循環(huán)腫瘤DNA在Ⅱ期結(jié)腸癌治療風(fēng)險(xiǎn)評估中應(yīng)用的研究進(jìn)展

肖蓉蓉，夏 天，李淳一綜述，黃新恩審校

0 引 言

結(jié)腸癌發(fā)病率目前是第四常見惡性腫瘤[1]。在結(jié)腸癌中，腫瘤分期主要基于原發(fā)腫瘤以及淋巴結(jié)和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分類，該分類已被接受50多年，該系統(tǒng)根據(jù)腫瘤的原發(fā)和區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度以及是否存在轉(zhuǎn)移，為腫瘤切除后的預(yù)后提供了明確的指示。Ⅱ期結(jié)腸癌術(shù)后(包括輔助化療和不輔助化療的患者)5年總生存率為70%～80%[2]。大量研究已表明輔助化療可改善II期結(jié)腸癌患者的生存期，但與風(fēng)險(xiǎn)相比，獲益較少，不推薦低風(fēng)險(xiǎn)II期結(jié)腸癌行術(shù)后輔助治療，然而高風(fēng)險(xiǎn)II期結(jié)腸癌可從中獲益[3-4]。因此，輔助治療前的風(fēng)險(xiǎn)評估極其重要。目前腫瘤分期需要結(jié)合影像學(xué)的證據(jù)才可對病情進(jìn)行評估。而ctDNA可以在影像學(xué)表現(xiàn)前被檢出，且檢查方便。而對于高風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)腸癌目前仍無明確的定義，也無明確統(tǒng)一的治療策略。本文就ctDNA作為生物指標(biāo)對II期結(jié)腸癌的治療的指導(dǎo)作用作一綜述。

1 現(xiàn) 狀

全世界每年大約診斷出130萬例大腸癌病例[5]。目前結(jié)腸癌認(rèn)為的高風(fēng)險(xiǎn)因素: T4(ⅡB、ⅡC期)、組織學(xué)分化差(3/4級，不包括MSI-H者)、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤、術(shù)前腸梗阻或腫瘤部位穿孔、切緣陽性或情況不明、切緣安全距離不足、送檢淋巴結(jié)不足12枚[5]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)腫瘤DNA，RNA，微泡，包括外泌體等均被實(shí)驗(yàn)確定為癌癥患者基因組信息的來源，可反映原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病變中存在的所有亞克隆，從而可連續(xù)監(jiān)測疾病的進(jìn)展[6]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)生物學(xué)標(biāo)志物與結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)，如外泌體微小核糖核酸[7-8]等，但仍未應(yīng)用于臨床。早期結(jié)腸癌的當(dāng)前治療模式包括在一組選定的患者中進(jìn)行手術(shù)，然后進(jìn)行輔助化學(xué)療法，其目的是根除最小的殘留疾病以實(shí)現(xiàn)治愈。絕大部分結(jié)腸癌患者僅靠手術(shù)就能治愈。當(dāng)前,手術(shù)和輔助化學(xué)療法可在約三分之二的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者中實(shí)現(xiàn)長期生存[9]。

2 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 是來自腫瘤細(xì)胞的循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)片段。cfDNA被認(rèn)為是疾病負(fù)擔(dān)一個(gè)“實(shí)時(shí)”快照，由腫瘤患者血中腫瘤細(xì)胞凋亡，壞死，激活時(shí)釋放，cfDNA在循環(huán)中的半衰期約為十幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)[10]。cfDNA釋放入循環(huán)后，cfDNA在腎、肝和脾中被迅速清除[8]。ctDNA通常是通過檢測體細(xì)胞變異體推斷出的，從腫瘤細(xì)胞釋放到血液中，且原則上含有與腫瘤細(xì)胞相同的遺傳缺陷。因此，可在腫瘤中鑒定出的分子變化包括點(diǎn)突變，重排，擴(kuò)增，甚至是基因拷貝數(shù)變化。ctDNA可從血液中快速清除，可通過微創(chuàng)方法獲得，因此可用作腫瘤生物學(xué)的動態(tài)生物標(biāo)記，一些研究表明治療期間ctDNA水平的波動可能有助于監(jiān)測癌癥治療的效果[11]。鑒于結(jié)腸癌患者使用精準(zhǔn)藥物有限，ctDNA檢測已成為評估結(jié)腸癌的潛在工具，具有最小的侵入性，快速的周轉(zhuǎn)時(shí)間和低成本的采樣程序等優(yōu)勢，使臨床能夠迅速指導(dǎo)患者進(jìn)行最佳治療，并可能通過多次采樣實(shí)施治療變化來監(jiān)測耐藥性。但仍存在一些局限性，ctDNA主要局限性是與組織分析相比的敏感性和特異性以及ctDNA分析不能分析除基因組改變以外的生物標(biāo)志物，如微小核糖核酸。

3 CtDNA檢測方法

ctDNA中可檢測到的遺傳和表觀遺傳變化類型包括:突變、甲基化、拷貝數(shù)變化和結(jié)構(gòu)變化或重新排列。ctDNA的分析從點(diǎn)突變分析到全基因組分析不等,許多腫瘤患者外周血液中測得的ctDNA含有與實(shí)體腫瘤細(xì)胞相同的分子突變。但是傳統(tǒng)的DNA分析方法(如Sanger測序)的敏感性不足。ctDNA在血液循環(huán)中濃度仍然很低，且以碎片化的方式存在腫瘤患者的血中，ctDNA的檢測仍具有極大的挑戰(zhàn)。目前檢測方法包括：數(shù)字微滴聚合酶鏈反應(yīng) (droplet digital PCR，ddPCR)、基于磁珠固相擴(kuò)增的乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)和高通量測序(next generation sequencing,NGS)、突變擴(kuò)增系統(tǒng)、全基因組測序以及全外顯子測序等。ddPCR使用液滴生成器，對每個(gè)分子的靶序列進(jìn)行單獨(dú)分析，從而可檢測突變或野生型DNA片段，該方法檢測同一樣品的多個(gè)突變具有高度靈敏度(0.05%至0.001%)[12]，但若檢測5至10個(gè)不同的靶序列則較為復(fù)雜[9]。基于磁珠固相擴(kuò)增的乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)方法靈敏度約為0.01%，該方法相當(dāng)復(fù)雜，幾乎不能用于常規(guī)分析[12]。因此，這些方法通常應(yīng)用于研究少量突變，并且通常用于分析癌癥點(diǎn)突變。靶向測序可使用PCR擴(kuò)增子或雜交獲取，高靈敏度檢測多個(gè)基因，測序范圍可從單個(gè)目標(biāo)外顯子(千堿基)到整個(gè)外顯子組(約50兆堿基)，在等位基因低于0.1%的情況下也可測出突變[13]。NGS是一種能夠通過在測序之前將靶基因/區(qū)域與反義寡核苷酸雜交來確定需要的基因組區(qū)域，是一種高敏感的可檢測多個(gè)突變的措施，但目前檢測價(jià)格昂貴，因此需進(jìn)一步發(fā)展以降低成本[14-17]。突變擴(kuò)增系統(tǒng)是一種利用引物與模板DNA互補(bǔ)進(jìn)行擴(kuò)增，高特異性，高靈敏性，操作簡單，耗時(shí)短，成本低，但特異性取決于引物，需要已知突變，在一定程度上應(yīng)用有所限制[14-16,18]。

4 ctDNA的水平與分期

目前，ctDNA水平隨著結(jié)腸癌分期的升高而升高，且已知有驅(qū)動基因改變：APC, KRAS和TP53突變的早期患者較突變陰性患者的ctDNA有明顯增高。使用ddPCR方法，發(fā)現(xiàn)ctDNA在結(jié)腸癌相比其他實(shí)體腫瘤的患者中更易檢測[19]。這為ctDNA在結(jié)腸癌早期疾病研究提供了一定的線索。且結(jié)腸癌術(shù)后和化療后仍具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者，ctDNA仍可被檢測到，這為探索其他治療方法提供了獨(dú)特的機(jī)會[20]。但是目前大量的臨床實(shí)驗(yàn)采用的方法不同，急需具有統(tǒng)一方法的大型前瞻性隨機(jī)對照臨床研究的數(shù)據(jù)來進(jìn)一步證實(shí)。

5 ctDNA定量測試和癌癥分期預(yù)測

一項(xiàng)前瞻性實(shí)驗(yàn)，甲基化BCAT1和/或IKZF1DNA標(biāo)記ctDNA，以此來檢測血中的ctDNA[19]。模擬疾病的嚴(yán)重程度(非癌癥，早期癌癥，晚期癌癥)和甲基化的分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。甲基化BCAT1和IKZF1 DNA分?jǐn)?shù)隨腫瘤侵入程度的增加而增加。設(shè)計(jì)模型，對于給定的甲基化分?jǐn)?shù)值，計(jì)算相對于非癌癥疾病，早期或晚期癌癥的相對風(fēng)險(xiǎn)。這些模型表明，如果未檢測到甲基化，則患癌癥的相對風(fēng)險(xiǎn)較低[21]。對于含有約5%甲基化的BCAT1和IKZF1 DNA模型估計(jì)的風(fēng)險(xiǎn)為具有早期癌癥，另一方面，如果甲基化程度約為40%，則患晚期癌癥的相對風(fēng)險(xiǎn)則較高[21]。這些研究表明，ctDNA與結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)高低有關(guān)系，表明可通過定量測定ctDNA為患者行風(fēng)險(xiǎn)分層評估。計(jì)算甲基化分?jǐn)?shù)值，可相對計(jì)算患者是否為高危險(xiǎn)人群而為治療決策提供意見。

6 微小殘留病灶的替代指標(biāo)

切除Ⅱ期結(jié)腸癌后檢測循環(huán)腫瘤DNA可能會發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)最高的患者，并有助于告知輔助治療決策。有研究回顧了ctDNA在結(jié)腸癌中的使用，發(fā)現(xiàn)血漿中可檢測到ctDNA的患者與無ctDNA的患者相比，血漿中的總體生存期和無進(jìn)展生存期較差，切除后不存在ct DNA與改善預(yù)后和降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[8]。目前治療結(jié)束后的二期結(jié)腸癌通常需通過癌胚抗原(carcinoembryonic antige，CEA) 和電子計(jì)算機(jī)斷層掃面(computed tomography,CT)監(jiān)測隨訪。CT對鑒別微轉(zhuǎn)移病灶不夠敏感，且有頻繁暴露于輻射和造影劑的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，隨訪檢測具有局限性。選擇更敏感以及更簡易的方法是目前的難題。追蹤和量化關(guān)鍵基因的突變，如APC、KRAS和TP53等已知基因，可在早期CRC中發(fā)揮作用，是識別微小殘留病和復(fù)發(fā)性疾病的一種有希望的策略。甲基化IKZF1和BCAT1通常在血液中被標(biāo)記來檢測ctDNA，ctDNA存在于Ⅱ結(jié)腸癌患者血中，大多數(shù)患者ctDNA在手術(shù)后會消失[22]。可予檢測已知基因的ctDNA可及時(shí)評估出患者具有高風(fēng)險(xiǎn)，考慮是否應(yīng)該予以進(jìn)一步輔助治療。最近，在一項(xiàng)以腫瘤測序選擇突變，該試驗(yàn)包括230名Ⅱ期結(jié)腸患者，對每個(gè)患者選擇突變等位基因分?jǐn)?shù)相對最高的突變，追蹤測定該ctDNA[23]。52例(23%)患者接受了輔助化療，其中6例術(shù)后檢測到ctDNA。在這些病例中，6例中有5例在輔助化療的初始階段無法檢測到ctDNA，其中有2例在完成輔助化療后可再次檢測到ctDNA，均在ctDNA檢測后343d及472d出現(xiàn)放射學(xué)復(fù)發(fā)[23]。該實(shí)驗(yàn)表明化療結(jié)束后檢測ctDNA與無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)(P=0.001)。在未接受輔助化療的患者中，178例(7.9%)患者中有14例術(shù)后檢測到ctDNA，其中11例(79%)在中位隨訪27個(gè)月后復(fù)發(fā)[5]。本研究的局限是僅追蹤1個(gè)突變，這影響評估ctDNA檢測分析的靈敏度。此外，在結(jié)腸癌患者中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤內(nèi)體細(xì)胞突變的異質(zhì)性[23]。因此，從理論上講，應(yīng)該選擇跟蹤1個(gè)癌癥內(nèi)所有癌細(xì)胞中可能存在的突變進(jìn)行ctDNA跟蹤，否則可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。同時(shí),應(yīng)考慮到單次活檢研究不能可靠地評估克隆性，因此最好同時(shí)檢測多個(gè)突變。一項(xiàng)前瞻性研究以確定Ⅱ期結(jié)腸癌患者手術(shù)后檢測這些標(biāo)志物與殘留疾病和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系[11]。12個(gè)月內(nèi)手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者以研究ctDNA中甲基化IKZF1和BCAT1 與殘留病灶風(fēng)險(xiǎn)和無復(fù)發(fā)生存期的相關(guān)性。172名結(jié)腸癌術(shù)后患者采集ctDNA并隨訪，進(jìn)行多變量建模，具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)特征患者的ctDNA陽性率是其他患者的3～5倍，手術(shù)后ctDNA陽性與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR 3.8，1.5～9.5，P=0.004)，即兩者存在相關(guān)性[12]。表明術(shù)后甲基化ctDNA陽性與結(jié)腸癌患者殘留疾病和隨后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)。上述結(jié)果支持二期結(jié)腸切除術(shù)后ctDNA檢測可能是殘留病灶的替代指標(biāo)，并可識別出復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者。綜上，可通過檢測Ⅱ期結(jié)腸癌患者術(shù)后的ctDNA水平，評估有無殘留病灶，以協(xié)助診斷該患者是否為高風(fēng)險(xiǎn)患者，以確定是否需進(jìn)一步治療。

7 輔助化療與ctDNA水平

一項(xiàng)來自于2017年的230名Ⅱ期結(jié)腸癌患者的的隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)中，前瞻性隊(duì)列研究，檢測1046血漿樣本中最小殘留疾病的能力。在接受化療的患者中，化療完成后ctDNA的存在與無復(fù)發(fā)生存期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者相關(guān)(HR，11； 95%CI，1.8～68；P=0.001)[23]。178例Ⅱ期結(jié)腸癌患者術(shù)后未經(jīng)化療的患者中有14例在手術(shù)后檢測到ctDNA,在這14例患者中有11例在隨訪期間影像學(xué)發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)證據(jù)(78.6%);178名患者中的其余164名(92.1%)術(shù)后ctDNA陰性，據(jù)報(bào)道16名患者疾病復(fù)發(fā)(9.8%)[24]。在Ⅱ期結(jié)腸癌患者術(shù)后接受輔助化學(xué)療法治療的所有患者中，復(fù)發(fā)的27例中有2例(7.4%)的術(shù)后CEA升高，而未復(fù)發(fā)的151例中有5例(3.3%)的CEA升高。術(shù)后可檢測到ctDNA的患者均未出現(xiàn)CEA升高，說明ctDNA有獨(dú)立的檢出意義，表明Ⅱ期結(jié)腸癌切除后的ctDNA檢測可作為殘留疾病的直接證據(jù)，并可依此結(jié)合其他臨床證據(jù)來篩選復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者[13]。未經(jīng)化療ctDNA陽性的Ⅱ期結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)極高，該風(fēng)險(xiǎn)高于常規(guī)接受輔助治療的Ⅲ期大腸癌患者，相反，術(shù)后ctDNA陰性的患者發(fā)生影像學(xué)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較低，與Ⅰ期大腸癌患者無異，可用來確定不太需要輔助治療的人群[23]。將患者分為臨床復(fù)發(fā)低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組時(shí)，低風(fēng)險(xiǎn)患者的PFS明顯高于高風(fēng)險(xiǎn)患者[23]。術(shù)后ctDNA狀態(tài)的預(yù)后影響與個(gè)體臨床病理風(fēng)險(xiǎn)特征無關(guān)，并且改善了臨床病理低和高風(fēng)險(xiǎn)特征的患者的PFS風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)。有研究還發(fā)現(xiàn)，ctDNA突變的增加表示對治療有抵抗力或即將發(fā)生治療失敗[10]?？捎脕碓u估化療后患者的預(yù)后。但是ctDNA目前尚未建立這種方法的臨床效用，尚無證據(jù)表明基于ctDNA檢測的治療可改善預(yù)后。尚未確定測定在何種程度上可能具有假陽性檢驗(yàn)結(jié)果(技術(shù)和生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果)，需要大量的臨床實(shí)驗(yàn)來為結(jié)腸癌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層。

8 結(jié)語與展望

DNA甲基化異常是癌癥發(fā)展中的早期和頻繁事件。不同的癌癥患者可能具有不同的甲基化模式，但是每種癌癥類型中都有常見的DNA甲基化變化[25]。因組突變的重要性及其在結(jié)腸癌的發(fā)展和進(jìn)展中的演變使我們認(rèn)識到，如果要實(shí)現(xiàn)患者治療的真正個(gè)性化，理想情況下需要對原發(fā)和轉(zhuǎn)移的序列基因分型。結(jié)腸全段的連續(xù)活檢是不可行的，ctDNA似乎可代表腫瘤的負(fù)荷量。目前有證據(jù)支持ctDNA可用于發(fā)現(xiàn)早期疾病和治療切除后的微小殘留疾病、早期識別復(fù)發(fā)、評估治療反應(yīng)和闡明新出現(xiàn)的耐藥機(jī)制。越來越多的證據(jù)正確地激發(fā)了人們對進(jìn)一步研究ctDNA的熱情。ctDNA研究現(xiàn)在已經(jīng)通過精心設(shè)計(jì)的大型前瞻性試驗(yàn)得到了發(fā)展。ctDNA作為“液體活檢”技術(shù)，具有簡便易行、侵害性小、實(shí)時(shí)動態(tài)佳的優(yōu)勢，且隨著科技技術(shù)的發(fā)展，如PCR等檢測技術(shù)的提高實(shí)現(xiàn)了ctDNA監(jiān)測的敏感性，且大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明其敏感性高。根據(jù)ctDNA所提供的腫瘤相關(guān)信息，從而優(yōu)化治療方案，滿足個(gè)體化治療更加精準(zhǔn)的趨勢。Ⅱ期結(jié)腸癌術(shù)后是否輔助治療存在爭議，早期發(fā)現(xiàn)殘留病灶，準(zhǔn)確的預(yù)測和評估當(dāng)前是否需進(jìn)一步治療并且及時(shí)對治療方案進(jìn)行調(diào)整是關(guān)鍵。然而，在這個(gè)潛在的生物標(biāo)志物被應(yīng)用到我們的日常臨床實(shí)踐之前，仍有許多問題需要克服。ctDNA檢測儀器及費(fèi)用較高，并且對實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)人員要求較高，對操作流程要求嚴(yán)格，不同平臺之間的可比性較差，且已發(fā)表的ctDNA研究使用了不同的樣本處理方法，這使得不同研究之間的數(shù)據(jù)解釋和比較變得困難證據(jù)力度欠缺仍然是當(dāng)前很難攻克的難題，使得ctDNA檢測技術(shù)很難短時(shí)間內(nèi)在臨床診治中推行。因此亟需要大樣本、前瞻性的臨床研究來證實(shí)ctDNA檢測對結(jié)腸癌患者的臨床價(jià)值。目前大量的臨床實(shí)驗(yàn)正在招募，有望評估尋求實(shí)用靈敏的靶向標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌的精準(zhǔn)化、個(gè)體化治療。