牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于牙周組織缺損修復(fù)的研究進(jìn)展

施培磊 于晨浩 謝旭東 吳亞菲 王駿

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周病科 成都610041

牙周炎是以牙周支持組織破壞為特征的慢性感染性疾病，臨床上表現(xiàn)為牙周袋的形成、牙周附著喪失和牙槽骨的吸收等[1]。第四次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查顯示：我國(guó)成年人的牙周健康率僅為9.1%，牙周炎是導(dǎo)致我國(guó)成年人牙齒喪失的主要原因。傳統(tǒng)的治療方式是以潔刮治為主的牙周基礎(chǔ)治療，其目的是通過(guò)菌斑控制來(lái)消除牙周組織的炎癥，促進(jìn)牙周組織的愈合和修復(fù)。但是，對(duì)于牙周組織缺損較為嚴(yán)重的部位，僅使用傳統(tǒng)的治療方法促進(jìn)牙周組織再生的效果有限[2]。引導(dǎo)組織再生技術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）通過(guò)運(yùn)用物理屏障阻止上皮向下遷移，為牙周膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖提供空間，從而實(shí)現(xiàn)牙周膜、牙骨質(zhì)和骨組織的再生。GTR的適應(yīng)證相對(duì)局限，即使聯(lián)合使用釉基質(zhì)衍生物[3]和生長(zhǎng)因子[4]等促進(jìn)組織再生的藥物，對(duì)于較嚴(yán)重的牙周組織缺損仍不能獲得理想的牙周組織重建[5]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種發(fā)現(xiàn)于骨髓的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化能力，在組織工程、干細(xì)胞療法等方面表現(xiàn)出較好的前景，多年來(lái)備受學(xué)者們的關(guān)注[6-8]。2000年，Gronthos等[9]從人第三磨牙牙髓中分離出牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cell，DPSC），此后，脫落乳牙干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）[10]、牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）[11]、牙囊干細(xì)胞（dental follicle stem cell，DFSC）[12]、根尖乳頭干細(xì)胞（stem cell from apical papilla，SCAP）[13]等牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞相繼被分離出來(lái)。研究[14]發(fā)現(xiàn)：它們不僅擁有自我更新和多向分化能力，還能夠調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，加上相對(duì)易獲取性，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是理想的牙周組織再生的種子細(xì)胞之一。

1 牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的特性

1.1 自我更新和多向分化

牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力，提示其具有分化并替代受損牙周組織的潛力。牙周膜是連接牙齒和牙槽骨的結(jié)締組織，其中含有少量的PDLSC，在牙周組織受損時(shí)可修復(fù)牙周組織結(jié)構(gòu)，重建牙周組織功能。PDLSC除了可以在體外誘導(dǎo)下分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞外，還表現(xiàn)出比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞強(qiáng)的自我更新和成骨細(xì)胞向分化能力，可以在小鼠體內(nèi)形成牙骨質(zhì)-牙周膜樣組織[11]。位于牙髓中的DPSC源自于神經(jīng)嵴，能夠快速增殖，且能分化為多種細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞，亦能被誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)似，其表面標(biāo)志物包括Stro-1、CD29、CD73、D90、CD105和CD166，而CD14、CD45、CD34、CD25、CD28等造血相關(guān)標(biāo)志物呈陰性[15]。

DFSC和SCAP因?yàn)榉蛛x自發(fā)育中的牙胚，在體內(nèi)外都表現(xiàn)出更強(qiáng)的分化能力[16]。

1.2 旁分泌效應(yīng)

近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在沒(méi)有分化并直接修復(fù)組織缺損的情況下，仍有一定的治療效果[17]。值得注意的是，僅使用PDLSC的培養(yǎng)基也能促進(jìn)牙周組織的再生[18]。研究[19]表明：間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌豐富的生物活性分子，如生長(zhǎng)因子、趨化因子等，通過(guò)旁分泌效應(yīng)，來(lái)調(diào)節(jié)損傷部位的微環(huán)境，從而抑制細(xì)胞凋亡和炎癥、促進(jìn)血管新生，最終促進(jìn)組織修復(fù)。研究[20]發(fā)現(xiàn)：牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用能夠幫助降低牙周炎患者牙周組織的活性氧自由基，從而緩解牙周炎癥狀。

2 牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的使用方法

間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生治療中通常包含細(xì)胞的分離、體外擴(kuò)增和細(xì)胞的再植3個(gè)步驟。隨著研究的進(jìn)展，干細(xì)胞治療的難點(diǎn)逐漸從間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定轉(zhuǎn)移到間充質(zhì)干細(xì)胞的使用方法[21]。

目前，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的使用方法包括細(xì)胞懸液注射、細(xì)胞膜片、與生物支架聯(lián)合使用等。

2.1 細(xì)胞懸液注射

細(xì)胞懸液注射是指直接將細(xì)胞注入受損的牙周組織，這種方法簡(jiǎn)單且創(chuàng)傷小[21]。Du等[22]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射在局部牙周缺損部位，在受損部位表現(xiàn)出炎癥抑制和免疫調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)了新的牙周組織生成。然而，通過(guò)直接注射的方法，細(xì)胞往往難以定植和分化，而是通過(guò)旁分泌效應(yīng)來(lái)促進(jìn)組織自身修復(fù)，在受損組織部位無(wú)法獲得穩(wěn)定濃度的細(xì)胞或生物活性分子[23]。

近年來(lái)，學(xué)者嘗試用溫敏性的生物材料作為干細(xì)胞的載體，在一定溫度下保持其流動(dòng)性，以方便使用，同時(shí)能在體溫下凝固，使注入的干細(xì)胞在移植位置保持穩(wěn)定。Chien等[24]將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-6用熱敏水凝膠作載體，制成可注射的體系用于大鼠的牙周再生，獲得了良好的效果。Pan等[25]將過(guò)表達(dá)血小板源性生長(zhǎng)因子-BB（platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB）的PDLSC用溫敏水凝膠作載體置入大鼠牙槽骨的缺損部位，表現(xiàn)出良好的促進(jìn)牙槽骨修復(fù)的作用。

2.2 細(xì)胞膜片技術(shù)

細(xì)胞膜片技術(shù)是一種組織培養(yǎng)方法，因其培養(yǎng)過(guò)程不使用酶解，使細(xì)胞間連接、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等組織結(jié)構(gòu)得以保留[26]。Kwon等[27]使用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)基成功將細(xì)胞連同其細(xì)胞外基質(zhì)成片地剝離下來(lái)，并通過(guò)像三明治一樣數(shù)層細(xì)胞堆疊起來(lái)，以構(gòu)建出立體的組織。磁化控制法、電化學(xué)控制法等方法隨后也被成功運(yùn)用于細(xì)胞膜片的獲取[28-29]。使用這種技術(shù)可以將間充質(zhì)細(xì)胞在不使用支架的情況下移植入受損部位，相比傳統(tǒng)支架，細(xì)胞膜片植入產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)更輕，細(xì)胞丟失更少[30]。相較于細(xì)胞懸液注射，細(xì)胞膜片技術(shù)移植的細(xì)胞能夠依靠細(xì)胞外基質(zhì)貼附在移植部位，細(xì)胞間相互連接，能夠存留更長(zhǎng)的時(shí)間，有更高的細(xì)胞存活率[4,31-32]。同時(shí)，與細(xì)胞懸液相比，DFSC細(xì)胞膜片中的礦化相關(guān)基因（堿性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨橋蛋白等）和牙周組織特異性基因（Ⅲ型膠原蛋白、骨膜素）表達(dá)顯著上調(diào)，PDLSC細(xì)胞膜片中也高表達(dá)堿性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨橋蛋白等基因[33]。

實(shí)際運(yùn)用中單獨(dú)使用細(xì)胞膜片往往不能完全填補(bǔ)組織空缺，在許多研究中常與羥磷灰石/磷酸三鈣[34-35]、牛骨[36]、合成水凝膠[37]等支架材料合用，從而提高細(xì)胞膜片在根面的穩(wěn)定性。Wang等[38]構(gòu)建了在根面使用PDLSC細(xì)胞膜片，在牙槽骨面使用從頜骨分離的間充質(zhì)干細(xì)胞膜片，中間填充以富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）的運(yùn)用細(xì)胞膜片技術(shù)的雙相生物膜片，在小鼠體內(nèi)觀察到2個(gè)面分別有牙周膜樣組織和骨樣組織的生成，是否有牙骨質(zhì)的生成還有待進(jìn)一步考證。

將PDLSC用于牙周組織再生的臨床試驗(yàn)，采用的就是細(xì)胞膜片技術(shù)，F(xiàn)eng等[39]于2010年在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中使用自體PDLSC細(xì)胞膜片治療3名牙周炎患者，8周后患者牙周組織得到改善，細(xì)胞膜片周?chē)梢?jiàn)類(lèi)牙骨質(zhì)和類(lèi)牙周膜組織形成。另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[40]中，同樣使用自體PDLSC細(xì)胞膜片，10名患者6個(gè)月后探診深度、臨床附著水平、影像學(xué)骨高度都得到了明顯改善，進(jìn)一步證實(shí)了自體PDLSC細(xì)胞膜片長(zhǎng)期治療中的安全性和有效性。然而，也有臨床研究[41]發(fā)現(xiàn)，使用自體PDLSC細(xì)胞膜片治療與對(duì)照組（GTR）結(jié)果并無(wú)明顯差異。

細(xì)胞膜片在植入受損部位后，高度依賴(lài)于宿主血管長(zhǎng)入，如果血管網(wǎng)絡(luò)不能及時(shí)的生成，堆疊的細(xì)胞缺乏有效的血供而因氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不足以及代謝產(chǎn)物的積累，最終導(dǎo)致組織中央部位的壞死[42]。研究[43]發(fā)現(xiàn)人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）可初步引發(fā)PDLSC細(xì)胞膜片的血管新生。Panduwawala等[44]發(fā)現(xiàn)：不論是將HUVEC和PDLSC共培養(yǎng)后制成細(xì)胞膜片，還是制成PDLSC-HUVECPDLSC分開(kāi)的3層，宿主血管長(zhǎng)入的程度要優(yōu)于PDLSC單獨(dú)制成的細(xì)胞膜片。Zhang等[45]發(fā)現(xiàn)：HUVEC和PDLSC共培養(yǎng)能夠使PDLSC血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成骨相關(guān)基因顯著上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)：PDLSC與頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)形成的細(xì)胞膜片相比于單細(xì)胞膜片，其成骨和細(xì)胞外基質(zhì)生成相關(guān)基因高表達(dá)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了更接近天然組織的結(jié)構(gòu)。

2.3 生物支架材料

支架材料可以通過(guò)改善干細(xì)胞移植效果、提高細(xì)胞移植部位的穩(wěn)定性以及控制細(xì)胞的輸送將間充質(zhì)干細(xì)胞的療效最大化[46-47]。除了降低移植細(xì)胞被沖刷掉的概率，使用材料作為載體還能夠引入額外的生物活性分子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，用來(lái)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在移植部位的生長(zhǎng)和分化[48-49]。

隨著組織工程的發(fā)展，牙周再生中的生物材料已經(jīng)開(kāi)始從簡(jiǎn)單的固定細(xì)胞和緩釋活性分子的單相支架材料，逐步地開(kāi)始模擬牙周的牙骨質(zhì)-牙周膜-牙槽骨的復(fù)合結(jié)構(gòu)。Iwata等[50]用3層PDLSC細(xì)胞膜片貼在牙齒根面后用可降解的聚乙醇酸網(wǎng)架支撐，最后多孔的β-磷酸鈣填補(bǔ)骨缺損，6周后受損部位形成新的骨、牙骨質(zhì)和穿插其中的膠原纖維，實(shí)現(xiàn)了牙周完整的恢復(fù)。

計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和3D打印技術(shù)的發(fā)展給間充質(zhì)干細(xì)胞的運(yùn)送提供了更多可能，能夠制作出更加接近天然牙周組織的混合多相支架[51]，同時(shí)，3D打印技術(shù)能夠針對(duì)各種牙周缺損定制個(gè)性化的支架材料。多相是指材料具有多種結(jié)構(gòu)（孔徑、孔隙形狀、孔隙率等）或多種生化特性[52]。Lee等[53]使用聚己內(nèi)酯和羥磷灰石（9∶1）通過(guò)3D打印技術(shù)制作出區(qū)域特異性的無(wú)縫三相支架，同時(shí)能夠在材料的不同區(qū)域先后釋放生物活性物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化。A相具有100μm的微通道，為牙骨質(zhì)/牙本質(zhì)界面；B相具有600μm的微通道，為牙周膜界面；C相具有300μm的微通道，為牙槽骨界面。A、B、C相分別能夠在不同時(shí)間點(diǎn)釋放釉原蛋白、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、BMP-2，在小鼠體內(nèi)用DPSC做種子細(xì)胞，分化出牙本質(zhì)/牙骨質(zhì)-牙周膜-牙槽骨復(fù)合體。目前，已有利用3D打印技術(shù)制造的含生長(zhǎng)因子的支架用于人牙周組織再生[54]。

3 展望

近年來(lái)，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的研究逐漸開(kāi)始從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)展到人體試驗(yàn)[39-40,55]。安全性是干細(xì)胞應(yīng)用研究中無(wú)法繞開(kāi)的話題。干細(xì)胞潛在的致瘤和促瘤風(fēng)險(xiǎn)備受關(guān)注，包括體外擴(kuò)增過(guò)程中的基因改變、植入體內(nèi)后形成腫瘤以及促進(jìn)已有腫瘤的發(fā)展3個(gè)方面[56]。相對(duì)于胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞致瘤風(fēng)險(xiǎn)較低[57]，但有報(bào)道[58]顯示：在干細(xì)胞移植數(shù)年后出現(xiàn)了原干細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，提示學(xué)者們對(duì)干細(xì)胞的安全性需要進(jìn)行長(zhǎng)期觀察和評(píng)估。此外，移植后的免疫排斥反應(yīng)也是干細(xì)胞應(yīng)用中的問(wèn)題。牙源性干細(xì)胞的免疫原性低，且自身有免疫調(diào)節(jié)能力，使同種異體干細(xì)胞移植成為可能。

牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞因具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)似的自我更新和分化能力，且更易獲取的特點(diǎn)，成為牙周組織修復(fù)的研究熱點(diǎn)。牙周組織復(fù)雜的軟硬組織結(jié)構(gòu)一直是牙周組織修復(fù)的難點(diǎn)。近年來(lái)，隨著3D打印等技術(shù)的發(fā)展、細(xì)胞膜片技術(shù)的成熟、多相生物支架的運(yùn)用，同時(shí)，對(duì)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程的進(jìn)一步了解，距離實(shí)現(xiàn)真正的牙周組織再生越來(lái)越近。與此同時(shí)，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)[59]、外泌體[60]、培養(yǎng)基[18]等非細(xì)胞成分也被證明具有促進(jìn)牙周組織修復(fù)的作用，給研究者提供了實(shí)現(xiàn)牙周組織修復(fù)的另一種可能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。