中藥干預(yù)自噬治療缺血性腦卒中作用機制研究概述

張雪玉 蔡恩麗 褚 鑫 藏 瑞 李旭華 武煜明

云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650000

腦卒中又稱腦中風或腦血管意外，是全球首要致死和致殘病因。該病有出血性和缺血性之分，其中缺血性腦卒中約占比85%[1]。臨床一般采用經(jīng)靜脈重組組織纖溶酶原激活物 (rt-PA)溶栓治療或血管內(nèi)介入診療，有效的治療藥物還沒有獲得臨床證實，依然處于空白狀態(tài)。自噬是當細胞面臨低氧、炎癥、營養(yǎng)限制等應(yīng)激環(huán)境時，能根據(jù)胞內(nèi)不同環(huán)境和壓力下細胞器的數(shù)量及完整性，降解異常蛋白和受損細胞器去除不利于細胞存活的因素，并將降解所產(chǎn)生的物質(zhì)循環(huán)利用于細胞更新修復(fù)的一種生存機制。中藥通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)自噬并揭示了腦缺血損傷后細胞內(nèi)損傷及修復(fù)的機制，目前研究最多的是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及凋亡等通路。本文就傳統(tǒng)中藥干預(yù)自噬防治缺血性腦卒中的主要作用機制，進行如下概述。

1 中藥干預(yù)自噬對缺血性腦卒中的主要治療作用

1.1 減輕血腦屏障破壞 血管再通是缺血腦組織生存所必需的，但氧合血液突然流入缺血腦組織可能會破壞已經(jīng)受損的血管內(nèi)皮，加劇血腦屏障的破壞和通透性，過量液體和血漿蛋白外滲并停聚于周圍腦細胞間隙，引起血管源性腦水腫和血細胞外滲。研究證實，適度自噬可減輕缺血再灌注(CIR)引起的血腦屏障破壞。陶紅苗等[2]發(fā)現(xiàn)，CIR組神經(jīng)元損傷較重，自噬泡增多，而缺血后適應(yīng)組的適應(yīng)性調(diào)控可對自噬產(chǎn)生抑制作用，有效緩解神經(jīng)元損傷程度。三化湯具有宣行氣血、通腑開結(jié)的作用，可抑制血管源性水腫，促進神功能恢復(fù)，使血腦屏障免受缺血再灌注損傷[3-4]。藁本內(nèi)酯是當歸揮發(fā)油的有效成分，通過干擾細胞內(nèi)鈣離子代謝，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，減輕神經(jīng)功能損傷程度，改善腦水腫及血管通透性[5]。

1.2 減輕氧化應(yīng)激 當腦缺血及缺血再灌注時，驟然恢復(fù)血流和供氧導(dǎo)致代謝紊亂及興奮性中毒，活性氧(ROS)的產(chǎn)生與細胞抗氧化劑防御的內(nèi)源性清除能力失衡造成氧化應(yīng)激(OS)反應(yīng)，能促使神經(jīng)元功能喪失。研究證實，中藥干預(yù)自噬途徑可以改善OS，減少細胞毒性物質(zhì)的生成，降低腦組織損傷。朱麗娟等[6]在體外擬CIR模型，發(fā)現(xiàn)當歸揮發(fā)油可以提高抗氧化能力，促進自由基的清除，使細胞死亡率顯著降低。紅花注射液具有抗氧化活性，可以降低缺血腦組織血清中丙二醛(MDA)及提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，有效清除自由基進而達到抗氧化的作用[7]。復(fù)方制劑丹紅注射液對腦缺血缺氧損傷具有一定的保護作用，其保護作用可能與抑制胞內(nèi)ROS水平及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低缺氧對細胞膜的損傷[8]。

1.3 減輕炎癥反應(yīng) OS發(fā)生后，ROS還會通過神經(jīng)元，內(nèi)皮細胞觸發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和其他蛋白酶的釋放，進而侵蝕內(nèi)皮基底層，浸潤性白細胞又釋放多種促炎介質(zhì)，損傷血腦屏障，引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。炎癥與自噬在缺血性腦損傷中相互影響，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達水平，可以降低自噬性死亡。實驗發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以下調(diào)TNF-α和白細胞介素-6( IL-6) 等促炎癥細胞因子的表達，提示丹參酮ⅡA預(yù)處理可通過抑制炎癥減輕CIR損傷[9]。補陽還五湯通過下調(diào)患者血清中的IL-6、TNF-α等炎癥因子水平，抑制參與炎癥反應(yīng)的 MMP-2及 MMP-8水平，減輕缺血損傷[10-11]。抑制大鼠腦組織的內(nèi)皮素-1(ET-1)高度表達引起的局部炎癥反應(yīng)可能是鎮(zhèn)肝熄風湯發(fā)揮對腦梗死的防治作用的主要分子機制[12]。三化湯通過減少缺血腦組織中的 IL-1β，ICAM-1的表達，減少白細胞浸潤數(shù)量，減緩炎癥反應(yīng)，保護神經(jīng)元細胞[3-4]。阿魏酸是當歸揮發(fā)油中的有效成分，其發(fā)揮腦保護作用可能與抑制NF-κB的活化，下調(diào)TNF-α，IL-6等促炎癥因子的表達，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[13]。

2 中藥干預(yù)自噬治療缺血性腦卒中的主要作用機制

2.1 干預(yù)mTOR 信號介導(dǎo)的自噬 在缺血、缺氧等應(yīng)激條件下自噬可被激活，這主要與mTOR調(diào)控有關(guān)，mTOR包含m TORC1和mTORC2兩種復(fù)合體，其中m TORC1含特殊的mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白，是主要調(diào)節(jié)靶點，起負向調(diào)控自噬的作用。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的催化結(jié)構(gòu)域包含磷酸化位點，可調(diào)節(jié)mTOR 的活性。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)是 mTORC1和mTORC2 相互作用的連接點。張怡[14]證實黃芪甲苷通過介導(dǎo) AMPK/DDiT4/mTOR 信號通路激活自噬抑制CIR損傷。汪光云[15]建立CIR模型，加入PI3K的抑制劑后發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯能夠激活 PI3K/AKt/mTOR通路，抑制腦缺血損傷后的細胞自噬，繼而發(fā)揮神經(jīng)保護的作用。李丹丹[16]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可能通過誘導(dǎo)大腦局灶性CIR模型自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3和mTOR的表達水平，激活自噬誘導(dǎo)神經(jīng)元存活。沈浩[17]發(fā)現(xiàn)犀角地黃湯能促進Akt/mTOR信號通路，抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化，減少LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化及P62蛋白降解，下調(diào)半暗帶皮層組織的自噬水平，發(fā)揮缺血后腦組織保護作用。

2.2 干預(yù)MAPK信號介導(dǎo)的自噬 MAPK由P38激酶(p38 MAPK)，ERK，c-Jun氨基末端激酶(JNK) 構(gòu)成。MAPK信號通路介導(dǎo)了缺血性腦卒中自噬的分子過程，JNK和p38 MAPK正向調(diào)節(jié)自噬，ERK反之。p38 MAPK信號通路適度活化能促進神經(jīng)元抗炎、抗凋亡等作用，提高神經(jīng)元存活率。反之，過度誘導(dǎo)則會促進靶基因表達激活轉(zhuǎn)錄因子和胱冬蛋白酶等，加速神經(jīng)元損傷。Wang[18]等發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯組抑制mTOR的活化，從而誘導(dǎo)自噬與調(diào)節(jié)MAPK信號通路有關(guān)，通過激活ERK、抑制 JNK和p38 MAPK信號介導(dǎo)保護性自噬。賈冬雪[19]發(fā)現(xiàn)葒草苷對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用機制與葒草苷調(diào)控JNK/ERK通路，抑制自噬水平相關(guān)。預(yù)給藥腦缺血大鼠補陽還五湯后，Akt 蛋白和 p38 MAPK蛋白磷酸化水平明顯降低，其機制可能與激活MAPK/ERK信號通路，促進神經(jīng)元細胞再生有關(guān)[10-11]。

2.3 干預(yù)自噬效應(yīng)蛋白 自噬過程需要自噬相關(guān)基因(Atg)的參與，其中自噬特征蛋白 Beclin-1和自噬體膜上標志蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)及自噬底物募集蛋白P62是參與自噬的三個關(guān)鍵蛋白。黃亞光[20]發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷能改善腦缺血再灌注后大鼠的神經(jīng)功能，顯著減小腦梗死體積，且通過電鏡發(fā)現(xiàn)自噬小體減少，同時Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷抑制LC3Ⅱ和提高P62的表達，推測竹節(jié)參總皂苷可能通過抑制自噬的過度激活，從而緩解腦缺血再灌注損傷的發(fā)展。Zheng等[21]發(fā)現(xiàn)銀杏總內(nèi)酯可以抑制缺血再灌注引起的Bec-lin-1表達上調(diào)。另外，蘭新新等[22]在腦缺血再灌注損傷治療作用的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)銀杏總內(nèi)酯抑制大鼠缺血復(fù)灌24、72 h的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)自噬底物 P62表達，推測銀杏總內(nèi)酯通過抑制缺血引起的自噬水平過度升高，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

2.4 干預(yù)凋亡相關(guān)蛋白 一些凋亡相關(guān)蛋白可通過調(diào)節(jié)自噬治療卒中，如半胱氨酸蛋白酶(Caspase)，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2) 家族基因，Bcl-2 家族包括抑凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax。Caspase 是執(zhí)行細胞凋亡程序并調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的一種半胱氨酸蛋白酶，尤以caspase-3在缺血介導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡早期最為關(guān)鍵。caspase和Bcl-2可以裂解自噬相關(guān)蛋白，抑制凋亡能加速自噬的啟動。鄒玲[23]發(fā)現(xiàn)龍蛭湯組腦組織中Bcl-2蛋白陽性細胞率均明顯升高，Caspase-3陽性細胞則明顯減少，推測龍蛭湯能減輕CIR大鼠神經(jīng)元損傷可能與調(diào)控Bcl-2和Caspase-3的表達有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)菟絲子黃酮[24]、銀杏內(nèi)酯[25]、川芎嗪[26]及血府逐瘀湯[27]對腦缺血大鼠都具有神經(jīng)保護作用，一定程度上可減少大鼠神經(jīng)細胞凋亡，主要與抑制Bax /Bcl-2和Caspase-3凋亡途徑有關(guān)。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，應(yīng)用中藥干預(yù)自噬治療腦缺血在大量動物實驗研究中已證實。中藥類單體和復(fù)方主要通過調(diào)控mTOR、MAPK及凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)自噬，并對腦缺血后腦保護(梗死面積與神經(jīng)功能評分及血腦屏障完整性)，抗氧化及炎癥等并發(fā)癥，阻斷血管再通引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)方面具有顯著神經(jīng)保護作用。近期人們把研究目光聚焦于溶栓療法與中藥神經(jīng)保護制劑聯(lián)用對抗缺血后腦組織神經(jīng)保護研究方面，并發(fā)現(xiàn)預(yù)后優(yōu)于單用rt-PA，對緩解溶栓后缺血再灌注損傷具有一定的啟示作用。另一方面由于中藥成分復(fù)雜，作用靶點難以明確，如何在保留中醫(yī)整體觀念前提下，尋找中藥治療腦缺血主要作用及干預(yù)機制，值得進一步探索。本課題組下一步將從體內(nèi)和體外兩個角度對中藥干預(yù)缺血性腦卒中自噬的具體機制進行深入研究。