干細(xì)胞治療肺損傷的機(jī)遇與挑戰(zhàn)*

張智慧,李想,黎昱江,吳云飛,吳旭

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院惠僑醫(yī)療中心胸外科(廣東廣州 510515)

呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率和病死率的上升已成為全球性的公共問(wèn)題之一。呼吸系統(tǒng)持續(xù)暴露在各種各樣的刺激物中，比如有毒氣體、碳顆粒、病原體及其產(chǎn)物，急性或慢性的肺疾病主要由創(chuàng)傷、空氣污染、吸煙以及不同的致病病原體引起，肺泡上皮細(xì)胞和肺內(nèi)免疫細(xì)胞之間相互作用維持了肺內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并且這些細(xì)胞不斷地監(jiān)測(cè)肺內(nèi)微環(huán)境，誘導(dǎo)對(duì)無(wú)害的吸入顆粒的耐受，提供有效的免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗入侵的微生物。一旦肺內(nèi)微環(huán)境被破壞，將會(huì)多多少少引起肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)被認(rèn)為是最嚴(yán)重的急性肺損傷疾病，它能引起頑固且致命性的低氧血癥，雙側(cè)胸片肺部實(shí)變。相關(guān)的研究表明炎癥免疫失調(diào)、失控的凝血途徑激活和肺泡上皮及毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷引起的通透性增加共同發(fā)揮了重要作用。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的支持治療有很大的進(jìn)步，但是此病的病死率仍然高達(dá)30%～40%[1]。慢性肺損傷代表的疾病有特發(fā)性肺纖維化(IPF)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。在急性或慢性肺組織損傷后，呼吸道上皮的修復(fù)靠上皮細(xì)胞、肺免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)和異常的修復(fù)過(guò)程會(huì)對(duì)肺組織造成不可逆的損害，通常會(huì)導(dǎo)致肺纖維化，隨后肺功能下降。吸入性糖皮質(zhì)激素對(duì)炎癥性肺部疾病患者非常有效[2]，但它們的長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)增加肺炎、口腔念珠菌病、骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、皮膚瘀傷和肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，我們急需新的方法來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，防止纖維結(jié)締組織的堆積，同時(shí)促進(jìn)受損肺泡上皮細(xì)胞的再生。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)由于具有抑制肺泡有害免疫和向Ⅱ型肺泡上皮分化的能力，因此可以用來(lái)作為治療急慢性肺損傷疾病的一種手段。它可以從許多組織比如骨髓、脂肪組織、羊水、胎盤(pán)、臍帶、外周血、肺、牙髓中獲得[4]，因此，在這篇文章中，我們總結(jié)了MSCs在治療肺部疾病方面的作用及未來(lái)的發(fā)展前景。

1 MSCs及其衍生物的治療機(jī)制

MSCs具有以下幾個(gè)特點(diǎn)[4-6]：(1)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下具有黏附性；(2)具有以下標(biāo)記物CD105、CD73、CD90，缺少CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19和HLA-DR的標(biāo)記物；(3)在體外具有能夠分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞的潛能。MSCs能夠調(diào)節(jié)增殖、活化免疫細(xì)胞，這些細(xì)胞包括抗原提呈細(xì)胞(樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)、中性粒細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。他們?cè)诜螕p傷疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，MSCs能使Th1、Th2和Th17細(xì)胞失活，同時(shí)MSCs與抑制分子PD-1及其配體PD-L1和PD-L2共同抑制了T細(xì)胞的增殖[7]。MSCs可使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1上調(diào)和細(xì)胞周期蛋白D2的抑制。通過(guò)這種方式，移植的MSCs可以顯著減少受損肺中效應(yīng)T細(xì)胞的總數(shù)，并減弱Th1、Th2或Th17驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)。MSCs可以通過(guò)分泌可溶性的免疫分子前列腺素2(PGE2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、吲哚2-3雙加氧酶(IDO)和一氧化氮(NO)來(lái)抑制持續(xù)性T細(xì)胞依賴的炎癥反應(yīng)[8]。有不同損傷和炎癥刺激的MSCs比如脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、γ干擾素(IFN-γ)以及ARDS的血清能夠引導(dǎo)多種抗炎因子的釋放[9-10],MSCs功能的另一個(gè)引人注目的方面在于其內(nèi)在的抗菌特性，這已在體外和小動(dòng)物模型中得到證實(shí)，MSCs對(duì)細(xì)菌的直接清除已被證明是通過(guò)Toll樣受體介導(dǎo)的，MSCs分化為受損的肺泡細(xì)胞來(lái)修復(fù)細(xì)胞還能改變巨噬細(xì)胞向M2表型發(fā)展進(jìn)一步提高吞噬細(xì)菌的能力[11]。,有關(guān)研究表明MSCs具有抗細(xì)胞凋亡作用，這種抗凋亡作用不是單一的，而是通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及通過(guò)抗凋亡基因上調(diào)或凋亡基因下調(diào)、線粒體和微囊泡轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)[5,12]。

近年來(lái)研究表明MSCs也可通過(guò)分泌可溶性的因子和胞外囊泡(EVs)來(lái)發(fā)揮治療作用，可溶性因子包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和血管生成因子等[13]，胞外囊泡根據(jù)其細(xì)胞來(lái)源、分泌機(jī)制、大小和表面標(biāo)記，EVs主要分為3類:(1)外泌體;(2)微囊泡;(3)凋亡小體。外泌體大小約40～100 nm，富含 CD63、CD9、CD81和腫瘤易感基因(Tsg 101)。這些外泌體還富含網(wǎng)格蛋白、膜聯(lián)蛋白和熱休克蛋白，細(xì)胞骨架的激活需要他們的釋放。微囊泡大小80～1 000 nm，由磷脂雙層膜包圍的納米結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)內(nèi)在因子的生物活性。具有CD40配體，它們的釋放依賴于細(xì)胞骨架的激活和鈣內(nèi)流。凋亡小體來(lái)源于凋亡細(xì)胞的破裂，大小約1 000～5 000 nm，富含磷脂酰絲氨酸、豐富的細(xì)胞核和細(xì)胞器[14-16]。

大多數(shù)真核生物和原核生物已被證明可分泌異源性EVs，在血漿、尿液、腦脊液、牛奶以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中均可檢測(cè)到這些囊泡的存在[14]，相關(guān)文獻(xiàn)證明[15-16]有B淋巴細(xì)胞分泌的EVs可以在體外誘導(dǎo)抗原特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。關(guān)于EVs的綜合研究表明這些物質(zhì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境后，可通過(guò)配體-受體相互作用或通過(guò)內(nèi)吞作用、吞噬作用和直接膜融合與受體細(xì)胞相互作用，嵌入在脂質(zhì)雙鏈分子中的幾種膜分子促進(jìn)了EVs對(duì)特定細(xì)胞或組織的靶向傳遞，他們通過(guò)將含有多種介質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)[17]。

到目前為止，微囊泡(MSC-MC)能夠像MSCs一樣有效地顯著降低肺損傷的嚴(yán)重程度，這已經(jīng)在一些體外和體內(nèi)的臨床前動(dòng)物模型中得到了證實(shí)[18]。Roura等[19]證明了微囊泡抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，恢復(fù)了細(xì)胞膜黏附分子的正常狀態(tài)，同時(shí)還能誘導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，提示微囊泡可通過(guò)保護(hù)血管屏障的完整性，防止炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而調(diào)節(jié)受損內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Park等[16]認(rèn)為MSCs和MSC微囊兩種治療方法都能改善了肺內(nèi)皮屏障的完整性和肺泡液的輸送速度，認(rèn)為角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)在肺泡液的運(yùn)輸中起了關(guān)鍵作用，經(jīng)過(guò)利用KGF干擾RNA預(yù)處理MSCs能夠降低微囊泡的肺泡液清除率，相反加入重組的KGF能夠恢復(fù)清除率。Ionescu等[20]的研究表明，氣管內(nèi)給予MSCs或微囊泡可減少內(nèi)毒素誘導(dǎo)ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中浸潤(rùn)的新中性粒細(xì)胞總數(shù)。值得注意的是，給予成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞微囊泡并沒(méi)有產(chǎn)生同樣的效果，因此顯示了MSC的特異性。Shen等[21]在博萊霉素誘導(dǎo)的慢性肺損傷模型中檢微囊泡的抗凋亡和抗纖維化作用。組織學(xué)分析微囊泡處理的大鼠損傷后28 d肺纖維化和細(xì)胞凋亡明顯減少。微囊泡在體外能夠促進(jìn)人非小細(xì)胞肺癌上皮細(xì)胞的增殖和防止細(xì)胞凋亡。一系列的研究表明[22-24]來(lái)自MSC的微囊泡能夠明顯降低細(xì)胞死亡率和炎癥反應(yīng)，同時(shí)能夠提高改善各種肺損傷模型的組織愈合和內(nèi)源性再生。然而，關(guān)鍵的介質(zhì)和誘導(dǎo)產(chǎn)生最佳效果的的最佳條件仍然是未知的。

2 MSCs治療呼吸系統(tǒng)疾病研究現(xiàn)狀

2.1 MSCs治療ARDS和肺炎 最近研究表明[25-26]MSCs及其衍生物能夠作為治療ARDS及肺炎的新的方向，MSCs在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠模型能明顯改善肺泡損傷和炎癥反應(yīng)，此外，通過(guò)KGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的產(chǎn)生，MSCs促進(jìn)了肺泡Ⅱ型細(xì)胞再生，阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了ARDS損傷肺的肺泡-上皮屏障的修復(fù)[27]。MSCs通過(guò)增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎IL-10的能力來(lái)保護(hù)膿毒癥相關(guān)的ARDS[28]。除了再生和免疫抑制作用外，MSCs還能通過(guò)產(chǎn)生促分解介質(zhì)脂素A4 (LXA4)來(lái)促進(jìn)炎癥的消退，從而減輕肺水腫，提高LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠的存活率[16]。肺泡巨噬細(xì)胞在細(xì)菌性肺炎的清除和衰減中起著至關(guān)重要的作用。而細(xì)菌性肺炎是全世界最常見(jiàn)的感染死亡原因，最近有研究發(fā)現(xiàn)[24,29]，MSCs產(chǎn)生微泡，促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而減輕革蘭陰性大腸桿菌引起的細(xì)菌性肺炎，而且MSCs產(chǎn)生抗菌蛋白，能夠直接抑制肺部的細(xì)菌生長(zhǎng)。氣管內(nèi)注射MSCs可顯著減輕肺損傷和炎癥反應(yīng)，并通過(guò)以脂質(zhì)-2依賴的方式促進(jìn)細(xì)菌清除，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌性肺炎的存活率，LPS誘導(dǎo)的MSCs中TLR-4的激活增強(qiáng)了脂鈣素-2的分泌，而脂鈣素-2可以結(jié)合細(xì)菌的鐵載體，減少鐵的吸收，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[30]。Wilson等[31]在臨床試驗(yàn)中(NCT01775774)驗(yàn)證了骨髓MSCs的治療ARDS的潛力，9名異體骨髓MSCs移植的患者均未觀察到不良反應(yīng)或劑量毒性。大規(guī)模多中心的臨床試驗(yàn) (NCT02097641)招募了60例成年ARDS患者，他們通過(guò)靜脈接受單劑量的同種異體血BM-MSCs,目前結(jié)果尚未發(fā)表。

2.2 MSCs治療哮喘的現(xiàn)狀 哮喘的慢性氣道炎癥可導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的氣流阻塞和支氣管高反應(yīng)性[32]，這可能導(dǎo)致永久性的結(jié)構(gòu)改變。MSCs可抑制CD4介導(dǎo)Th2細(xì)胞的增殖及血漿中IgE的產(chǎn)生，一些科學(xué)家已經(jīng)證明了MSCs能夠減輕氣道炎癥和重塑，改善哮喘動(dòng)物的肺功能，通過(guò)靜脈注射MSCs減少了肺中嗜酸性細(xì)胞的浸潤(rùn)和黏液的產(chǎn)生，并降低了Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的水平，因此在經(jīng)MSCs處理的哮喘小鼠可以明顯觀察到IL-4、IL-5和Il-13生成Th2細(xì)胞的數(shù)量減少，血清IgE水平下降，肺浸潤(rùn)嗜酸細(xì)胞數(shù)量減少，黏液分泌減少[32-34]。Hall等[33]用小鼠MSCs預(yù)處理哮喘小鼠可增加肺中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，而當(dāng)淋巴細(xì)胞已經(jīng)被過(guò)敏原誘導(dǎo)時(shí)，MSC不能誘導(dǎo)Treg的擴(kuò)增，這說(shuō)明Treg沒(méi)有參與到治療哮喘的關(guān)鍵作用中，相反，Du等[35]研究發(fā)現(xiàn)人來(lái)源的MSCs改善哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性和炎癥主要是通過(guò)增加肺中產(chǎn)生IL-10 Treg的總數(shù)量，然后減少肺中浸潤(rùn)的Th17細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，因此不同來(lái)源的MSCs對(duì)免疫細(xì)胞有不同的作用。PI3K和Notch信號(hào)通路被認(rèn)為是哮喘肺MSCs的主要分子靶點(diǎn)，MSCs通過(guò)阻止Akt磷酸化的表達(dá)影響PI3K信號(hào)通路，從而抑制哮喘大鼠的肺部炎癥和氣道重塑，在經(jīng)MSCs處理的哮喘大鼠的肺組織中發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌減少，說(shuō)明MSCs通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)抑制哮喘癥狀[36-37]。關(guān)于MSCs治療哮喘的臨床試驗(yàn)(NCT03137199)以及MSCs衍生物治療哮喘的臨床試驗(yàn)(NCT02192736)都正在研究中。

2.3 MSCs在細(xì)胞基礎(chǔ)上應(yīng)用于治療COPD 肺浸潤(rùn)免疫細(xì)胞功能的改變、氧化應(yīng)激和蛋白酶及其抑制因子活性的失衡是COPD患者主要病理改變的原因[38]，由于MSCs具有抑制有害免疫反應(yīng)、維持氧化平衡和調(diào)節(jié)基質(zhì)降解酶活性的能力，MSCs被認(rèn)為是COPD細(xì)胞基礎(chǔ)治療的潛在方法。MSCs移植可顯著減輕肺泡損傷和肺泡數(shù)目的減少，減少肺氣腫的影響。在經(jīng)MSCs處理的COPD動(dòng)物模型中，肺功能[通過(guò)肺活量(VC)、100 ms用力呼氣容積(FEV100)、動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)和平均用力呼氣流量]在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異，組織學(xué)結(jié)果和肺功能的改善伴隨著肺泡間隔、支氣管周和血管周圍間質(zhì)炎癥細(xì)胞的減少[39]。在肺浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中，MSCs在COPD動(dòng)物中的主要細(xì)胞靶向?yàn)榫奘审w，MSCs以旁分泌的方式分泌IL-10、TGF-β和HGF抑制肺泡巨噬細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2 (COX-2)的表達(dá)和PGE2的產(chǎn)生[40]，在炎性M1巨噬細(xì)胞中，MSCs介導(dǎo)的COX2/PGE 2通路的下調(diào)通過(guò)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)發(fā)生，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型極化[6,41-42]。MSCs明顯改善COPD患者的肺結(jié)構(gòu)通過(guò)減少巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-12介導(dǎo)降解肺實(shí)質(zhì)中彈力蛋白結(jié)締組織纖維的分布引起組織重塑?；贛SCs治療COPD的臨床試驗(yàn)[43](NCT00683722)，62位COPD患者被隨機(jī)分組并靜脈注射MSCs，COPD患者接受骨髓MSCs治療時(shí)，未觀察到嚴(yán)重不良事件、COPD加重頻率增加或病情惡化，這說(shuō)明系統(tǒng)應(yīng)用異體骨髓MSCs是安全的，雖然COPD治療組血清C-反應(yīng)蛋白水平下降明顯，COPD治療至少有可能抑制炎癥反應(yīng)，但肺功能測(cè)試和生活質(zhì)量指標(biāo)在COPD治療組和未治療組之間沒(méi)有顯著差異，可能由于MSCs治療的濃度及劑量目前尚未取得明顯進(jìn)展。

2.4 MSCs在細(xì)胞基礎(chǔ)上應(yīng)用于治療特發(fā)性肺纖維化(IP) 反復(fù)性肺損傷、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡增多、上皮-間質(zhì)相互作用異常、凝血功能改變與成纖維細(xì)胞增殖增強(qiáng)相關(guān)的有害免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積是IPF患者的主要病理改變[44]。MSCs在體外可分化為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，抑制降解酶的產(chǎn)生，抑制肺浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中促纖維化因子的分泌[44-45]，因此治療IPS有一定潛力。移植MSCs防止博來(lái)霉素導(dǎo)致的肺損傷和纖維化，減毒肺部炎癥，減少肺水腫，減少膠原蛋白沉積，從而提升小鼠的成活率[46]。Mansouri等[47]在MSCs衍生的外泌體中也證明了其可減輕纖維化，恢復(fù)肺功能，增強(qiáng)內(nèi)源性肺修復(fù)。一項(xiàng)單中心非隨機(jī)化臨床研究[48](NCT01385644)在澳大利亞完成了，遺憾的是MSCs治療的IPF在隨訪6個(gè)月后與對(duì)照組的IPF相比，肺功能改變上沒(méi)有顯著差異，但是在安全性上面至少證明了氣管內(nèi)移植MSCs的安全性。

3 MSCs臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)

(1)MSCs的最佳數(shù)目應(yīng)加以明確，以便在其有益作用和因免疫抑制而可能產(chǎn)生的不良影響之間找到適當(dāng)?shù)钠胶鈁49]。(2)MSCs移植的局部微環(huán)境中存在著誘導(dǎo)移植的骨髓MSCs向腫瘤發(fā)展的可能性，(3)MSCs能夠分泌多種促血管生成因子(VEGF、HGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管生成素-1、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子)，因此需要對(duì)MSCs治療患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪和觀察，以明確可能帶來(lái)的潛在性疾病[50]。(4)不同捐獻(xiàn)者、 不同批次的 MSCs 存在差異，致使這些干細(xì)胞在有效性、安全性方面不盡相同，隨之的治療效果也不盡相同，因此還需要更深入的研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

大量臨床研究表明，MSCs可抑制肺內(nèi)有害的免疫反應(yīng)，并能分化為肺泡上皮細(xì)胞參與修復(fù)，其衍生物如微囊泡或外泌體也能通過(guò)釋放因子參與到抗炎、抗纖維化中，從而降低ARDS、急性肺損傷、哮喘、COPD、IPF對(duì)肺造成的傷害。雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了一定的進(jìn)展，但是在臨床試驗(yàn)方面還需要更多的投入及研究。干細(xì)胞外泌體具有更低的免疫原性、易保存、不致瘤，并具有抗纖維化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等功能。在肺損傷疾病的治療中目前也越來(lái)越占有重要的地位。MSCs可能在細(xì)胞類型中出現(xiàn)異常分化，并可能以內(nèi)分泌的方式促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，未來(lái)的研究必須集中在解決這些問(wèn)題上，隨著科技發(fā)展，這些問(wèn)題相信會(huì)依次解決，MSCs及其衍生物在未來(lái)的治療上肯定有廣闊前景。