哮喘相關生物標記物的研究進展*

徐敏,胡田勇,邱書奇,程保輝

深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院耳鼻咽喉科、深圳市耳鼻咽喉研究所(廣東深圳 518116)

近幾十年來，隨著哮喘患病率的逐年增加，針對哮喘的研究也深入到免疫病理和表型異質(zhì)性等各方面，為結合臨床達到準確診療的目的，我們需要對人、病、藥進行精準認識并進行精確治療[1]。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的研究報告，精準醫(yī)療是一種新興的疾病治療和預防措施，考慮到個體在基因、環(huán)境和生活方式上的差異，其實施需要統(tǒng)一的可測量指標，即生物標記物。機體內(nèi)生物標記物形式各樣，包括疾病病理生理過程中涉及的蛋白質(zhì)、脂類、核酸、機體代謝物等[2-3]。根據(jù)之前的研究報道，我們已經(jīng)了解到幾種哮喘的標記物[如IgE、嗜酸性粒細胞、呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)]，但它們在診斷、治療和預后中的應用仍存在爭議。生物標記物不僅可從分子水平探討發(fā)病機制，而且在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優(yōu)勢，可提供早期預警，很大程度上為臨床醫(yī)生提供了輔助診斷的依據(jù)。因此，本文將針對哮喘的生物標記物在哮喘診斷、藥物治療、病情預后方面的研究進展作一綜述。

1 外周血細胞類

哮喘患者的外周血嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)量變化與患者的臨床表現(xiàn)有關。Nadif等[4]根據(jù)哮喘患者外周循環(huán)中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞計數(shù)，定義了4種哮喘炎癥模式，包括嗜酸性粒細胞型、中性粒細胞型、無典型炎癥細胞型和混合細胞型，不同的炎癥模式顯示了哮喘表型特征之間的顯著差異，例如，嗜酸性粒細胞增多與哮喘癥狀頻發(fā)相對應，中性粒細胞增多伴隨著痰液的產(chǎn)生增多，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞均增多的患者夜間癥狀更嚴重[5]。在哮喘患者中，有吸煙史和持續(xù)氣流受限的患者中性粒細胞增多比不吸煙的患者更顯著，Tommola等[6]對188例成人哮喘患者持續(xù)隨訪12年，隨后進行再次評估發(fā)現(xiàn)，哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊綜合征患者(asthma COPD overlap syndrome,ACOS)相對于無吸煙史的單純哮喘患者肺擴張能力減弱、血中性粒細胞水平升高更明顯(4.5×109·L-1vs3.6×109·L-1)、血IL-6水平增加(2.88 pg/mLvs1.52 pg/mL)。

外周血細胞計數(shù)也可作為氣道炎癥的替代標記物。支氣管肺泡灌洗和支氣管內(nèi)活檢是鑒別氣道炎癥類型及程度的參考標準，但這些檢查具有侵入性、且費用昂貴，不利于作為哮喘患者的常規(guī)檢查，臨床診斷需要一種患者更易接受的快捷、非侵入性方法[7]。一項關于哮喘氣道嗜酸性粒細胞增多癥微創(chuàng)標記物研究的Meta分析結果顯示，血嗜酸性粒細胞有預測氣道嗜酸性粒細胞增多的能力，評估指標ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.78，提示結果有一定的準確性[8]。外周血Ⅱ型固有淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2)計數(shù)在預測痰嗜酸性粒細胞增多方面也有類似的作用，Liu等[9]收集150例哮喘患者痰液以檢測痰液中嗜酸性粒細胞數(shù)量，同時測定外周血淋巴細胞ILC2的比例、血嗜酸性粒細胞計數(shù)、總免疫球蛋白E(IgE)、FeNO濃度，結果經(jīng)ROC分析顯示，與氣道嗜酸性粒細胞炎癥關系最密切的因素為ILC2比例，其預測的敏感度為67.7%，特異度為95.3%，因此，ILC2可作為哮喘患者氣道嗜酸性粒細胞炎癥的替代標記物。然而，血中性粒細胞增多并不能代表痰中性粒細胞增多；Hastie等[10]對328名重度哮喘受試者進行血液、痰細胞、肺功能、FeNO和IgE檢測，ROC曲線分析得出血中性粒細胞預測痰中性粒細胞的AUC值約為0.4，準確性較低。

一項初步研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者與健康人群的外周血微小RNA(microRNA，miRNA)譜存在差異。Milger等[11]通過基因轉化的方法，證明了血漿miRNA在哮喘患者中的表達與健康人相比存在差異，其數(shù)量變化與臨床特征相關。miRNA參與哮喘發(fā)病機制的各個環(huán)節(jié)，在促炎和抗炎方面均有作用，可通過抑制IL-6、IL-8導致免疫功能紊亂，Let-7 miRNA調(diào)控IL-13，miRNA-155激活免疫細胞調(diào)控CD4+T細胞等，作用貫穿哮喘發(fā)病的全過程。miRNA具有高度的保守性和極強的穩(wěn)定性，因此，血漿中的miRNA可被用作哮喘診斷性的生物標記物[12]。

血嗜酸性粒細胞計數(shù)對Th2型炎癥的治療有反應。對于抗IgE單克隆抗體奧馬珠單抗的治療，血嗜酸性粒細胞增多(≥300·μL-1)是對其反應良好的預測因子。Casale等[13]收集1 071例成人及青少年哮喘患者，在16周吸入糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroid，ICS)治療的基礎上隨機抽取542例給予奧馬珠單抗治療，529例給予安慰劑連續(xù)治療12周。期間分別記錄血嗜酸性粒細胞≥200·μL-1、≥300·μL-1和≥400·μL-1患者的急性發(fā)作情況，結果顯示隨著血嗜酸性粒細胞計數(shù)的增加，奧馬珠單抗的療效越顯著，急性發(fā)作緩解率增加，這表明奧馬珠單抗的療效在較高的血嗜酸性粒細胞水平下效果更好?？笽L-5單克隆抗體美泊利單抗與奧馬珠單抗作用相似，對于高水平血嗜酸性粒細胞患者療效更好[14-15]。

血嗜酸性粒細胞增多也可以監(jiān)測和預測糖皮質(zhì)激素治療的效果。Fitzpatrick等[16]通過觀察年齡在12～59個月、不同血嗜酸性粒細胞計數(shù)的兒童進行ICS治療的反應，發(fā)現(xiàn)血嗜酸性粒細胞增多≥300·μL-1的患兒對ICS的反應性更好。而在服用口服糖皮質(zhì)激素(oral corticosteroid，OCS)時控制血嗜酸性粒細胞在<200·μL-1的范圍有助于預防哮喘急性發(fā)作、改善病情[17]，血嗜酸性粒細胞增多是患者氣道受阻的危險因素，高血嗜酸性粒細胞與哮喘控制不良和病情惡化有關。Konradsen等[18]為評估持續(xù)性哮喘兒童的氣道炎癥情況收集96名不同表型的持續(xù)性哮喘學齡期兒童進行檢測，比較高、低水平血嗜酸性粒細胞的兒童時，發(fā)現(xiàn)高水平的嗜酸性粒細胞與哮喘的嚴重程度、急性加重、FEV1/FVC和氣道高反應性有顯著的相關性，高水平血嗜酸性粒細胞的患兒哮喘發(fā)病率更高。Price等[19]將343 927例12～80歲的哮喘患者根據(jù)最初血嗜酸性粒細胞計數(shù)分為兩組(血嗜酸性粒細胞>400·μL-1、≤400·μL-1)，并進行了連續(xù)兩年的追蹤觀察，各項檢測結果發(fā)現(xiàn)與血嗜酸性粒細胞≤400·μL-1的患者相比，高血嗜酸性粒細胞水平的患者急性發(fā)作的概率更大，急性發(fā)作的程度明顯更嚴重，病情穩(wěn)定性較差。另外，血中性粒細胞增多與哮喘氣道感染、肺功能下降、癥狀控制不良和病情加重也具有一定聯(lián)系[20-21]。

2 血清炎性介質(zhì)類

血清中炎癥介質(zhì)與哮喘患者的氣道炎癥情況具有相關性。哮喘患者和健康人血清中幾丁質(zhì)酶樣蛋白YKL-40存在明顯差異。James等[22]收集了61例輕中度哮喘患者、76例重度哮喘患者與48例健康成人，通過ELISA法檢測血清中YKL-40，健康成人、輕中度患者與重度患者血清中YKL-40濃度分別為23.0 ng/mL、33.3 ng/mL、43.3 ng/mL，提示哮喘患者血清中的YKL-40水平升高，升高趨勢與疾病嚴重程度呈正相關。

哮喘患者血清骨膜蛋白水平與氣道嗜酸性粒細胞計數(shù)呈正相關。骨膜蛋白在IL-4和IL-13的作用下表達上調(diào)并由氣道上皮細胞釋放并作用于嗜酸性粒細胞，促進后者在上皮下基膜中的黏附和運動，在嗜酸性粒細胞的遷移和運動過程中起著向?qū)ё饔?，而骨膜蛋白升高可通過規(guī)范的糖皮質(zhì)激素治療抑制[23]。Simpson等[24]收集83例經(jīng)臨床評估診斷為哮喘控制不良的成人患者痰液樣本和血液樣本，其中37例為嗜酸性粒細胞性哮喘，用免疫分析法檢測血清中骨膜蛋白濃度，結果發(fā)現(xiàn)血清中骨膜蛋白水平與痰液中嗜酸性粒細胞比例顯著相關，AUC值為0.829，但其數(shù)量變化與哮喘癥狀控制良好與否無關。與非嗜酸性粒細胞性哮喘相比，嗜酸性粒細胞性哮喘患者的血清和痰液中骨膜蛋白均明顯增高[25]。

血清超敏C反應蛋白(hypersensitive c-reactive protein，hs-CRP)數(shù)量與痰液中嗜酸性粒細胞計數(shù)增多有關。hs-CRP在血清中較為穩(wěn)定，在機體受到損傷后(病毒感染除外)由IL-6和TNF-α刺激產(chǎn)生，并且不受性別、年齡、妊娠、貧血等因素影響。張曉婷等[26]收集30例哮喘急性發(fā)作患者與14例健康成人進行實驗，測量其血清hs-CRP和誘導痰白細胞分類計數(shù)，結果顯示哮喘組血清hs-CRP與誘導痰嗜酸性粒細胞百分比呈正相關(r值為0.849)，血清hs-CRP相對于嗜酸性粒細胞百分比鑒別是否發(fā)生哮喘的敏感度及特異度略低(AUC值分別為0.713、0.794)。

尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)對診斷哮喘也有一定輔助作用。uPAR基因被認為是哮喘患者的敏感基因，該基因的多態(tài)性與肺功能有關。在哮喘患者和COPD患者中，可溶性裂解uPAR(soluble cleaved form of uPAR，scuPAR)被認為是一種預示疾病發(fā)病率和死亡率增加的標記物[27]。Portelli等[28]收集27例哮喘患者和9例健康成人，進行支氣管活檢并通過免疫組化法檢測組織中uPAR濃度，另外通過ELISA法檢測129例哮喘患者和39例健康成人血清scuPAR水平。兩個研究分別發(fā)現(xiàn)在哮喘患者支氣管組織固有層、支氣管上皮和氣道平滑肌細胞的炎癥細胞中uPAR水平升高，但升高趨勢與疾病嚴重程度或哮喘臨床特征無相關性；哮喘患者血清中的scuPAR水平是正常組的1.5倍，并發(fā)現(xiàn)高水平的uPAR與嚴重的非遺傳性過敏疾病之間存在關聯(lián)，但其關聯(lián)程度仍需要在以后的研究中進行深入探索。

高水平的血清骨膜蛋白可以預測對奧馬珠單抗治療的良好反應性。Tajiri等[29]收集了30名接受奧馬珠單抗治療至少1年的患者，其中27名治療時間為2年，通過對比發(fā)現(xiàn)在治療的第一年，最初血清骨膜蛋白水平和血嗜酸性粒細胞計數(shù)高的患者病情沒有明顯加重，而相對水平低的患者病情仍有不同程度的加重。在治療16～32周后，游離血清IgE計數(shù)明顯降低，同時患者急性發(fā)作的次數(shù)逐漸減少。

反復性氣道炎癥和炎癥引起的氣道結構重塑是長期哮喘的特征性表現(xiàn)，其可通過血清炎性介質(zhì)進行檢測。血清骨膜蛋白水平與氣道炎癥和氣道重塑有密切聯(lián)系，Takahashi等[30]收集235名病情控制良好的成人患者，對其進行血嗜酸性粒細胞、肺功能、FeNO和血清骨膜蛋白分析，結果顯示哮喘患者的血嗜酸性粒細胞計數(shù)和血清骨膜蛋白水平均與FeNO水平升高有關，血清骨膜蛋白水平與FEV1/FVC比值(FEV1/FVC比值<70%)的關系較FeNO水平、血嗜酸性粒細胞計數(shù)和總IgE水平有更密切相關性。通過多因素分析顯示氣道高反應性、氣流受阻與高血清骨膜蛋白水平(≥97 ng/mL)顯著相關(比值比為3.2)。研究已證實血清骨膜蛋白在疾病進展過程中穩(wěn)定性良好，可作為生物標記物應用于哮喘的長期監(jiān)測[31]。血清總IgE計數(shù)與氣道高反應性和支氣管壁增厚有關[18]，梁彩艷[32]通過輕、中度哮喘患兒與緩解期患兒進行對比發(fā)現(xiàn)氣道高反應性與IgE呈高度相關性。血清YKL-40與哮喘氣道受阻及病情急性加重密切相關，可作為預示哮喘加重的生物標記物[33]。另外，YKL-40水平與支氣管壁增厚有關，Konradsen等[34]收集了嚴重哮喘且藥物耐受患兒34例，藥物控制良好患兒39例，健康兒童27例，通過調(diào)查問卷了解其一般情況，ELISA法檢測血清YKL-40，高分辨率CT了解支氣管壁增厚情況，結果發(fā)現(xiàn)藥物耐受患兒血清YKL-40明顯高于藥物控制良好及健康兒童，YKL-40水平與患者支氣管壁增厚程度具有相關性(r=0.45)。

3 呼出氣中介質(zhì)

FeNO數(shù)量與哮喘患者嗜酸性粒細胞計數(shù)增多有關。Korevaar等[8]總結17項哮喘相關研究共3 216名患者的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)FeNO有助于嗜酸性粒細胞性哮喘的診斷，AUC指標為0.75，提示FeNO對嗜酸性粒細胞性哮喘的診斷有重要的輔助意義，并且FeNO在推斷低濃度痰嗜酸性粒細胞時比IgE檢測更精準。但是，F(xiàn)eNO因容易受到患者糖皮質(zhì)激素治療和吸煙狀況等的干擾，在推斷痰嗜酸性粒細胞增多方面的能力具有局限性。

呼出氣中的揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)可以通過多氣體檢測儀電子鼻(eNose)裝置檢測分析。哮喘的氣道炎癥(大多為Th2嗜酸性粒細胞性炎癥)可促進支氣管上皮細胞膜脂質(zhì)結構中多不飽和脂肪酸降解、揮發(fā)性碳氫化合物形成，這些揮發(fā)性有機化合物進入血液，隨后以不同的結構在呼氣中排出，用樣品袋收集患者的呼出氣并通過eNose識別其主要成分，結果能達到診斷與鑒別診斷的目的[35-36]。Cavaleiro等[37]收集64例6～18歲哮喘患者呼出氣，基于呼出氣VOCs的冷凝液eNose層次分析能夠?qū)和龀鲈\斷，診斷的準確性AUC值為0.81，準確度、敏感度和特異度均在68.6%～93.1%之間。Fens等[38]收集90例實驗者，包括COPD組、哮喘組、未吸煙健康成人組和吸煙健康成人組，通過eNose對VOCs的主要成分分析能準確辨別出4組之間的差異。主要成分分析圖表明，COPD和哮喘患者的主要成分存在明顯的差異，由此可以把COPD患者和哮喘患者區(qū)分開，此鑒別的標準判別分析顯示鑒別的準確度為96%。

在有氣道高反應性的患者中，F(xiàn)eNO水平可預測ICS療效。Price等[39]篩選出294例(18～80歲)有非特異性、持續(xù)性呼吸道癥狀(篩選前至少有6周咳嗽、喘息或慢性呼吸困難癥狀)但以前未診斷為哮喘的患者。經(jīng)過2周測量患者的一般情況后進行4周的ICS治療，發(fā)現(xiàn)高水平FeNO患者ICS治療后癥狀緩解更明顯，低水平FeNO患者對ICS治療反應性差，因此低水平FeNO患者可以避免這種治療。在指導治療方面，相對于主要臨床癥狀，依據(jù)FeNO水平調(diào)整的哮喘藥物劑量更能有效降低哮喘惡化的頻率，因此，此生物標記物對經(jīng)常急性發(fā)作的成人最有用[40]。Kupczyk等[41]前瞻性研究93例重癥哮喘患者和76例輕中度哮喘患者1年后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eNO與氣道阻塞和病情加重相關，F(xiàn)eNO>45 ppb合并吸煙史的患者病情加重的頻率及風險更大。

4 誘導痰炎癥介質(zhì)

誘導痰技術是通過非侵入性方法利用高滲生理鹽水等誘導患者產(chǎn)生足量的痰液，并對痰液中的嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、細胞因子、病毒和細菌等成分進行分析，以此判斷疾病嚴重程度及預后[42-44]。然而，痰誘導過程需要耗費大量時間，并且需要經(jīng)驗豐富的操作人員，在收集方面也存在困難，許多患者無法產(chǎn)生足量的高質(zhì)量樣本，所以在臨床的實用性較小。

痰嗜酸性粒細胞百分比增多≥3%可表示患者對ICS和美泊利單抗治療的反應較好[45-46]，而低痰嗜酸性粒細胞百分比(<2%)患者對莫米他松或噻托溴銨的反應與安慰劑無較大差異[47]。痰嗜酸性粒細胞的改變反映哮喘臨床癥狀控制的波動，其與哮喘嚴重程度呈正相關，與肺功能狀況呈負相關[41,48-49]。人腫瘤壞死因子相關凋亡弱誘導因子(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)與炎癥的發(fā)病機制有關，Kim等[50]為證實其與哮喘的相關性，收集年齡在5～18歲之間的95例哮喘患兒和78例健康兒童進行肺功能檢測和乙酰膽堿激發(fā)試驗，收集痰液檢測嗜酸性粒細胞和TWEAK，結果顯示哮喘患兒的TWEAK明顯高于健康兒童，并與氣道阻塞、肺功能下降有密切聯(lián)系，該特征在非嗜酸性粒細胞性哮喘中更明顯。另外，其在痰液中的濃度與非嗜酸性粒細胞炎癥嚴重程度(r=0.358)、癥狀控制情況(r=0.470)均有關。

5 尿代謝物

尿白三烯E4(leukotriene E4，LTE4)可以作為哮喘診斷的一個輔助因子。馮曉朦等[51]收集30例哮喘患兒和30例正常幼兒尿液通過ELISA檢測對比LTE4含量，結果發(fā)現(xiàn)患兒LTE4含量明顯高于正常幼兒[分別為(380.66±115.76)ng/mL、(263.52±46.21)ng/mL]。尿哮喘患者和COPD患者之間尿代謝物分析存在差異，核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)可以檢測出尿液樣本中的這種差異。Adamko等[52]收集54例哮喘患者和23例COPD患者的尿液樣本進行NMR分析，在排除不相關代謝物后，對22種相關性高的代謝物進行分析，結果由變異系數(shù)圖顯示得出哮喘患者尿液中精氨酸、肌酸酐、谷氨酰胺、羥基乙酸等代謝物明顯高于COPD患者，診斷的準確性高于90%，并且急性發(fā)作后的尿代謝物分析結果與此結果中檢測出的代謝物大多數(shù)一致。

尿溴酪氨酸(bromotyrosine，BrTyr)與ICS反應性相關。Cowan等[46]收集46例年齡為18～75歲的患者，在其接受ICS治療期間檢測FeNO、痰嗜酸性粒細胞和尿BrTyr水平，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過28 d治療后，82%的哮喘患者FeNO水平下降，60%患者痰嗜酸細胞計數(shù)下降，58%患者尿BrTyr水平下降。尿BrTyr具有監(jiān)測ICS療效的效用，并且其與FeNO水平聯(lián)合監(jiān)測的準確性進一步提高(13.3倍)。

6 小結

精準醫(yī)療在哮喘領域的潛力才剛剛開始被探索，針對疾病臨床特征和改善患者生活質(zhì)量的個體化治療仍需要醫(yī)學工作者們不斷探究。精準醫(yī)療的實施，需要有效的生物標記物提供保障，一個有效的生物標記物從發(fā)現(xiàn)到臨床應用，是一個相當漫長且消耗資源的過程，需要通過大量數(shù)據(jù)證實，以確保該生物標記物的實用性以及準確性。有效的生物標記物不僅要準確反映特異性疾病的機制，并且要以快速、簡便、經(jīng)濟有效的方式進行量化。只有在這些前提下，生物標記物的研究才能影響臨床實踐，并轉化為對哮喘患者的診斷、治療和管理方面的提高。