外周血間充質(zhì)干細(xì)胞在膝關(guān)節(jié)難治性運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

范寶石 張雪琳 葉景 孫澤文 韓超 宋士堂 許冰冰 余家闊

1 濰坊醫(yī)學(xué)院（山東濰坊261053）2 北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100191）

在膝關(guān)節(jié)多種運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷中，膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨損傷、半月板損傷和交叉韌帶斷裂基本不能自愈，且這些損傷發(fā)生后，解決膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨、半月板和交叉韌帶的結(jié)構(gòu)和功能重建的手術(shù)難度也都較大，因此這幾種損傷屬于膝關(guān)節(jié)難治性運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來(lái)源于中胚層、具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱、肌肉、脂肪等組織細(xì)胞[1]。它具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性和旁分泌能力[2]，能夠釋放合成細(xì)胞因子并直接分化成特異性結(jié)締組織細(xì)胞，遷移到損傷部位，刺激祖細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)組織修復(fù)，且不會(huì)影響周圍未受損組織細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞，對(duì)于難治性運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷的治療具有重要意義[3，4]。

外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cells，PBMSCs)的分化潛能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)相似，但具有采集方便安全的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是一種容易獲取并應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究的成體干細(xì)胞種子來(lái)源[5]。我們對(duì)PubMed、Embase 和Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了系統(tǒng)文獻(xiàn)檢索，檢索方式為：(peripheral OR blood OR circulating)AND(mesenchymal stem cell OR mononuclear cell)AND(cartilage OR chondrogenesis OR chondral OR ligament)AND(human OR patient OR animal OR mouse OR rat OR rabbit OR dog OR sheep OR pig OR horse OR ovine)，對(duì)使用PBMSCs再生修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨、交叉韌帶和半月板的研究文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)分析。

1 PBMSCs的分離培養(yǎng)、表征和優(yōu)勢(shì)

PBMSCs 的分離方法包括密度梯度離心法[6，7]、蛋白微珠分選法[8]、血細(xì)胞分離機(jī)分離法[9]等。其中，蛋白微珠分選法和血細(xì)胞分離機(jī)分離法獲得的細(xì)胞純度較高，但因費(fèi)用高、操作復(fù)雜且影響細(xì)胞活性等原因較少采用；密度梯度離心法是利用PBMSCs和血細(xì)胞之間密度上的差異，在分離液的不同層次進(jìn)行分離，同時(shí)因其符合正常生理性滲透壓、不易破壞生物膜、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害、分離效果好且簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)而成為常用的分選方案。目前研究者采用不同的分離和培養(yǎng)方式從人[10]、馬[2]、羊[11]、兔[12]、大鼠[13]和小鼠[14]的外周血中成功分離得到了MSCs，大多數(shù)的PBMSCs 獲取需要提前用人粒細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte colonystimulating factor，HG-CSF)進(jìn)行動(dòng)員[15]。

現(xiàn)有的研究表明，PBMSCs 能夠表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的標(biāo)志物(CD29、CD105、CD166)和多能干細(xì)胞的標(biāo)志物(Oct4)，但不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志物(CD14、CD34、CD45、HLA-DR)，這些表型特征與BMMSCs 相似[16]。同時(shí)，PBMSCs 具有良好的三系分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化為軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同的譜系[17]。

除了具有與BMMSCs相似的表型特征和分化潛能外，PBMSCs 還有其他優(yōu)勢(shì)。比如PBMSCs 的獲取過(guò)程不會(huì)給患者帶來(lái)痛苦，避免了因抽取骨髓而產(chǎn)生一系列的并發(fā)癥，如出血和慢性疼痛[15]。PBMSCs的優(yōu)勢(shì)還體現(xiàn)在患者年齡方面。外周血是從患者體內(nèi)獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的最方便來(lái)源，無(wú)論患者年齡多大都可以獲取，而且獲取后可以冷凍并儲(chǔ)存起來(lái)供以后使用[18]。同時(shí)，由于PBMSCs可以通過(guò)微創(chuàng)的方式從自體動(dòng)員和采集，無(wú)需手術(shù)獲取，可真正實(shí)現(xiàn)自體移植，避免倫理上的限制[19，20]。

就取材途徑以及對(duì)供體的影響而言，PBMSCs有望成為BMMSCs新的替代資源之一，從臨床角度上，大部分醫(yī)院具有成熟的血液采集流程以及外周血干細(xì)胞動(dòng)員和采集操作步驟。血細(xì)胞分離機(jī)分離的每4ml 細(xì)胞懸液中的成軟骨干細(xì)胞的數(shù)量即可滿足臨床使用。相比于BMMSCs，PBMSCs更容易在臨床上進(jìn)行推廣。

體外實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了PBMSCs 誘導(dǎo)分化成的軟骨細(xì)胞的蛋白多糖染色、Ⅱ型膠原(collagen-Ⅱ，Col-Ⅱ)免疫組化染色比BMMSCs 分化來(lái)的軟骨細(xì)胞陽(yáng)性更強(qiáng)[21，22]。

膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境相對(duì)缺氧。研究發(fā)現(xiàn)，PBMSCs 比BMMSCs更耐受缺氧環(huán)境[22，23]。PBMSCs還具有高度的端粒酶活性，這使得細(xì)胞可以持續(xù)分裂，高達(dá)40 個(gè)群體倍增[24]。PBMSCs 具有成軟骨能力強(qiáng)、耐缺氧、不良環(huán)境增殖能力強(qiáng)和干性維持好等特點(diǎn)，顯示了其治療難治性運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷的潛力[25]。

2 PBMSCs 在膝關(guān)節(jié)軟骨、交叉韌帶和半月板損傷治療中的應(yīng)用

2.1 PBMSCs 在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用

PBMSCs具有軟骨前體細(xì)胞的潛能，可啟動(dòng)透明軟骨的重建[26-28]。PBMSCs的軟骨分化是通過(guò)各種方法在體外實(shí)現(xiàn)的。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(TGF-β3)誘導(dǎo)的成軟骨細(xì)胞系中，二維培養(yǎng)的PBMSCs表達(dá)Ⅱ型膠原前體[29]。Tondreau 等利用TGF-β誘導(dǎo)PBMSCs 成軟骨實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)2～3周后，蛋白多糖出現(xiàn)，表明軟骨分化成功[30]。Saw等進(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)軟骨缺損患者進(jìn)行軟骨下鉆孔，術(shù)后1周收集PBMSCs，每周1次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PBMSCs和透明質(zhì)酸，共5周。術(shù)后二次關(guān)節(jié)鏡評(píng)估結(jié)果顯示治療部位透明軟骨再生[31]。另外一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HG-CSF動(dòng)員后的PBMSCs在自體松質(zhì)骨支架上啟動(dòng)軟骨細(xì)胞分化，富血小板血漿的加入進(jìn)一步刺激細(xì)胞向Sox9(sry related hmg box 9)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞表型增殖，引起Col-Ⅱ和葡糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAG)mRNA的順序增加，組織學(xué)結(jié)果顯示新形成的透明軟骨中蛋白多糖和氨基葡萄糖多糖含量增加[32]。此外，PBMSCs還可以促進(jìn)膝關(guān)節(jié)髕骨下脂肪墊來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨破損處遷移和分化[33]。

在綿羊[18]和兔[34]軟骨缺損治療模型中，PBMSCs 治療與BMMSCs 治療同樣有效，兩種干細(xì)胞具有相似的體內(nèi)軟骨形成能力。Zhao 構(gòu)建的PBMSCs 復(fù)合改良脫鈣骨基質(zhì)新型組織工程軟骨對(duì)豬軟骨缺損具有良好的修復(fù)作用[35]。有研究結(jié)果表明，相比于單獨(dú)使用透明質(zhì)酸，聯(lián)合PBMSCs的關(guān)節(jié)內(nèi)注射可以在體內(nèi)明顯抑制大鼠骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的進(jìn)展[36]，關(guān)節(jié)內(nèi)注射PBMSCs是治療OA的一種方便有效的方案[37]。

臨床研究利用PBMSCs 進(jìn)行膝關(guān)節(jié)軟骨損傷患者體內(nèi)修復(fù)和再生的成果從主客觀功能評(píng)分、放射學(xué)檢查、關(guān)節(jié)鏡二次檢查和組織病理學(xué)等方面證實(shí)了PBMSCs 的安全性和有效性。應(yīng)用PBMSCs 治療國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(international cartilage repair society，ICRS)Ⅲ/Ⅳ級(jí)軟骨病變、不同病因的骨軟骨病變、早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變和大面積全層軟骨缺損的4項(xiàng)臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：治療后患者KOOS 評(píng)分[38-40]、Lysholm 評(píng)分[38，39]、WOMAC 評(píng)分[40]、IKDC 2000主觀評(píng)分[41]和Tegner 評(píng)分[41]均較治療前有所改善，VAS 評(píng)分[38，39]較治療前減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。放射學(xué)檢查作為一種非侵入性檢查方法，被廣泛用于評(píng)價(jià)軟骨修復(fù)和再生的效果。應(yīng)用PBMSCs治療ICRS Ⅲ/Ⅳ級(jí)軟骨病變、不同病因的骨軟骨病變、早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變和大面積全層軟骨缺損的6 項(xiàng)臨床研究使用MRI[38，39，41，42]、X射線[20，31]或CT[41]來(lái)評(píng)估修復(fù)效果，并報(bào)告治療后形態(tài)學(xué)評(píng)分較治療前改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再生組織與正常軟骨、軟骨下骨信號(hào)相同。其中有4 項(xiàng)人體研究通過(guò)關(guān)節(jié)鏡二次檢查的方法評(píng)估軟骨修復(fù)效果，認(rèn)為PBMSCs產(chǎn)生的軟骨再生效果與BMMSCs相當(dāng)，再生的軟骨與正常軟骨組織相似[20，31，41，42]。其中有4 項(xiàng)人體研究報(bào)告了經(jīng)PBMSCs 治療后ICRS 評(píng)分改善，組織學(xué)觀察到軟骨再生明顯[20，31，40，42]。

2.2 PBMSCs 在膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷修復(fù)中的作用已在大動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中有了初步研究結(jié)果

有學(xué)者研究了PBMSCs 在膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷治療中的安全性和有效性。一項(xiàng)馬同種異體PBMSCs 靜脈注射研究證實(shí)了PBMSCs 注射對(duì)大動(dòng)物的安全性。291 匹正常馬接受了多次靜脈注射同種異體來(lái)源的PBMSCs，均未表現(xiàn)出不良反應(yīng)，表明同種異體PBMSCs的靜脈注射是安全的[43]。Proffen 等分別將髕后脂肪墊來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、PBMSCs與豬前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明PBMSCs 對(duì)交叉韌帶成纖維細(xì)胞遷移的刺激作用比髕后脂肪墊來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞更強(qiáng)[44]。一項(xiàng)研究在豬ACL 橫斷的膝關(guān)節(jié)模型中注射PBMSCs 進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射前后的交叉韌帶成熟度指數(shù)、生物力學(xué)和組織學(xué)方面并沒(méi)有顯著的差異[45]，PBMSCs用于交叉韌帶再生的臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。

2.3 PBMSCs 在膝關(guān)節(jié)半月板結(jié)構(gòu)和功能重建領(lǐng)域的應(yīng)用值得重視

雖然尚未見(jiàn)PBMSCs 在治療半月板損傷方面的應(yīng)用研究文獻(xiàn)，但是其他種類的MSCs治療膝關(guān)節(jié)半月板損傷的研究有很多，其中大部分都是骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞[46，47]。本項(xiàng)目組以動(dòng)態(tài)拉伸-壓縮加載系統(tǒng)結(jié)合兩種生長(zhǎng)因子的方式構(gòu)建負(fù)載BMMSCs的組織工程半月板，將其植入兔內(nèi)側(cè)半月板全切模型中進(jìn)行半月板修復(fù)，重建了半月板的正常結(jié)構(gòu)和功能，證實(shí)了異質(zhì)性組織工程半月板在體內(nèi)長(zhǎng)期保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨的效用[48]。

本項(xiàng)目組的研究已經(jīng)表明，PBMSCs與BMMSCs相比具有耐缺氧特點(diǎn)[49]且有更好的成軟骨能力[21]，因此，PBMSCs 對(duì)半月板白區(qū)的修復(fù)是否比其他干細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)值得探討，PBMSCs更好的成軟骨能力是否更有利于半月板這種纖維軟骨組織的修復(fù)再生也值得關(guān)注。

3 小結(jié)與展望

干細(xì)胞藥、干細(xì)胞植入材料和干細(xì)胞組織工程將推動(dòng)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域傷病治療的革命性變革[17，35，50]。PBMSCs作為一種有前途的干細(xì)胞來(lái)源，目前研究結(jié)果已經(jīng)顯示其在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)和交叉韌帶損傷治療方面的潛在價(jià)值，尤其在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)方面，PBMSCs 移植修復(fù)大面積軟骨損傷已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用。相比于PBMSCs在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的應(yīng)用，PBMSCs在交叉韌帶損傷修復(fù)中的研究才剛剛起步，其在交叉韌帶損傷修復(fù)中的潛力值得重視。對(duì)于股骨和脛骨之間、受力環(huán)境特殊的半月板組織損傷后的結(jié)構(gòu)和功能重建來(lái)說(shuō)，具有耐缺氧和軟骨分化優(yōu)勢(shì)的PBMSCs的應(yīng)用研究值得探討。