dá)，包括程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）、CTLA-4、LAG-3、TIM-3來逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)測。由于在腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞不斷暴露于抗原，腫瘤內(nèi)T細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的抑制和功能障礙狀態(tài)，稱為T細(xì)胞衰竭［41-43］。

NSCLC中的APC顯著降低MHC-Ⅱ的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞本身也通過下調(diào)MHC-Ⅰ類分子來減少內(nèi)源性抗原表達(dá)。人白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）是MHC的表達(dá)產(chǎn)物，MHC-Ⅰ類分子存在于腫瘤細(xì)胞表面，對CD8+T細(xì)胞免疫識(shí)別非常重要。McGranahan等［44］研究發(fā)現(xiàn)，40%的NSCLC患者具有HLA雜合性缺失（HLA loss of heterozygosity，HLA-LOH），導(dǎo)致新抗原呈遞能力降低，促使腫瘤免疫逃逸。HLA-LOH與較高的亞克隆新抗原負(fù)荷、細(xì)胞溶解活性上調(diào)和PD-L1陽性相關(guān)聯(lián)，提示HLA-LOH是腫瘤為應(yīng)對活躍的免疫微環(huán)境而作出的免疫逃逸反應(yīng)。

腫瘤還可通過外泌體調(diào)節(jié)周圍免疫微環(huán)境。腫瘤源性外泌體（tumor-derived exosome，TEX）是腫瘤和宿主細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)通訊的主要機(jī)制，能夠通過轉(zhuǎn)移其內(nèi)含物，如RNA（mRNA和非編碼RNA）、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞通訊［45］。TEX分泌的miR-21和miR-29a可以作為配體與免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體結(jié)合，觸發(fā)其介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，最終導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［46］。TEX可通過TGF-β1調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和DC的功能，如下調(diào)NKG2D抑制NK細(xì)胞功能［47-48］及抑制DC成熟從而促進(jìn)腫瘤抗原特異性免疫抑制［49］。TEX與單核細(xì)胞相互作用從而維持單核細(xì)胞不成熟的狀態(tài)，自發(fā)分泌免疫抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β和前列腺素E2）抑制T細(xì)胞增殖［50］。TEX還可通過TGF-β和IL-10依賴性機(jī)制促進(jìn)Treg和Breg增殖［51］，并誘導(dǎo)CD 4+CD 25-T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg［52］?？傮w來說，外泌體含有多種不同的免疫刺激和免疫抑制因子，可協(xié)助腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)自身周圍環(huán)境，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

綜上，腫瘤細(xì)胞可以通過編輯腫瘤微環(huán)境來逃避免疫監(jiān)測，而這種逃避機(jī)制的選擇可能與免疫微環(huán)境有關(guān)。英國TRACERx肺癌研究計(jì)劃［53］整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)和病理學(xué)數(shù)據(jù)研究腫瘤進(jìn)化過程中如何利用免疫逃逸機(jī)制，對88例早期未經(jīng)治療的NSCLC患者進(jìn)行分析，每例患者病灶多點(diǎn)取樣，發(fā)現(xiàn)不同的免疫微環(huán)境有不同的新生抗原呈遞功能障礙機(jī)制。免疫細(xì)胞浸潤低的腫瘤在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出新生抗原編輯能力的減弱，通過拷貝數(shù)丟失作為亞克隆免疫編輯機(jī)制；免疫細(xì)胞浸潤高的腫瘤區(qū)域表現(xiàn)出持續(xù)的免疫編輯作用，通過HLA-LOH或抑制新生抗原的表達(dá)（新生抗原啟動(dòng)子高甲基化）來逃避免疫監(jiān)視。免疫微環(huán)境在早期未治療的NSCLC中發(fā)揮強(qiáng)大的選擇壓力，其進(jìn)化是通過免疫編輯機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

3 NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變?nèi)绾尉庉嬆[瘤周邊微環(huán)境

3.1 NSCLC的基因組學(xué)變化

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多步驟的過程，主要是由于細(xì)胞通路中異?；虮磉_(dá)所致。與癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）cohort 2014數(shù)據(jù)相比，中國肺腺癌患者表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變頻率較高，而KRAS、BRAF、TP53和KEAP1突變頻率較低［54-55］。分析非浸潤性與早期浸潤性肺腺癌基因組的差別，浸潤性肺腺癌（invasive adenocarcinoma，IAC）的突變譜與原位癌（adenocarcinoma in situ，AIS）的突變譜密切相關(guān)，但與不典型腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）的突變譜不相關(guān)［56］。多項(xiàng)研究［57-58］表明，浸潤性腺癌與非浸潤性腺癌突變頻率差異最大的是TP53突變，說明TP53突變狀態(tài)與癌細(xì)胞潛在侵襲功能相關(guān)。從原位癌到微浸潤和浸潤性腺癌的演化過程中伴隨著更多基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）事件，原位腺癌中CNV多與細(xì)胞黏附和生長相關(guān)，微浸潤腺癌和浸潤性腺癌中CNV多與轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)［59］。

3.2 NSCLC的基因組學(xué)改變對免疫微環(huán)境的影響

NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因突變會(huì)影響腫瘤免疫細(xì)胞表達(dá)。多項(xiàng)研究［60-61］發(fā)現(xiàn)，EGFR突變型腫瘤表現(xiàn)出強(qiáng)大的髓系細(xì)胞募集，但未能產(chǎn)生CD8+免疫應(yīng)答，Gainor等［60］和Busch等［61］報(bào)道，EGFR突變患者CD8+高表達(dá)率僅為4.2%。KRAS突變表現(xiàn)出包括CD8+T細(xì)胞和Treg在內(nèi)的T細(xì)胞和B細(xì)胞多個(gè)免疫亞群的擴(kuò)增［61］。TP53突變患者的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平顯著增加，活化CD8+T淋巴細(xì)胞、活化CD4+記憶T細(xì)胞、趨化因子和促炎癥因子（IL、TNF及IFN-γ）表達(dá)水平增加［62］。STK11/LKB1突變通過AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移，STK11突變腫瘤的CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤減少［63］，并造成免疫微環(huán)境中具有T細(xì)胞抑制作用的中性粒細(xì)胞的累積和促腫瘤細(xì)胞因子（如CXCL7、CXCL3、CXCL5和IL-1a）的過度產(chǎn)生［64］，在促進(jìn)免疫抑制環(huán)境中發(fā)揮作用。

基因組學(xué)改變與PD-1/PD-L1通路的激活也存在密切聯(lián)系。有研究［65-66］發(fā)現(xiàn)，EGFR突變可誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，但也有研究［67］指出，EGFR突變的NSCLC患者表達(dá)PD-L1陽性的比例比野生型EGFR顯著降低。在間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）重排的肺腺癌中，ALK陽性腫瘤表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞平均數(shù)量和百分比均顯著高于EGFR突變或野生型肺腺癌。PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤有很強(qiáng)的相關(guān)性［68］。Schoenfeld等［69］研究發(fā)現(xiàn)，KRAS、TP53、MET突變與PD-L1表達(dá)顯著正相關(guān)，EGFR、STK11突變與PD-L1表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。

Zhang等［54］通過檢測患者的免疫浸潤相對水平建立了腫瘤微環(huán)境的免疫分子標(biāo)簽。在肺腺癌中，免疫T細(xì)胞浸潤與KRAS基因突變及擴(kuò)增顯著相關(guān)，而免疫細(xì)胞低水平浸潤則與EGFR基因突變有關(guān)。在肺鱗癌中，免疫評分低的患者，TP63、PIK3CA和SOX2擴(kuò)增及TP53、NFE2L2突變較多，同時(shí)顯示出較多的PTEN缺失。在PIK3CA擴(kuò)增或PTEN缺失較多的肺鱗癌患者樣本中，T細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及CD8的表達(dá)明顯減少。

4 在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中免疫微環(huán)境的差異性

腫瘤免疫微環(huán)境存在異質(zhì)性，腫瘤間和腫瘤內(nèi)的免疫浸潤均不同。20%以上的患者存在不同腫瘤部位的免疫細(xì)胞浸潤差異［53］，即使是浸潤前腫瘤（如原位癌）也存在顯著的異質(zhì)性［59］。Jia等［70］對15例NSCLC患者多位點(diǎn)取樣，并開發(fā)一種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來描述局部抗腫瘤反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫微環(huán)境存在較大的空間異質(zhì)性，12例患者的44個(gè)腫瘤樣本分別被劃分為“冷腫瘤”和“熱腫瘤”，其中6例患者的不同腫瘤部位同時(shí)存在“冷腫瘤”和“熱腫瘤”。但總體來說，NSCLC誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫浸潤，腫瘤中CD45+白細(xì)胞的比例高于正常肺組織［24］。Guo等［71］進(jìn)一步闡明T細(xì)胞亞群分布也存在組織特異性，如幼稚T細(xì)胞大多表達(dá)于來自外周血的細(xì)胞，而CD8+耗竭T細(xì)胞和CD4+Treg大多存在于腫瘤細(xì)胞中，癌旁正常肺組織中則主要為效應(yīng)T細(xì)胞。

4.1 不同病理學(xué)階段的免疫微環(huán)境

多項(xiàng)研究［24,54,72］顯示，與正常肺組織相比，NSCLC腫瘤中T細(xì)胞和B細(xì)胞的頻率增高，NK細(xì)胞的頻率降低。Lizotte等［23］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中CD8+T細(xì)胞的頻率升高，尤其是CD45RO+CD8+記憶T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞和FOXP3+Treg細(xì)胞的頻率皆升高。Lavin等［73］聚焦于早期肺腺癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中效應(yīng)T細(xì)胞/Treg比值降低，NK細(xì)胞尤其是CD16+NK細(xì)胞亞型顯著減少。腫瘤組織中巨噬細(xì)胞具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，與正常肺組織相比，其高表達(dá)免疫抑制轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）、CD64、CD14和CD11c，低表達(dá)CD86和CD206。PD-L1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量最高，PD-L1+巨噬細(xì)胞在腫瘤浸潤邊緣聚集，并與T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤程度呈負(fù)相關(guān)，表明適應(yīng)性免疫在肺癌發(fā)生的早期階段已經(jīng)受到抑制，形成免疫抑制微環(huán)境。Krysan等［56］評估AAH、AIS、IAC 3種病變及毗鄰的組織學(xué)正常區(qū)域的淋巴細(xì)胞浸潤程度，AAH較正常肺組織淋巴細(xì)胞浸潤明顯增加，AIS和IAC較AAH顯著增加。隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤組織中免疫細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

Mascaux等［74］從浸潤前肺鱗癌患者的免疫狀態(tài)出發(fā)，分析各階段（正常肺組織、不典型增生、原位癌和浸潤性鱗癌）支氣管活檢樣本中的免疫細(xì)胞。從重度不典型增生起，髓源性抑制細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞型豐度顯著增加，先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞存在共調(diào)控。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，在低級(jí)別病變（正常組織，輕度、中度不典型增生）中，負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)基因顯著下調(diào)，介導(dǎo)免疫釋放；在高級(jí)別病變（重度不典型增生、原位癌）和肺鱗癌中，負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)基因顯著上調(diào)，誘導(dǎo)免疫逃逸。原位癌中一部分進(jìn)展為肺鱗癌，但另一部分自然退化，目前普遍認(rèn)為宿主免疫監(jiān)測與病變的退行密切相關(guān)。Beane等［75］對肺鱗癌的癌前病變組織進(jìn)行分子分型，發(fā)現(xiàn)不同癌前病變組織的免疫狀態(tài)是不同的。持續(xù)進(jìn)展至肺鱗癌的癌前病變中IFN通路與抗原呈遞通路基因表達(dá)降低，先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞減少，癌前病變的進(jìn)展可能是腫瘤微環(huán)境中缺少浸潤免疫細(xì)胞的結(jié)果。Pennycuick等［76］研究發(fā)現(xiàn)，退行性病變中CD3+CD8+CTL顯著多于進(jìn)展性病變，CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞和Treg差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤的免疫逃避能力主要體現(xiàn)在阻止T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤區(qū)域，而非影響T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能，其還明確了原位癌進(jìn)展為鱗癌的潛在免疫逃逸機(jī)制：CCL27/CCR10信號(hào)上調(diào)，免疫調(diào)節(jié)因子TNFSF9下調(diào)。有研究［77］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NEK2基因高表達(dá)極可能預(yù)示著所在病變組織將發(fā)展為肺鱗癌。

NSCLC中腫瘤部位的T細(xì)胞衰竭與T細(xì)胞的多種抑制性受體表達(dá)有關(guān)。Lizotte等［23］研究發(fā)現(xiàn)，抑制性受體（如PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4）在腫瘤T細(xì)胞中的表達(dá)高于正常肺組織，在肺鱗癌中的表達(dá)高于肺腺癌。Zhang等［59］觀察到，無論是非浸潤性還是浸潤性肺腺癌，PD-L1的表達(dá)水平差異不大，表明早期腫瘤已經(jīng)處于免疫抑制的微環(huán)境中。

4.2 不同臨床階段的免疫微環(huán)境

Lavin等［73］研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC、B細(xì)胞和T細(xì)胞的亞群分布在不同肺腺癌分期中沒有顯著差別。Stankovic等［8］比較了肺腺癌和肺鱗癌不同分期（Ⅰ～Ⅲ期）腫瘤組織中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD1c+DC、pDC和巨噬細(xì)胞的百分比，發(fā)現(xiàn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），但CD141+DC在Ⅰ期NSCLC中的百分比高于Ⅱ、Ⅲ期（P=0.04）。而Chen等［78］通過對NSCLC腫瘤組織行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期NSCLC中2種B細(xì)胞亞型（初始B細(xì)胞和漿細(xì)胞）的分布存在差異，Ⅲ期的初始B細(xì)胞顯著低于Ⅰ期，且初始B細(xì)胞的浸潤水平越高，存活率和無復(fù)發(fā)率越高，其通過體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期NSCLC的漿細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而Ⅰ期的漿細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

關(guān)于抑制性受體在T細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤分期是否有關(guān)尚存在爭議。Thommen等［43］研究發(fā)現(xiàn)，PD-1和TIM-3在腫瘤部位CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)隨著腫瘤分期的增加而增加。Kargl等［24］則認(rèn)為，CD4+細(xì)胞PD-1的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，CD8+細(xì)胞PD-1的表達(dá)與腫瘤分期無關(guān)。Lavin等［73］研究指出，巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的PD-1和PD-L1的表達(dá)水平在TNM各個(gè)時(shí)期比較穩(wěn)定。

晚期轉(zhuǎn)移性NSCLC可能具有與早期不同的分子特征。Kim等［79］對44例轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者原發(fā)灶、胸膜液、淋巴結(jié)或腦轉(zhuǎn)移的腫瘤樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)髓樣細(xì)胞啟動(dòng)免疫抑制微環(huán)境，腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中正常的髓樣細(xì)胞群逐漸向單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和DC轉(zhuǎn)變，且后者顯示為免疫抑制表型，這可能導(dǎo)致肺腺癌和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的腫瘤抗原呈現(xiàn)不佳。腦轉(zhuǎn)移作為晚期肺癌的常見轉(zhuǎn)移部位，Li等［80］研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC腦轉(zhuǎn)移患者表現(xiàn)出較強(qiáng)的全身性免疫抑制，與早期未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者相比，外周血單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)、MDSC豐度和Treg百分比均顯著增加，而腫瘤來源的IL-6是誘導(dǎo)單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)的主要介質(zhì)。Kudo等［81］研究了39例NSCLC患者的原發(fā)灶與腦轉(zhuǎn)移瘤樣本并進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，腦轉(zhuǎn)移瘤中存在更加嚴(yán)重的免疫抑制現(xiàn)象，分析兩組樣本的差異基因發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)腫瘤相比，腦轉(zhuǎn)移瘤中DC成熟、Th1和白細(xì)胞外溢信號(hào)通路受到抑制。血管細(xì)胞黏附分子1表達(dá)水平更低，抑制白細(xì)胞黏附于炎癥部位，CD8+T細(xì)胞減少，M2型巨噬細(xì)胞浸潤增加。

5 NSCLC免疫微環(huán)境的臨床意義

5.1 預(yù)后轉(zhuǎn)歸不同

CD8+、CD3+、CD45RO+T細(xì)胞普遍被認(rèn)為與NSCLC預(yù)后呈正相關(guān)［26,82］。一項(xiàng)針對797例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者的研究［83］證實(shí)，腫瘤間質(zhì)中的CD8+T細(xì)胞密度被證明是無病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）的獨(dú)立預(yù)后因素，并在每個(gè)病理學(xué)分期階段增加對預(yù)后的影響。Fridman等［84］回顧了124項(xiàng)T細(xì)胞對腫瘤（包括NSCLC）預(yù)后作用的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的強(qiáng)浸潤通常與較好的預(yù)后相關(guān)，最穩(wěn)定的積極預(yù)后指標(biāo)為CD8+T細(xì)胞、CD45RO+T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞。而Foxp3+Treg的高浸潤普遍被認(rèn)為與NSCLC的不良OS顯著相關(guān)［85］。

免疫細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值需要綜合考慮細(xì)胞類型、細(xì)胞亞群、空間分布和功能狀態(tài)。近些年提出免疫熱區(qū)和免疫冷區(qū)的概念，TRACERx研究［86］利用人工智能手段繪制肺腺癌中免疫細(xì)胞的空間位置圖譜，根據(jù)淋巴細(xì)胞百分比劃分免疫熱區(qū)和免疫冷區(qū)，前者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯高于后者。臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析聯(lián)盟則通過多組學(xué)的方式對肺腺癌不同免疫特征建立了不同分型，共鑒定出64種不同的細(xì)胞類型，包括免疫和基質(zhì)細(xì)胞，聚類分析出免疫熱區(qū)和免疫冷區(qū)，發(fā)現(xiàn)免疫熱區(qū)具有更強(qiáng)的B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞特征，PD-1、PD-L1、TGF-β和IL-10表達(dá)上調(diào)［87］。

5.2 對免疫治療的應(yīng)答不同

免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞數(shù)量、種類、功能與抗腫瘤免疫應(yīng)答密切相關(guān)。2017年，Chen等［88］將腫瘤組織分為免疫炎癥型（inflamed phenotype）、免疫豁免型（immue-excluded phenotype）和免疫沙漠型（immune-desert phenotype）。免疫炎癥型腫瘤有豐富的T細(xì)胞（包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）浸潤，對于抗PD-1/PD-L1免疫治療的反應(yīng)良好；免疫豁免型腫瘤免疫細(xì)胞存在于腫瘤基質(zhì)中，不能滲透入腫瘤實(shí)質(zhì)；免疫沙漠型腫瘤無論是腫瘤基質(zhì)還是實(shí)質(zhì)均缺少T細(xì)胞，后兩者通常對免疫治療均缺少應(yīng)答。2021年MD安德森癌癥中心通過對29個(gè)功能基因表達(dá)特征的轉(zhuǎn)錄組分析將腫瘤微環(huán)境進(jìn)行分類，創(chuàng)建了4種不同黑色素瘤的腫瘤微環(huán)境模型，并在多個(gè)癌種（包括肺癌）中驗(yàn)證其作為一種生物標(biāo)志物用于預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果的預(yù)測價(jià)值［89］。

6 結(jié)語

在NSCLC微環(huán)境中，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞及其他基質(zhì)細(xì)胞和組織成分之間存在復(fù)雜的相互作用。免疫微環(huán)境持續(xù)地給腫瘤施加免疫壓力，使腫瘤通過免疫編輯來完成免疫逃逸，而這種免疫編輯機(jī)制可能與免疫細(xì)胞浸潤的程度有關(guān)。本綜述描述了免疫細(xì)胞在不同病理學(xué)階段及臨床分期NSCLC中的浸潤情況，這些細(xì)胞的分布和功能在不同程度上與腫瘤的進(jìn)展和患者預(yù)后相關(guān)。免疫細(xì)胞能夠識(shí)別癌前病變，免疫系統(tǒng)在腫瘤形成非常早期時(shí)已發(fā)生功能失調(diào)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、驅(qū)動(dòng)基因、CNV的水平和程度、非同義突變負(fù)荷和克隆異質(zhì)性都參與NSCLC免疫結(jié)構(gòu)的形成，并決定其異質(zhì)性。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤周邊免疫微環(huán)境對NSCLC的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，不同的免疫微環(huán)境也會(huì)影響腫瘤對免疫治療的應(yīng)答及最終預(yù)后轉(zhuǎn)歸。