外泌體在口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展及診療應(yīng)用的研究

蔣宇磊 夏斌 饒南荃 楊禾豐 許彪

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科 昆明650500

口腔癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，2018年全球因口腔癌死亡177 384例，占癌癥總死亡的1.9%[1]。口腔癌中，口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）所占比例超過80%。雖然放射治療、化學(xué)治療以及手術(shù)療法已取得長足進(jìn)步，但也存在較多不足[2]，OSCC患者的5年生存率依然很不理想。晚期診斷、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是OSCC患者不良預(yù)后和低生存率的主要原因。因此，尋找新的腫瘤生物標(biāo)志物和靶向治療的靶點對OSCC的早期診斷和臨床治療至關(guān)重要。

隨著癌癥研究的深入，“種子和土壤”學(xué)說將人們的目光聚焦到腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）上[3]。TME中，細(xì)胞間通訊是影響腫瘤進(jìn)展的重要因素之一，而外泌體作為TME中細(xì)胞間通訊重要的信號載體，近年來備受關(guān)注[4]。外泌體是指細(xì)胞在生理和病理條件下，經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列調(diào)控過程而形成的膜性囊泡[5]。外泌體通過介導(dǎo)特定的細(xì)胞間通訊，調(diào)節(jié)TME中的血管生成、免疫逃逸和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[6-7]證明：外泌體可用作液體活檢或非侵入性生物標(biāo)記物，也可作為藥物的載體，用于疾病的早期診斷和治療。本文主要論述外泌體在OSCC的研究進(jìn)展，以期為攻克腫瘤治療難題提供新的思路。

1 外泌體的生物合成和功能

在國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）首次會議上，當(dāng)時學(xué)者們尚無法就囊泡命名法達(dá)成廣泛共識，因此鼓勵研究人員使用細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）作為不同類別分泌囊泡的通用術(shù)語[8]?，F(xiàn)階段，通常將EVs分為兩大類：外泌體（exosomes）和核外顆粒體（ectosomes）[9]。外泌體是指直徑為30～150 nm核內(nèi)體來源的帶有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡[5]。外泌體的具體形成機(jī)制尚不清楚，不同類型的細(xì)胞形成外泌體的過程類似，其形成過程主要在核內(nèi)體中完成。細(xì)胞通過內(nèi)吞作用將蛋白、mRNA、微小RNA（micro-RNA，miRNA）、脂質(zhì)等物質(zhì)內(nèi)吞形成細(xì)胞膜包裹的內(nèi)吞囊泡，小囊泡相互融合形成早期核內(nèi)體，隨后質(zhì)膜內(nèi)陷，胞質(zhì)內(nèi)的蛋白、miRNA、脂質(zhì)等選擇性地被包裹進(jìn)囊泡結(jié)構(gòu)；后期核內(nèi)體產(chǎn)生許多小囊泡，并逐步演變成多泡體，多泡體轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜與細(xì)胞膜融合，在Rab27a和Rab27b等Rab家族三磷酸鳥苷（guanosinetriphosphate，GTP）酶的作用下協(xié)助釋放到胞外形成外泌體[10]。外泌體參與許多正常的生理活動，包括血管生成和骨愈合[11]。外泌體在腫瘤的進(jìn)展中也發(fā)揮重要作用，包括促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的調(diào)控[12]以及誘導(dǎo)TME中成纖維細(xì)胞的活化[13]。病變器官中的異常細(xì)胞產(chǎn)生外泌體較正常細(xì)胞多，據(jù)研究[6]，癌癥患者的血液包含約4 000萬億個外泌體，約為正常人的2倍。

根據(jù)外泌體在體液中分布廣、數(shù)量多的特性，通過收集并分析體液中的外泌體，有助于為癌癥的早期檢測以及治療新靶點的發(fā)現(xiàn)提供幫助。

2 外泌體在OSCC交互中的作用

長期以來，癌癥研究多數(shù)僅僅關(guān)注腫瘤本身。隨著“種子和土壤”理論的提出，TME的重要性被廣大學(xué)者采納[3]。外泌體作為TME的重要組成部分，參與腫瘤增殖、侵襲以及血管生成，并通過抑制免疫監(jiān)視和去除化學(xué)治療藥物以提高化學(xué)抗性來促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[14]。由于外泌體在介導(dǎo)癌癥惡性發(fā)展中的作用被發(fā)現(xiàn)得越來越多，因此近年來備受關(guān)注。

2.1 外泌體介導(dǎo)OSCC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

隨著腫瘤—基質(zhì)相互作用機(jī)制的研究愈發(fā)深入，學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。成纖維細(xì)胞是癌癥基質(zhì)的主要成分，被腫瘤細(xì)胞活化的成纖維細(xì)胞稱為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）。CAFs作為TME的重要細(xì)胞之一，可通過多種機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，其中CAFs通過旁分泌途徑分泌外泌體影響腫瘤進(jìn)展是近年來的研究熱點[15]。研究[16]表明：CAFs來源的外泌體中包含的微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白5（microfibrillar-associated protein 5，MFAP5）通過誘導(dǎo)SCC25中絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路的激活，可顯著提高SCC25細(xì)胞的惡性侵襲能力。CAFs中高表達(dá)的miR-382-5p可經(jīng)外泌體轉(zhuǎn)運至OSCC細(xì)胞，從而促進(jìn)OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。此外，miR-34a-5p可通過與其直接下游目標(biāo)AXL（AXL receptor tyrosine kinase）結(jié)合以抑制OSCC細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。與正常成纖維細(xì)胞分泌的外泌體相比，CAFs分泌的外泌體中miR-34a-5p的表達(dá)較低，提示CAFs分泌缺乏miR-34a-5p的外泌體可能有助于OSCC的惡性進(jìn)展[18]。

2.2 外泌體介導(dǎo)OSCC細(xì)胞的免疫作用

外泌體在免疫促進(jìn)和免疫抑制作用之間存在相互矛盾的機(jī)制。腫瘤來源的外泌體既可以刺激也可以抑制機(jī)體產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答[19]。含有腫瘤相關(guān)抗原的外泌體可被抗原呈遞細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）有效吸收，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用[20-21]。此外，轉(zhuǎn)移前腫瘤產(chǎn)生的外泌體，通過免疫監(jiān)控引發(fā)廣泛的先天免疫反應(yīng)，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的癌細(xì)胞被清除[22]。但有相關(guān)文獻(xiàn)[23]表明，外泌體參與了機(jī)體的免疫抑制作用，從頭頸癌（head and neck cancer，HNC）患者血漿中分離獲得的外泌體可有效誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的凋亡，抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）的免疫抑制能力以及抑制自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumour-associated macrophages，TAMs）是TME中最豐富的免疫細(xì)胞之一。TAMs在腫瘤的增殖、遷移以及血管生成方面起著關(guān)鍵作用，并且可以抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[24]。TAMs具有很強(qiáng)的功能可塑性，可分別獲得免疫刺激（M1樣）或免疫抑制（M2樣）能力，以及介于兩者之間的各種功能表型[25]。OSCC細(xì)胞系（SCC-9和CAL-27）來源的外泌體中的miR-29a-3p通過激活細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（recombinant suppressors of cytokine signaling 1，SOCS1）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）信號途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2樣改變，并且這種M2樣TAMs能促進(jìn)SCC-9和CAL-27細(xì)胞的增殖和侵襲；同時，含有miR-29a-3p的外泌體能夠促進(jìn)裸鼠體內(nèi)OSCC的生長[26]。Xiao等[27]發(fā)現(xiàn)：來自O(shè)SCC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能激活巨噬細(xì)胞成為M1樣TAMs，并提出了基于OSCC來源的外泌體形成的一種癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞間的新型旁分泌環(huán)——即巨噬細(xì)胞通過攝取OSCC細(xì)胞來源的外泌體，經(jīng)p38、Akt和應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號轉(zhuǎn)變?yōu)镸1樣TAMs，其中OSCC來源外泌體中的血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin 1，THBS1）參與了巨噬細(xì)胞的活化過程，M1樣TAMs來源的外泌體再對OSCC細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)作用。

TME的缺氧應(yīng)激通常被認(rèn)為是腫瘤來源外泌體發(fā)生變化的原因。有研究[28]發(fā)現(xiàn)：常氧環(huán)境中，OSCC來源的外泌體以依賴熱休克蛋白70（heat shock proteins 70，HSP70）但不依賴DC的方式促進(jìn)γδT細(xì)胞的增殖和腫瘤殺傷能力；但在缺氧環(huán)境中，OSCC來源的外泌體對γδT細(xì)胞的刺激作用消失，并且骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloidderived suppressor cells，MDSCs）攝取OSCC來源的外泌體后通過調(diào)控miR-21/PTEN（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）/程序性死亡受體-配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）軸抑制γδT細(xì)胞的活性，逆轉(zhuǎn)常氧環(huán)境中外泌體的免疫促進(jìn)作用。這為外泌體的免疫促進(jìn)和免疫抑制作用之間的矛盾提供一個可能合理的解釋，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

2.3 外泌體介導(dǎo)TME中血管的生成

外泌體還參與病理性血管生成的調(diào)節(jié)，包括腫瘤血管生成[29]。血管的生成依賴于內(nèi)皮細(xì)胞，并借此為癌細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)。內(nèi)皮細(xì)胞通過攝取腫瘤來源的外泌體促進(jìn)其增殖和遷移，并借此誘導(dǎo)腫瘤組織中的血管生成[30]。

來源于SCC-15的外泌體通過誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的增殖及遷移，發(fā)揮了明顯的促血管生成作用[31]。此外，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細(xì) 胞 系PCI-13和UMSCC47來源的外泌體能夠攜帶大量血管生成相關(guān)蛋白，如凝血因子Ⅲ、重組人胰島素生長因子結(jié)合蛋白-3、尿纖溶酶原激活物和血小板反應(yīng)蛋白1等，并通過誘導(dǎo)HUVEC的功能重編程以及促進(jìn)癌細(xì)胞對于HUVEC的黏附力，成為OSCCTME中血管生成的有效誘導(dǎo)劑[32]。2.4外泌體介導(dǎo)OSCC的化學(xué)治療耐受

盡管化學(xué)治療在OSCC治療中取得了長足進(jìn)步，但腫瘤的耐藥性仍是其治療失敗的主要原因之一。研究[33]發(fā)現(xiàn)，外泌體通過多條信號通路創(chuàng)造了有利于耐藥的TME。

耐受順鉑的OSCC來源的外泌體中miR-155存在過表達(dá)，而過表達(dá)的miR-155可通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和下調(diào)FOXO3a（forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）賦予OSCC順鉑耐藥性[34]。另外，有研究[35]發(fā)現(xiàn)：順鉑耐藥OSCC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能增強(qiáng)親代OSCC細(xì)胞的耐藥性；進(jìn)一步研究可知，來自順鉑耐藥的OSCC細(xì)胞的外泌體通過將miR-21轉(zhuǎn)移至OSCC親代細(xì)胞，調(diào)控PTEN和程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）表達(dá)，從而誘導(dǎo)親代細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥。在體內(nèi)模型中，該結(jié)果得到驗證[35]。

與順鉑敏感品系OSCC細(xì)胞系H103相比，順鉑耐藥品系H314來源的外泌體以及其培養(yǎng)基中均含有更高濃度的順鉑，提示抑制外泌體分泌可能起到降低順鉑外排的作用；在使用質(zhì)子泵抑制劑抑制了OSCC的外泌體分泌后，觀察到H314細(xì)胞的藥物敏感性增加，表明外泌體可能在OSCC耐藥性中起著藥物外排的作用[36]。由此可以推測，控制外泌體的分泌可能是增強(qiáng)癌癥治療功效的潛在策略。

3 外泌體在OSCC診斷和治療中的臨床應(yīng)用

由于外泌體攜帶重要的生物分子，并且廣泛存在于體液中，因此其在癌癥的早期診斷、預(yù)后和治療中具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。此外，外泌體作為miRNA和治療劑轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的藥物遞送載體，與合成載體相比，這些納米囊泡具有更高的安全性和穩(wěn)定性，這為癌癥治療中的靶向藥物輸送提供了可能[37]。

3.1 外泌體在OSCC診斷中的應(yīng)用

OSCC晚期診斷仍然是其高發(fā)病率和高死亡率的主要原因之一。大多數(shù)OSCC發(fā)展至晚期臨床階段才被確診，組織學(xué)檢查是OSCC診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。研究[38]證明：唾液活檢有可能被用于口腔癌患者的診斷，以及作為評估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志。

唾液收集無創(chuàng)，患者的依從性更高，唾液中miRNA表達(dá)譜與血液相似[39]，且唾液相對于血液具有不凝結(jié)的優(yōu)勢。存在于唾液中的外泌體，其內(nèi)含蛋白質(zhì)、miRNA和mRNA等生物學(xué)信息，具有脂質(zhì)雙層膜的保護(hù)能免于降解，另外獲取外泌體又是一種無創(chuàng)的方法[40]，綜合這些優(yōu)點，收集并分離唾液外泌體為口腔癌的早期診斷提供了新的可能。

與健康人的唾液外泌體（67.4 nm±2.9 nm）相比，口腔癌患者的唾液外泌體（98.3 nm±4.6 nm）更大，且口腔癌患者唾液中的外泌體密度增加了2～4倍，囊泡間聚集度更高，呈聚集的囊泡或成簇狀，形態(tài)上的差異更大[41]。臨床研究[42]發(fā)現(xiàn)：與健康個體和口腔潰瘍患者相比，OSCC患者唾液中的外泌體數(shù)量明顯升高，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，唾液中外泌體的數(shù)量與OSCC患者的臨床病理特征呈正相關(guān)。

He等[43]發(fā)現(xiàn)：與健康個體相比，OSCC患者的唾液外泌體中miR-24-3p含量更高；與腫瘤周圍組織相比，miR-24-3p在OSCC組織中表達(dá)顯著升高，且miR-24-3p可通過直接與晝夜節(jié)律蛋白1（period circadian protein 1，PER1）相互作用顯著促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖，表明唾液中的miR-24-3p可能起源于腫瘤細(xì)胞。唾液外泌體中miR-31在OSCC患者唾液中的含量亦明顯高于健康個體；而在切除腫瘤4～6周后，86%患者唾液外泌體中miR-31的水平顯著下降[44]。由此可以推測，外泌體中miR-24-3p和miR-31可能是OSCC早期診斷較為理想的指標(biāo)。

將唾液外泌體作為未來OSCC臨床常規(guī)生物檢測標(biāo)志物，將有助于癌癥的早期診斷、早期預(yù)防和針對性的靶向治療，也可改善OSCC患者的治療效果，減少化學(xué)治療的不良反應(yīng)[38]。

3.2 外泌體在OSCC治療中的應(yīng)用

隨著靶向藥物的不斷發(fā)展，納米技術(shù)為靶向輸送和控釋藥物帶來了廣闊的前景。現(xiàn)階段各種藥物納米制劑仍存在兩個問題：納米毒性和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclear phagocyte system，MPS）的快速清除[45]。外泌體可能同時具有合成納米載體和細(xì)胞介導(dǎo)的藥物輸送的優(yōu)勢，并可避免與合成載體相關(guān)的快速清除和納米毒性[46]；此外，外泌體在TME中具有與受體細(xì)胞獨特的交互能力，根據(jù)外泌體特征、來源和特定的細(xì)胞向性，可對特定的組織和器官進(jìn)行藥物輸送[47]。因此，越來越多的研究將外泌體作為高效的靶向藥物載體，來運送低相對分子質(zhì)量的治療劑，如核酸和蛋白質(zhì)[46]。

經(jīng)體內(nèi)外研究[48]發(fā)現(xiàn)：含有miR-138的γδT細(xì)胞的外泌體通過降低S和G2/M期CAL-27細(xì)胞的積累，增加G1期細(xì)胞的數(shù)量，從而直接抑制腫瘤生長；含miR-138的γδT細(xì)胞的外泌體又能顯著提高CD8+T細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的產(chǎn)生以及增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用。由于含有miR-138的γδT細(xì)胞來源的外泌體對OSCC的直接抗腫瘤作用，以及對T細(xì)胞的免疫刺激作用，可考慮將富含miR-138的γδT細(xì)胞來源的外泌體作為OSCC治療的候選藥物。

miR-101-3p可從人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）經(jīng)外泌體途徑轉(zhuǎn)移到受體TCA8113細(xì)胞內(nèi)，顯著抑制TCA 8113細(xì)胞的侵襲和遷移；小鼠移植瘤模型顯示：注射了含miR-101-3p外泌體的裸鼠，其腫瘤體積和重量明顯減??；這些結(jié)果均提示，含miR-101-3p的外泌體能夠抑制OSCC的進(jìn)展[49]。

有學(xué)者[50]從臨床中分別分離并研究了正?？谇火つ?、口腔白斑和口腔癌組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體的差異，結(jié)果顯示：與正常口腔黏膜相比，口腔白斑和口腔癌來源的外泌體具有更強(qiáng)的促進(jìn)SCC15增殖、遷移和侵襲的能力；在小鼠模型中也得到了同樣的結(jié)果。另外，與正常口腔黏膜相比，miR-8485在口腔白斑和口腔癌分泌的外泌體中表達(dá)水平更高，且外泌體中的miR-8485能夠促進(jìn)SCC15的增殖、遷移和侵襲[50]。從該研究可以看出：干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體的分泌可能是抑制癌變進(jìn)展的一種新策略。

4 小結(jié)

隨著外泌體在OSCC中作用機(jī)制的研究日漸深入，外泌體作為TME中細(xì)胞間通訊不可或缺的角色備受矚目。外泌體通過重塑TME，改變基質(zhì)細(xì)胞的表型，從腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)和血管生成等方面影響腫瘤的發(fā)展。外泌體是一類廣泛存在于人類體液中的納米級囊泡，由于其穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)和特殊的細(xì)胞向性，使其可能成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的新型生物標(biāo)記物和高效的藥物載體，為惡性腫瘤患者帶來福音。但是，目前大多數(shù)的研究仍集中在體外研究和動物實驗階段，依然有很多不明確的效應(yīng)及機(jī)制，且缺乏臨床試驗驗證。外泌體用于OSCC的診斷和治療，還有很漫長的路要走。隨著更深入理解外泌體的特征、生物合成、功能以及外泌體與腫瘤細(xì)胞間的交互作用，將外泌體作為新的腫瘤診斷方法，幫助評價預(yù)后和治療效果，以及作為靶向藥物遞送的載體，從實驗室走向臨床，將會是今后努力探索的方向。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。