鈦種植體表面銀納米顆粒負(fù)載方法的進(jìn)展

朱俊瑾 王劍

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院修復(fù)科 成都610041

種植義齒是牙列缺損、牙列缺失的常見修復(fù)方法，其中鈦種植體因其高強(qiáng)度、耐用性和良好的生物相容性而廣泛應(yīng)用于種植修復(fù)中[1]。但是鈦種植體本身不具備抗菌性能，若發(fā)生細(xì)菌感染并進(jìn)展至種植體周圍炎，則會(huì)引起種植體周骨質(zhì)喪失，組織愈合不良，最終可能導(dǎo)致整個(gè)種植治療失敗。因此，需要在鈦種植體上構(gòu)建抗感染表面以增強(qiáng)其抗菌能力，降低種植體失敗的可能性。

與牙周炎相似，種植體周圍炎中能檢出較多的革蘭陰性厭氧菌，此外還可檢出其他幾種微生物，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌[2]。已有研究嘗試在鈦表面加載抗生素如萬(wàn)古霉素[3]、慶大霉素[4]等，以降低種植體植入后的感染風(fēng)險(xiǎn)，然而，傳統(tǒng)的抗生素會(huì)因?yàn)榧?xì)菌耐藥性而失效，且針對(duì)的微生物數(shù)量有限，無(wú)法對(duì)抗多種感染[5-6]，仍會(huì)導(dǎo)致種植失敗。因此，金屬納米粒子作為抗菌劑的研究受到了廣泛的關(guān)注。其中，銀納米顆粒（silver nanoparticle，Ag NP）有其經(jīng)久不衰的生命力，至今約有130年的歷史[7]。它的抗菌譜廣、耐藥性很低，可以殺死多種細(xì)菌并在生理?xiàng)l件下保持穩(wěn)定[8-9]。它可通過與微生物表面直接接觸或局部釋放Ag+，從而高效殺死細(xì)菌[10]。然而研究表明，它對(duì)哺乳動(dòng)物可能具有細(xì)胞毒性[11-12]，釋放的Ag+會(huì)由于對(duì)硫、氮的親和力而干擾細(xì)胞活動(dòng)過程[13]。為此，近10年來(lái)研究人員關(guān)于鈦基表面負(fù)載Ag NP方面進(jìn)行了大量的研究，通過調(diào)整摻銀方法或添加其他物質(zhì)，在保證鈦種植體高效抗菌性能的同時(shí)避免Ag NP的細(xì)胞毒性。

本文綜述了目前在鈦種植體表面負(fù)載Ag NP的主要制備方法及其優(yōu)缺點(diǎn)，并針對(duì)如何優(yōu)化Ag NP的負(fù)載量和降低細(xì)胞毒性方面進(jìn)行了方法總結(jié)，為鈦種植體負(fù)載Ag NP的抗菌研究提供參考。

1 物理方法負(fù)載Ag NP

常見的物理方法有等離子體浸沒離子注入（plasma immersion ion implantation，PIII）和濺射法。其工藝流程簡(jiǎn)單、快速，得到的Ag NP純度較高，但是對(duì)設(shè)備要求較高、生產(chǎn)成本高。此外，由于Ag NP與基材間具有較強(qiáng)的結(jié)合力，不易釋放Ag+，故物理方法負(fù)載的Ag NP主要以接觸殺菌機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗菌作用。

1.1 PIII技術(shù)

PIII技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)材料或設(shè)備的表面改性[14]。等離子體源經(jīng)負(fù)高壓脈沖在材料基體周圍形成一個(gè)等離子體鞘層，加速的正離子從各個(gè)方向垂直轟擊材料基體并注入基體表面，形成一層富集注入元素的改性層[15]。銀等離子體浸沒離子注入（silver plasma immersion ion implantation，Ag-PIII）可在鈦表層形成Ag NP改性層，由于改性層與材料基體間沒有明確界限，故Ag NP與鈦基體結(jié)合緊密[8]，使Ag NP活動(dòng)受限，避免了Ag+累積釋放引起的細(xì)胞毒性[16]。該技術(shù)還能精確調(diào)控注入量與區(qū)域，通過調(diào)整Ag-PIII參數(shù)改變Ag NP的直徑，可直接影響Ag NP的殺菌效果。Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)，粒徑呈2 nm和11~12 nm雙峰分布的Ag NP，對(duì)金黃色葡萄球菌和具核梭桿菌的殺菌效果要明顯大于粒徑為4~6 nm的Ag NP。然而，通過Ag-PIII負(fù)載的Ag NP大多是通過接觸殺菌機(jī)制，主要對(duì)黏附細(xì)菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抗生物膜活性，由于Ag+釋放少，故對(duì)游離細(xì)菌的殺菌作用較弱[18]。此外，Ag-PIII工藝帶來(lái)的牢固結(jié)合力，在消除Ag NP毒副作用的同時(shí)，還能促進(jìn)骨形成。特定粒徑范圍（4~25 nm）的Ag NP可激活大鼠骨髓干細(xì)胞中整合素α5調(diào)控的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì) 胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein ki‐nase，ERK）信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)鈦的骨整合[18-19]。同時(shí)，Ag NP和鈦基質(zhì)間的微電流效應(yīng)[8]或由電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）[20]，既賦予鈦板較強(qiáng)的抗菌活性，又能促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和增殖。但這也會(huì)使得鈦樣品表面測(cè)得的腐蝕電流增加，樣品的耐腐蝕能力會(huì)略有下降[8,20]。

1.2 濺射法

濺射法作為原子逐層沉積工藝，是在真空室內(nèi)以電流電離惰性氣體，高速氣體離子轟擊靶材得到濺射粒子，濺射粒子到達(dá)基材，并經(jīng)過吸附、凝結(jié)、表面擴(kuò)散遷移、碰撞結(jié)合形成穩(wěn)定晶核，具有較低的工藝溫度，較高的沉積速率和相對(duì)較高的膜與膜之間的結(jié)合強(qiáng)度等特點(diǎn)[21]。使用直流等離子體濺射，數(shù)分鐘內(nèi)可在鈦表面形成Ag NP，且隨著濺射時(shí)間增加，鈦基材上沉積的銀含量增加。Kheur等[22]使用直流濺射技術(shù)，在氮?dú)猸h(huán)境下，5 min內(nèi)即可在鈦盤上沉積6 μg·mm-2的Ag NP，在6 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)黏附的變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的強(qiáng)抗菌活性。然而，濺射法產(chǎn)生的抗菌活性主要針對(duì)黏附細(xì)菌，對(duì)游離細(xì)菌的抗菌活性并不明確[23-24]，這可能與強(qiáng)結(jié)合力導(dǎo)致銀釋放受限有關(guān)。針對(duì)物理方法引起的Ag+釋放量低等現(xiàn)象，Abuayyash等[25]通過在鈦表面相繼濺射鉑和銀，形成以銀為犧牲陽(yáng)極的體系，通過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)原理促進(jìn)銀的溶解和釋放，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)游離細(xì)菌更高的抗菌活性，然而該溶解過程會(huì)對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cell，hM‐SC）的細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響，但作者指出，Ag NP的快速溶解受載銀量影響而具有自限性，在它溶解后，組織細(xì)胞的黏附可再次發(fā)生。

2 化學(xué)方法制備含Ag NP涂層

迄今為止，使用化學(xué)方法在鈦基材上負(fù)載Ag NP仍是最廣泛、最經(jīng)濟(jì)的方法，它對(duì)設(shè)備的要求不高，一般是將鈦基材浸入含有銀鹽的溶液中，然后用還原劑、紫外光等將Ag+轉(zhuǎn)化為Ag NP，或者采用電化學(xué)沉積、自組裝技術(shù)負(fù)載Ag NP。這些方法制備的Ag NP通常與基材間的結(jié)合力較弱，因此更容易釋放且易氧化生成Ag+，進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)引起大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶和核苷酸）的失活，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[26]，但是其較高的突釋量可能帶來(lái)細(xì)胞毒性問題。

2.1 化學(xué)還原法

化學(xué)還原法是在鈦表面制備Ag NP的簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的方法，在水或有機(jī)溶劑中，銀鹽前驅(qū)體、還原劑、溶劑、穩(wěn)定劑在適當(dāng)條件下反應(yīng)，在鈦表面還原出銀單質(zhì)。硝酸銀是使用最廣泛的銀鹽前體，而檸檬酸鈉、乙二醇、抗壞血酸、硼氫化鈉（NaBH4）、Tollens試劑、N, N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）等則是最常見的還原劑[27]。使用Tollens試劑改性鈦圓片，0.05 mg·L-1的Ag+即可對(duì)變異鏈球菌、唾液鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等多種細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌能力，足以抑制革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌，然而浸泡在Tollens試劑中的時(shí)間越長(zhǎng)，負(fù)載的銀含量越多，早期突釋現(xiàn)象也越明顯，當(dāng)Ag+釋放的質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg·L-1，會(huì)使人成骨細(xì)胞的活力顯著下降[28]。由于化學(xué)還原法制備的Ag NP產(chǎn)量低，使用的試劑如NaBH4、DMF等為有毒化學(xué)物質(zhì)，會(huì)對(duì)環(huán)境和生物體構(gòu)成威脅，近10年來(lái)已少有使用。有學(xué)者嘗試其他更為安全的還原劑，例如Gunputh等[29]提出用δ-葡萄糖酸內(nèi)酯作為還原劑，通過順序添加法可在TiO2表面將AgNO3還原為Ag NP，細(xì)菌實(shí)驗(yàn)表明其載銀鈦樣品具有強(qiáng)抗菌性能，然而其生物細(xì)胞安全性仍需進(jìn)一步的研究。

2.2 光還原法

光還原法一般是用紫外光對(duì)浸沒在AgNO3溶液中的鈦基材照射30~60 min，從而將鈦表面Ag+轉(zhuǎn)化為Ag NP[9,30-34]，可在鈦表面均勻分布[31,34-35]。該方法避免了化學(xué)試劑的不良反應(yīng)而逐漸受到人們的推崇。然而這樣負(fù)載的Ag NP量較少，且與鈦表面的結(jié)合力弱，容易出現(xiàn)早期突釋現(xiàn)象，無(wú)法賦予鈦種植體長(zhǎng)期的抗菌性能?；诖耍瑢W(xué)者們[36-37]對(duì)鈦基材表面進(jìn)行陽(yáng)極氧化，通過形成均勻有序的TiO2納米管（TiO2nanotube，TNT）陣列，將Ag NP容納于內(nèi)部來(lái)增加Ag NP的負(fù)載量，殺菌效果可長(zhǎng)達(dá)30 d。此外，學(xué)者們也嘗試在鈦基材上增加負(fù)電荷來(lái)負(fù)載更多的Ag+。一些學(xué)者[9,33]根據(jù)氧化石墨烯（graphene oxide，GO）帶負(fù)電荷的性質(zhì)，在鈦板上電鍍GO，通過增加GO濃度可增加負(fù)載的Ag+含量，然后經(jīng)紫外光還原形成Ag NP，從而使鈦樣本表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗生物膜黏附性能和抗菌性能。然而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[33]表明，載GO-Ag的鈦板會(huì)影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活力。

2.3 電化學(xué)沉積法

電化學(xué)沉積是指在電場(chǎng)作用下，通過電解質(zhì)溶液的化學(xué)反應(yīng)，使溶液中的離子沉積到陰極或陽(yáng)極表面上形成薄膜或涂層的過程，需要控制溶液pH值、溫度、濃度、電流等條件來(lái)控制沉積層的厚度、組成及結(jié)構(gòu)等。其操作簡(jiǎn)單、成本低廉、環(huán)境安全，但是制備理想的、復(fù)雜組成的薄膜材料較為困難，應(yīng)用不當(dāng)?shù)膮?shù)會(huì)使材料表面載銀異常。在高電壓、高電流、長(zhǎng)時(shí)間及高濃度Ag+條件下，制備出的載銀試樣表面會(huì)附著大小不均的銀顆粒，且附著強(qiáng)度低，甚至無(wú)法耐受超聲清洗[38]。然而有研究[39]表明，在銀層表面進(jìn)一步涂覆羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）可減少銀的脫落率，提高鈦樣品的抗菌性能。使用陽(yáng)極氧化和電沉積法在鈦種植體上制備含銀的超疏水性表面可降低Ag+的早期突釋，同時(shí)抑制細(xì)菌黏附[40]。

2.4 自組裝技術(shù)

自組裝技術(shù)是一種以基本結(jié)構(gòu)單元自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)的綠色、經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。使用逐層（layerby-layer，LBL）自組裝可在基板上涂覆功能性薄膜，該方法通過沉積帶相反電荷的聚電解質(zhì)的交替層[41]，可在鈦表面構(gòu)造含Ag NP的連續(xù)抗菌涂層[42-43]，具有簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但涂層穩(wěn)定性仍需改善。Zhong等[42]以相轉(zhuǎn)移溶菌酶作為鈦表面底漆，然后通過自組裝技術(shù)以殼聚糖/透明質(zhì)酸負(fù)載Ag NP，形成的抗菌涂層可在4 d內(nèi)完全殺死非附著細(xì)菌和附著細(xì)菌，14 d后的抗菌效果也可達(dá)65%~90%。但是隨著含銀量增加，溶液中累積的銀濃度升高，樣品的細(xì)胞毒性越明顯。然而，當(dāng)Zhang等[44]以LBL技術(shù)將多巴改性的藻酸鹽/殼聚糖涂覆在鈦合金表面，然后將Ag NP原位沉積在多層結(jié)構(gòu)中，由于多巴改性后的涂層具有兒茶酚等較多的有機(jī)官能團(tuán)，更具生物相容性，因此在實(shí)現(xiàn)抗細(xì)菌黏附作用的同時(shí)，能夠提高細(xì)胞活力。

3 生物方法制備Ag NP涂層

生物方法主要使用生物分子的黏附性能負(fù)載Ag NP，其反應(yīng)條件溫和，具有生產(chǎn)成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，但投入時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要花費(fèi)數(shù)天時(shí)間。

海洋生物貽貝可以牢固地黏附在大多數(shù)基質(zhì)上，強(qiáng)大黏附力的關(guān)鍵因素是貽貝蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中多巴和賴氨酸富集蛋白，其中，含兒茶酚的多巴及其衍生物不僅可以牢固附著在材料上，形成穩(wěn)定的表面涂層，并且還可以充當(dāng)還原劑還原金屬離子[45-47]。聚多巴胺（polydopamine，PDA）可將Ag NP裝載到鈦板上或TiO2納米管上以殺死細(xì)菌[47-48]，90 °C水浴條件可明顯縮短形成PDA涂層的反應(yīng)時(shí)間[47]。Cheng等[49]通過合成水溶性的含兒茶酚胺的殼聚糖（chitosan，CS），在鈦板表面形成涂層，然后浸泡于17 mg·mL-1AgNO3溶液中，將表面Ag+原位還原，抑菌數(shù)量達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)（金黃色葡萄球菌量從107到104，大腸桿菌量從106到103），且未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。此外，多巴胺及其衍生物還能夠在材料表面黏固一些生物活性物質(zhì)（如HA、CS和金屬基質(zhì)）形成雜化涂層，賦予鈦種植體更好的抗菌活性、生物相容性和促成骨活性[30,47,50]。例如，CS上帶有豐富的氨基和羥基，可作為金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)[51]，充當(dāng)Ag NP和Ag+的理想螯合劑[52]，發(fā)揮穩(wěn)定釋放Ag+的作用。

4 多種技術(shù)復(fù)合運(yùn)用以優(yōu)化Ag NP 的負(fù)載量和降低細(xì)胞毒性

目前，在鈦種植體表面負(fù)載Ag NP的方法眾多，但主要是圍繞Ag+早期突釋、釋放時(shí)間較短引起的遠(yuǎn)期殺菌能力弱和潛在的細(xì)胞毒性問題展開，負(fù)載的Ag NP應(yīng)在有效殺滅病原體和組織生物相容性之間達(dá)到平衡。故在前述負(fù)載方法的基礎(chǔ)上，學(xué)者們復(fù)合多種技術(shù)來(lái)優(yōu)化Ag NP的負(fù)載情況，主要從優(yōu)化負(fù)載量和降低細(xì)胞毒性兩方面進(jìn)行改良。

4.1 優(yōu)化鈦種植體上Ag NP的負(fù)載量

使用化學(xué)方法負(fù)載Ag NP通常會(huì)存在Ag NP負(fù)載量不足或負(fù)載不穩(wěn)定等問題，故多數(shù)學(xué)者對(duì)鈦種植體表面進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，例如使用陽(yáng)極氧化、等離子體電解氧化（plasma electrolytic oxidation，PEO）等，在鈦基材上形成具有微/納米孔隙的鈦氧化物層，充當(dāng)Ag NP的儲(chǔ)層，并通過前述的負(fù)載方法，從而增加Ag NP的負(fù)載量和負(fù)載穩(wěn)定性。若結(jié)合選擇性激光熔化（selective laser melting，SLM）技術(shù)，在Ti-6Al-4V種植體上設(shè)計(jì)合理的多孔結(jié)構(gòu)，可明顯增加Ag NP附著的表面積，Ag+釋放時(shí)長(zhǎng)可持續(xù)至少28 d，獲得更強(qiáng)的殺菌效果和抗生物膜形成能力[53-54]。類似的，優(yōu)化負(fù)載Ag NP的涂層表面積和形態(tài)也可提高載銀效率，Tian等[55]通過在Ti-6Al-4V鈦合金基底上制備具有定向塊陣列的HA涂層，改變了表面電荷和比表面積，提高了載銀效率，并具有較強(qiáng)的殺菌和抗生物膜形成作用，還能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)黏附、分化和礦化。此外，在鈦表面形成具有較強(qiáng)黏附力的涂層以增加Ag+的附著也是常用的方法， PDA涂層常用以黏附Ag+，它以兒茶酚作為溶液中Ag+的螯合劑，在鈦樣品充分浸泡于銀鹽溶液中后，結(jié)合紫外光還原法，可在表面沉積更高密度的Ag NP[32,47]。另外，通過提高Ag+的還原效率也可增加鈦種植體上Ag NP的負(fù)載量。

4.2 降低Ag+的細(xì)胞毒性

首先，設(shè)計(jì)合理濃度的含Ag+溶液進(jìn)行Ag NP負(fù)載是必要的，在此基礎(chǔ)上，可選擇具有強(qiáng)黏附力的物質(zhì)（如PDA）作為載銀涂層，或在含銀涂層上繼續(xù)加載生物活性物質(zhì)（如CS[30,34]、HA[56]），或者二者兼施以減緩銀的釋放。Xie等[50]在載銀前后分別涂覆PDA和CS，該雙重螯合作用顯著降低了雜化涂層中銀的釋放。Yuan等[36]在基于殼聚糖的氨基與海藻酸鹽的醛基之間的共價(jià)結(jié)合和LBL的靜電相互作用，將殼聚糖和海藻酸鹽加載到載有Ag NP的TNT陣列上，完全覆蓋TNT-Ag的納米孔結(jié)構(gòu)，有效防止初始階段的Ag+突釋，能顯著降低細(xì)胞毒性，同時(shí)抑制細(xì)菌黏附。

此外，添加某些金屬元素或可降低Ag NP的細(xì)胞毒性。有研究[21]報(bào)道，在載銀鈦板上加入鍶（Sr）元素，可減輕Ag潛在的細(xì)胞毒性，同時(shí)保持其最佳抗菌性能。這與Sr競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)了細(xì)胞上特定的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。同時(shí)引入Sr和Ag還可顯著改善改性層的耐蝕性。此外，在鈦植體上同時(shí)載入鋅（Zn）和Ag，可降低Ag+的釋放速率，這是由于Zn的摻入會(huì)減少Ag的負(fù)載，并且鈦種植體表面Zn與Ag的微電流耦合作用可抑制Ag NP氧化及隨后Ag+的釋放，然而這并不影響鈦樣品的抗菌性能，結(jié)果[54]顯示種植體周圍仍能形成抑菌區(qū)。

5 小結(jié)

在鈦種植體上加載Ag NP對(duì)于預(yù)防種植體周圍炎的發(fā)生及進(jìn)展十分重要，目前已有多種技術(shù)用于負(fù)載Ag NP，包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法，盡管各方法仍存在些許不足，但研究人員通過調(diào)控鈦基或鈦基上載銀涂層的結(jié)構(gòu)形態(tài)，加入其他成分如生物活性物質(zhì)或金屬元素等，結(jié)合多種技術(shù)，可調(diào)節(jié)鈦基表面Ag NP的負(fù)載量及涂層的穩(wěn)定性，控制Ag+的釋放，提高了抗菌效果且減少或避免了細(xì)胞毒性。目前，關(guān)于探究載Ag NP鈦種植體對(duì)體內(nèi)環(huán)境影響的研究逐漸增多，人們可以更加充分地認(rèn)識(shí)到Ag NP的抗菌效果和細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)，隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)技術(shù)的快速發(fā)展，在鈦種植體上實(shí)現(xiàn)低成本、高效率地負(fù)載含Ag NP涂層的趨勢(shì)也有助于加快這一研究進(jìn)程。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。