表觀遺傳學(xué)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的研究進(jìn)展

朱璟希，李紅

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的病理性妊娠，通常指在妊娠28周前與同一配偶連續(xù)發(fā)生3次及3次以上的妊娠失敗[1]。美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的最新流行病學(xué)資料顯示自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～20%，其中RSA發(fā)生率約占妊娠總數(shù)的2%～5%，這不僅對(duì)育齡期女性造成極大的生理和精神創(chuàng)傷，也給家庭和睦和社會(huì)穩(wěn)定都帶來(lái)很大的隱患[2-3]。RSA的病因復(fù)雜，常涉及遺傳、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)、生殖結(jié)構(gòu)異常和環(huán)境等多方面因素[2，4]。然而，目前仍有50%左右的RSA發(fā)病機(jī)制尚不明確，這部分病例又稱為原因不明的RSA（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。因此，深入探明URSA的發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行早期干預(yù)，進(jìn)一步降低RSA患者再次妊娠流產(chǎn)率，提高RSA活產(chǎn)率迫在眉睫。近年隨著表觀遺傳學(xué)這一研究領(lǐng)域的迅速發(fā)展，為RSA的病因?qū)W研究打開(kāi)了新的視角。表觀遺傳學(xué)是指在遺傳基因序列不變的情況下，某些基因的功能發(fā)生可遺傳的變化，主要包括DNA或RNA甲基化、組蛋白或染色質(zhì)翻譯后修飾（post translation modification，PTM）和非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）調(diào)控等。DNA和蛋白質(zhì)的表觀遺傳改變導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑，從而通過(guò)激活或抑制決定細(xì)胞分化、增殖和凋亡等基本生命過(guò)程的關(guān)鍵基因表達(dá)，不僅在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控作用，還可以通過(guò)代際、跨代遺傳傳遞給后代進(jìn)而影響其健康[5-6]。鑒于生命早期的表觀遺傳修飾決定了儲(chǔ)存在基因組中的遺傳信息的表達(dá)，現(xiàn)從DNA和RNA甲基化、組蛋白修飾及ncRNA調(diào)控這幾個(gè)方面就表觀遺傳學(xué)在RSA中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA和RNA甲基化在RSA中的研究進(jìn)展

1.1 DNA甲基化與RSA DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)也是目前研究最為廣泛的表觀遺傳機(jī)制，主要發(fā)生在位于基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島（CpG island，CGI）上，通過(guò)將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基添加到胞嘧啶環(huán)的5號(hào)位上生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）。由于m5C結(jié)構(gòu)既可以阻止轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）與DNA位點(diǎn)的結(jié)合，也可以通過(guò)結(jié)合組蛋白修飾招募甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行染色質(zhì)重塑，進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)的沉默[7]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化修飾通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印跡和染色體穩(wěn)定性等多種生物學(xué)過(guò)程在發(fā)育中發(fā)揮著極其重要的功能，與不良妊娠的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。

最新研究發(fā)現(xiàn)URSA患者叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3）基因調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）特異性去甲基化區(qū)（Tregspecific demethylated region，TSDR）的甲基化水平顯著高于健康對(duì)照組，且其甲基化水平與Treg比例和Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示Foxp3基因TSDR高甲基化狀態(tài)可能是URSA患者CD4+T細(xì)胞中Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低和Treg比例降低的原因之一[10]。由于DNA甲基化在配子發(fā)生和妊娠早期過(guò)程中不可或缺，研究者通過(guò)全基因組DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，活化白細(xì)胞黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM）等基因可能是RSA的診斷生物標(biāo)志物和候選調(diào)控靶點(diǎn)[11]。Hanna等[12]利用甲基化芯片分析核型正常的RSA組（RM組）、單次流產(chǎn)組（M組）和選擇性終止妊娠組（TA組）中妊娠早期絨毛的DNA甲基化差異情況，結(jié)果顯示與TA組相比，受體酪氨酸激酶AXL的甲基化水平上調(diào)，而防御素β1（DEFB1）基因的甲基化水平下調(diào)，提示這些胎盤(pán)特定位點(diǎn)的DNA甲基化水平改變可能是核型正常的RSA中胎盤(pán)功能低下的原因之一。另有研究采用全基因組DNA甲基化分析結(jié)合蛻膜組織全基因組基因表達(dá)，探討DNA甲基化水平改變?cè)赗SA中的作用，共鑒定出539個(gè)差異甲基化區(qū)（DMR），并與基因表達(dá)顯著相關(guān)，其中環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白5（cAMP responsive element binding protein 5，CREB5）基因附近的低甲基化DMR招募轉(zhuǎn)錄因子P53和SP1結(jié)合并上調(diào)CREB5的表達(dá)，提示CREB5甲基化水平的改變可能在RSA發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，CREB5可能是一個(gè)潛在的RSA診斷生物標(biāo)志物[13]。由此可見(jiàn)，DNA甲基化異常可能是RSA發(fā)生的原因之一，而這些基因的DNA甲基化水平可能是診斷RSA的潛在生物標(biāo)志物，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

DNA甲基化過(guò)程常涉及各種酶類，包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）、具有去甲基化作用的DNA 甲基化羥化酶（ten eleven translocation，TET）等，因此，在研究RSA患者全基因組DNA甲基化水平的同時(shí)常會(huì)關(guān)注DNA甲基化過(guò)程中相關(guān)酶類的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)與妊娠早期人工流產(chǎn)對(duì)照組相比，RSA組的全基因組甲基化水平顯著降低，RSA組絨毛組織中DNMT1和DNMT3b的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平顯著降低，TET1和TET2的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平顯著增加，提示RSA患者的絨毛組織呈現(xiàn)出低甲基化水平的狀態(tài)，可能與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3b表達(dá)下調(diào)和DNA甲基化羥化酶TET1、TET2表達(dá)上調(diào)有關(guān)[14]。此外，在基因型研究中發(fā)現(xiàn)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3b 的基因多態(tài)性（rs1569686）可能是RSA易感性的遺傳標(biāo)志[15]。

葉酸代謝作為生成甲基供體活性甲硫氨酸SAM的重要途徑，與DNA甲基化的發(fā)生密不可分。研究發(fā)現(xiàn)與匹配孕周的健康對(duì)照組相比，RSA病例中葉酸代謝關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因特異性甲基化顯著升高（P=0.002），強(qiáng)調(diào)了MTHFR基因特異性甲基化與RSA的關(guān)聯(lián)[16]。Rotondo等[17]發(fā)現(xiàn)RSA患者配偶的精子細(xì)胞中的MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)出高水平的甲基化狀態(tài)，進(jìn)一步提示MTHFR基因的甲基化水平異?？赡苡绊懪咛サ恼ＩL(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致RSA的發(fā)生。

DNA甲基化過(guò)程的異常導(dǎo)致基因表達(dá)調(diào)控的改變，直接或間接地影響了胚胎的著床、生長(zhǎng)和發(fā)育。一方面這些甲基化水平差異基因有望作為診斷RSA的潛在生物標(biāo)志物，另一方面，需要更多的基礎(chǔ)研究對(duì)其在RSA中的分子機(jī)制及相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行深入研究，以期為RSA的預(yù)防和治療提供新的視角。

1.2 RNA甲基化與RSA 在很長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)，DNA都是位于生命科學(xué)研究的首位，然而，隨著近20年RNA轉(zhuǎn)錄后修飾和功能性ncRNA的發(fā)現(xiàn)徹底改變了學(xué)者們對(duì)RNA的看法，RNA 扮演著攜帶遺傳信息和操縱遺傳調(diào)控的雙重角色。RNA甲基化是在RNA 層面上調(diào)控基因表達(dá)的一種重要方式，常見(jiàn)的甲基化修飾包括N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）和m5C等[18]，其中m6A是哺乳動(dòng)物mRNA中最為普遍的內(nèi)部修飾，m6A是一種發(fā)生在腺苷酸N6位的甲基化修飾，是一種動(dòng)態(tài)的、可逆的甲基化修飾，過(guò)程涉及甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）、去甲基酶（Erasers）和甲基化閱讀蛋白（Readers）等[19]，通過(guò)調(diào)控選擇性剪切、出核、定位、蛋白質(zhì)翻譯和降解等生命過(guò)程調(diào)控包括分化、侵襲和凋亡等多重生物學(xué)效應(yīng)，參與到多種疾病的病理和生理過(guò)程中[20-22]。

Li等[23]為探索m6A修飾在RSA患者胎盤(pán)中的作用，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）、m6ARNA甲基化定量（MeRIP-qPCR）和免疫組織化學(xué)方法，分別檢測(cè)RSA患者和健康對(duì)照組絨毛組織中m6A甲基化水平和m6A去甲基化酶AlkB同源蛋白5（AlkB homologue 5，ALKBH5）基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組RSA患者胎盤(pán)絨毛組織中mRNA水平的m6A甲基化顯著降低，而ALKBH5的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；深入研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5可能通過(guò)依賴于m6A調(diào)控機(jī)制抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲，該研究為進(jìn)一步探索RSA中廣泛的RNA表觀遺傳調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)。然而，目前關(guān)于RNA表觀修飾異常與RSA的發(fā)病機(jī)制研究尚淺，有待于更多的科研工作者進(jìn)行深入探索。

2 組蛋白修飾在RSA中的研究進(jìn)展

在染色質(zhì)中，DNA由組蛋白八聚體包裹成高度緊密的結(jié)構(gòu)，從而形成串珠樣核小體。組蛋白八聚體由2個(gè)組蛋白2A（H2A）和2個(gè)組蛋白H2B（H2B）的四聚體組成，同時(shí)兩側(cè)是組蛋白3（H3）和組蛋白4（H4）的二聚體。這些組蛋白包含1個(gè)球形的羧基（C）末端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)延伸的氨基（N）末端，它們受到多種PTM的影響，包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和瓜氨酸化等，其中以組蛋白H3和H4上賴氨酸殘基的乙酰化和甲基化居多，這些修飾被稱為組蛋白修飾。在各種蛋白酶的參與下，組蛋白修飾通過(guò)調(diào)控DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及損傷修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程參與炎癥反應(yīng)和包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病，其中以組蛋白甲基化酶和乙?；傅漠惓１磉_(dá)較為常見(jiàn)[24-25]。

Fatima等[26]在12例正常妊娠早期女性（對(duì)照組）和15例URSA患者的新鮮蛻膜/子宮內(nèi)膜組織中研究甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和組蛋白H3K9甲基化的表達(dá)情況，結(jié)果表明，甲基轉(zhuǎn)移酶G9a在URSA組中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而URSA組中組蛋白H3K9甲基化水平也顯著低于對(duì)照組，提示組蛋白甲基化修飾異常可能是導(dǎo)致URSA的潛在原因之一。眾所周知，父源基因組缺陷被認(rèn)為是自發(fā)性RSA的重要誘因之一，而氧化應(yīng)激增加會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)、蛋白質(zhì)和膜脂損傷，學(xué)者們通過(guò)探討精子DNA包裝缺陷引起的組蛋白殘留與氧化應(yīng)激是否存在顯著關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生流產(chǎn)的胚胎分化早期，組蛋白精氨酸和賴氨酸等位點(diǎn)的氧化修飾可能擾亂了父系表觀基因組調(diào)控[27]。此外，Wang等[28]通過(guò)應(yīng)用曲古他汀A（TSA）抑制CBA/J小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞組蛋白脫乙酰酶（HDAC），發(fā)現(xiàn)Foxp3的組蛋白修飾調(diào)控可產(chǎn)生功能性Treg，提示妊娠早期移植TSA誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞有助于誘導(dǎo)母胎免疫耐受，并減少具有流產(chǎn)傾向小鼠的胚胎吸收，具有細(xì)胞免疫治療作用。由此可見(jiàn)，組蛋白位點(diǎn)的共價(jià)修飾在RSA的發(fā)生發(fā)展中起著異常關(guān)鍵的作用，而調(diào)控組蛋白修飾的相關(guān)研究能夠?yàn)镽SA的防治提供一個(gè)新的視角。

3 ncRNAs在RSA中的研究進(jìn)展

ncRNA作為基因組轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，雖不能作為蛋白質(zhì)翻譯的模板，但其是轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，成為新型的疾病診斷標(biāo)志物，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[29]。根據(jù)大小，ncRNAs主要分為短鏈ncRNA（short non-coding RNA，sncRNA，＜200 nt）和長(zhǎng)鏈ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA，＞200 nt）。由于ncRNA參與許多生物學(xué)過(guò)程，且母胎界面的ncRNA表達(dá)水平異?？赡軈⑴cRSA的發(fā)病，因而成為RSA病因?qū)W研究的熱點(diǎn)。

微小RNA（microRNA，miRNA）作為研究最為廣泛的sncRNA，是一種序列高度保守的單鏈RNA，約有20個(gè)nt，是維持生物穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)，常通過(guò)緩沖外界干擾，從而確保生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。學(xué)者們?yōu)榱私沂綰RSA患者蛻膜組織中自然殺傷（NK）細(xì)胞的miRNA圖譜，應(yīng)用miRNA表達(dá)譜分析鑒定出50個(gè)差異表達(dá)的miRNA，構(gòu)建了miRNA-基因-網(wǎng)絡(luò)、miRNA-Go分析-網(wǎng)絡(luò)和miRNA-基因-轉(zhuǎn)錄因子-網(wǎng)絡(luò)，確定了網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵miRNA——has-miR-5787及關(guān)鍵信號(hào)通路——Wnt 受體信號(hào)通路，提示miRNAs的異常表達(dá)與URSA之間存在著密切的關(guān)系，有助于URSA的臨床診斷和開(kāi)發(fā)針對(duì)URSA的治療新靶點(diǎn)[30]。此外，Wang等[31]發(fā)現(xiàn)pri-miR-196A-2中的多態(tài)性位點(diǎn)miR-196A-2rs11614913T/T可能通過(guò)干擾成熟miR-196A-3p的產(chǎn)生，增強(qiáng)二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）的表達(dá)，從而增加RSA的遺傳易感性。

lncRNA可以通過(guò)多種機(jī)制參與生物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和凋亡等生命活動(dòng)，進(jìn)而在心血管疾病、胚胎發(fā)生和器官分化等過(guò)程中發(fā)揮著不同的重要作用。此外，由于lncRNA的組織特異性表達(dá)，使得它們可以作為生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，有效地應(yīng)用于各類疾病中，具有重要的臨床意義[32]。研究表明RSA患者中主要的感染和免疫途徑發(fā)生變化，而lncRNA被認(rèn)為是免疫細(xì)胞激活和分化的重要調(diào)節(jié)因子，提示lncRNA可能通過(guò)免疫途徑參與RSA的發(fā)病機(jī)制[33]。此外，Tristetraprolin（TTP）作為一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白，其能夠結(jié)合下游靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū) （3′-untranslated regions，3′-UTRs）所包含的腺嘌呤-尿嘧啶（AU）重復(fù)序列從而誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解，但在RSA患者的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞中TTP表達(dá)上調(diào)，深入研究發(fā)現(xiàn)在滋養(yǎng)層細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TTP 顯著抑制了lncRNA HOTAIR（homologous gene transcriptional antisense RNA，HOTAIR）的表達(dá)，揭示了TTP通過(guò)調(diào)控lncRNA影響妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的新途徑[34]。

環(huán)狀RNA（circRNA） 是一組近年新發(fā)現(xiàn)的ncRNA，其特征是環(huán)狀共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性、保守性、豐富性、組織和階段特異性，其功能包括充當(dāng)miRNA海綿或與內(nèi)源RNA競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用來(lái)影響細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和癌癥在內(nèi)的多種疾病中表現(xiàn)出異常表達(dá)，顯示出其在疾病預(yù)測(cè)、預(yù)后和臨床治療方面的巨大潛力[35]。研究者在URSA患者絨毛組織中應(yīng)用circRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)存在多種異常表達(dá)的circRNA，深入研究將有助于闡明circRNA在URSA發(fā)病中的作用機(jī)制[36]。

上述研究指出ncRNA的差異表達(dá)及調(diào)控異常與RSA的發(fā)生密切相關(guān)。此外，ncRNA的結(jié)構(gòu)異常也可能參與RSA的發(fā)生，并作為潛在的疾病診斷標(biāo)志物具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)行更為深入的研究。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

RSA的致病因素復(fù)雜多樣，表觀遺傳修飾通過(guò)精確調(diào)控基因的遺傳和表達(dá)，在胚胎著床和生長(zhǎng)發(fā)育等各過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在DNA、組蛋白和ncRNA等分子上發(fā)生的各種表觀遺傳修飾通過(guò)改變關(guān)鍵基因的表達(dá)導(dǎo)致不良妊娠的發(fā)生，一方面明確這些決定妊娠結(jié)局的關(guān)鍵基因，并對(duì)適齡女性進(jìn)行早期篩查，將有助于降低RSA的發(fā)病率；另一方面針對(duì)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)和個(gè)性化的干預(yù)，對(duì)治愈RSA具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，針對(duì)遺傳DNA正常的RSA患者進(jìn)行更為深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的基礎(chǔ)科學(xué)研究，不僅有助于進(jìn)一步闡明RSA的病理生理機(jī)制，為RSA的診療提供新的策略，也將促進(jìn)家庭和睦以及社會(huì)穩(wěn)定，具有非常重要的社會(huì)意義。