• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    尼古丁對口腔細菌單獨或混合培養(yǎng)時菌群數(shù)目調(diào)控的研究

    2021-05-17 10:09:38李詩佳陳秋宇鄒靜黃睿潔
    國際口腔醫(yī)學雜志 2021年3期
    關鍵詞:浮游尼古丁生物膜

    李詩佳 陳秋宇 鄒靜 黃睿潔

    口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心

    四川大學華西口腔醫(yī)院兒童口腔科 成都610041

    尼古丁是一種存在于煙草中的生物堿,約占煙草干重的0.6%~3.0%。尼古丁可以侵入人體的多種系統(tǒng),導致心血管疾病、癌癥和其他系統(tǒng)性疾病[1]。同時,尼古丁也可促進口腔疾病,如口腔癌、牙周病和齲齒[2]的發(fā)生。健康口腔具有高度的多樣性和特異性,具有獨特的口腔核心微生物群[3]。2005年,Aas等[3]檢測口腔正常菌群,結果發(fā)現(xiàn):正??谇恢杏?00多種細菌或系統(tǒng)類型,其中大多數(shù)細菌于人類而言是友好的共生菌,是維持健康重要的組成部分。一些學者[4]曾提出:有益菌和致病菌之間的競爭導致了人類的健康或疾病狀態(tài)。Ebersole等[5]發(fā)現(xiàn):吸煙者菌群變化較大,如鏈球菌屬、嗜酸性細菌屬、口桿菌屬和真細菌屬明顯增多,而纖細菌門和螺旋體菌門的數(shù)量明顯減少。Shiloah等[6]還發(fā)現(xiàn):吸煙的量會影響口腔致病菌的定植量。在常見口腔細菌的體外實驗中,尼古丁對變異鏈球菌的研究較多。前期研究[7-8]發(fā)現(xiàn):尼古丁可以促進變異鏈球菌和格氏鏈球菌生物膜的形成和生物膜的代謝活性。當血鏈球菌和變異鏈球菌單獨培養(yǎng)時,尼古丁可以同時促進2種菌的生長;而2種菌混合培養(yǎng)時,隨尼古丁質(zhì)量濃度的增加,變異鏈球菌的相對數(shù)量增加而血鏈球菌的數(shù)目下降,提示尼古丁的質(zhì)量濃度和其他細菌的存在均可影響細菌的生長[9]。除了尼古丁會對細菌數(shù)量產(chǎn)生影響,在混合菌種情況下,細菌相互之間也存在競爭關系。Kreth等[10]發(fā)現(xiàn):變異鏈球菌對格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、血鏈球菌的抑制活性顯著,對口腔鏈球菌的抑制活性中等;同樣,血鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌也可抑制變異鏈球菌的生長,但抑制原理和抑制強度有所不同,血鏈球菌和格氏鏈球菌通過產(chǎn)生過氧化氫抑制變異鏈球菌的生長[11],而口腔鏈球菌則通過更快的繁殖速度與變異鏈球菌競爭[12]。

    由于口腔細菌種類繁多,相互作用復雜,在多菌群環(huán)境中尼古丁是否會改變菌群平衡,是否依然可以促進變異鏈球菌的生長不詳。本研究擬采用混合模型模擬口腔菌群狀態(tài),研究尼古丁對包括變異鏈球菌在內(nèi)的細菌的影響。由于口腔細菌種類繁多,本研究主要納入口腔常見共生菌細菌(格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌)、口腔齲病及牙髓病細菌(變異鏈球菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌)和口腔內(nèi)檢出率較低的卻具備潛在致病能力的細菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)。

    1 材料和方法

    1.1 菌株和培養(yǎng)基

    1.1.1 實驗菌株 變異鏈球菌(ATCC 700610/UA159)、格氏鏈球菌(ATCC 35105)、緩癥鏈球菌(ATCC 49456)、口腔鏈球菌(ATCC 35037)、唾液鏈球菌(ATCC 27975)、血鏈球菌(SK36)、金黃色葡萄球菌(COL)、糞腸球菌(ATCC 29212)、干酪乳桿菌(ATCC 393)、表皮葡萄球菌(PR62A)。

    1.1.2 培養(yǎng)條件 細菌解凍前,在25%的甘油中凍存于-80 ℃。細菌復蘇于心腦浸液(brain heart in‐fusion,BHI)加0.5%酵母提取物(yeast extract,YE)并含5%羊血的平板上。如無特殊說明,細菌的培養(yǎng)及浮游細菌的檢測使用BHI+5%YE培養(yǎng)基。在細菌的生物膜培養(yǎng)中,使用BHI+YE+1%蔗糖培養(yǎng)基。在厭氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),氣體環(huán)境為5%CO2、85%N2、10%H2,37 ℃。

    1.2 方法

    1.2.1 確定尼古丁分別對10 種單獨培養(yǎng)細菌浮游細 胞 的 影 響 1×107CFU·mL-1[CFU (colonyforming units)為菌落形成單位]細菌在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+5%YE培養(yǎng)基中,于96孔板中培養(yǎng)24 h,氣體環(huán)境為5% CO2、85% N2、10%H2,37 ℃。后利用Molecular Devices Spectra‐Max 190酶標儀測細菌每孔的光密度(optical den‐sity,OD)(OD595nm),每個質(zhì)量濃度平行重復3次。

    1.2.2 確定尼古丁分別對10 種混合培養(yǎng)細菌浮游細胞的影響 各自密度為1×106CFU·mL-1的10種細菌混合后(混合后總菌液密度為1×107CFU·mL-1),在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+5%YE培養(yǎng)基中,于96孔板中培養(yǎng)24 h,氣體環(huán)境為5% CO2、85%N2、10%H2,37 ℃。每個質(zhì)量濃度平行重復3次。參考Huang等[13]設計的10種細菌的特異性引物(表1)來擴增特異性序列。24 h培養(yǎng)結束后,離心并收集細菌,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次。每個樣品加入DNeasy 96 Blood&Tissue Kit(QIAGEN公司,美國)的Buf‐fer AL,然后超聲震蕩10 s(52%振幅,聲波分解器,模式500),在冰上重復5次。其余DNA提取步驟按照制造商的指示進行。使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific公司,美國)檢測DNA的數(shù)量和質(zhì)量。使用特異性引物(0.25 μmol·mL-1)和TaKaRa Taq 聚 合 酶(Chemicon International 公司,美國)擴增每個菌株的總DNA(100 ng)。初始化步驟為94 ℃、5 min,擴增步驟為30個循環(huán),94 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、30 s,最終延伸步驟為72 ℃、10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認、證明。細菌定量前,參考Huang等[13]的報道繪制Ct-CFU標準曲線[13],后根據(jù)Ct值計算混合菌群中各菌數(shù)量。

    表1 10種細菌的特異性引物Tab 1 Specific primers for ten bacteria species

    1.2.3 確定尼古丁分別對10 種單獨培養(yǎng)細菌生物膜的影響 1×107CFU·mL-1細菌在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+YE+1%蔗糖培養(yǎng)基中,于96孔板中培養(yǎng)24 h,氣體環(huán)境為5%CO2、85%N2、10%H2,37 ℃,每個質(zhì)量濃度平行重復3次。培養(yǎng)結束后,棄去上清液,保留孔板底部生物膜。PBS輕輕洗滌生物膜2次,4%甲醇固定生物膜30 min,PBS輕輕洗滌清除甲醇,用1%結晶紫溶液染色20 min,PBS輕輕洗滌3次,以去除盡未黏附的結晶紫,室溫晾干后加入無水乙醇靜置20 min,然后將含有從生物膜中萃取結晶紫的乙醇溶液轉移到新的96孔板中,于酶標儀上檢測其光密度(OD490nm)。

    1.2.4 確定尼古丁分別對10 種混合培養(yǎng)細菌生物膜的影響 各自密度為1×106CFU·mL-1的10種細菌混合后(混合后總菌液密度為1×107CFU·mL-1),在含0、2、4 mg·mL-1尼古丁的BHI+YE+1%蔗糖培養(yǎng)基中,于96孔板中培養(yǎng)24 h,氣體環(huán)境為5%CO2、85% N2、10% H2,37 ℃,每個質(zhì)量濃度平行重復3次。培養(yǎng)結束后,棄去上清液,保留孔板底部生物膜,PBS輕輕洗滌生物膜2次,如1.2.2提取總DNA,行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)擴增,并計算混合菌群中各菌數(shù)量。

    1.3 統(tǒng)計學處理

    每項實驗都獨立重復3次以上,統(tǒng)計方法應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行單因素的方差分析,使用post-hoc進行組間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 單獨培養(yǎng)浮游細胞的情況

    實驗的10種菌其浮游細胞生長情況多表現(xiàn)為尼古丁依賴。其中,在尼古丁存在的情況下,格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌和干酪乳桿菌浮游細胞的生長明顯受到促進,且尼古丁的質(zhì)量濃度為0~4 mg·mL-1,浮游細胞的數(shù)量與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關。變異鏈球菌、唾液鏈球菌和表皮葡萄球菌浮游細胞的數(shù)量在尼古丁存在時變化不明顯,金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著下降。血鏈球菌浮游細胞數(shù)量在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時明顯增加,在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時則呈下降趨勢(圖1)。

    2.2 混合培養(yǎng)浮游細胞的情況

    混合培養(yǎng)浮游細胞時,在尼古丁存在的情況下,格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌、唾液鏈球菌、表皮葡萄球菌的浮游細胞數(shù)量明顯增加,且格氏鏈球菌、唾液鏈球菌、表皮葡萄球菌浮游細胞數(shù)量與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關(0~4 mg·mL-1)。干酪乳桿菌浮游細胞數(shù)量在尼古丁存在的情況下明顯減少,且與尼古丁質(zhì)量濃度呈負相關。變異鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌數(shù)量無顯著改變。血鏈球菌、金黃色葡萄球菌浮游細胞的數(shù)量在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時無顯著變化,在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時增加(圖2)。

    在混合培養(yǎng)的10種浮游細胞中,表皮葡萄球菌數(shù)量極低。糞腸球菌和口腔鏈球菌浮游細胞數(shù)量最多,在各種尼古丁質(zhì)量濃度下約占浮游細胞總量的80%,且隨尼古丁質(zhì)量濃度增加,其占比略微下降。干酪乳桿菌、變異鏈球菌和血鏈球菌數(shù)量最少,這3種細菌浮游細胞數(shù)量之和在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占浮游細胞總量不足5%,且隨尼古丁質(zhì)量濃度增加,其占比略微升高。變異鏈球在各尼古丁質(zhì)量濃度組均為1%左右。格氏鏈球菌、唾液鏈球菌的占比隨尼古丁質(zhì)量濃度增加而增高。緩癥鏈球菌的占比在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時增高,在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時降低(圖2、3)。

    圖 1 10種細菌單獨浮游培養(yǎng)24 h后的生長情況Fig 1 Growth of 10 species of bacteria after individual planktonic culture for 24 h

    圖 2 10種細菌混合浮游培養(yǎng)24 h后的生長情況Fig 2 Growth of 10 species of bacteria after mixed planktonic culture for 24 h

    圖 3 經(jīng)不同質(zhì)量濃度尼古丁處理的10種細菌混合浮游細胞培養(yǎng)24 h后數(shù)量的占比情況Fig 3 Proportion of 10 species of bacteria after mixed planktonic culture for 24 h with different concentrations of nicotine

    2.3 單獨培養(yǎng)生物膜細胞的情況

    與細菌單獨培養(yǎng)浮游細胞的情況相似,實驗的10種細菌其生物膜形成情況多表現(xiàn)為尼古丁依賴。變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、干酪乳桿菌、表皮葡萄球菌生物膜形成情況在尼古丁存在時明顯受到促進,且其促進作用與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關。緩癥鏈球菌生物膜形成在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時無顯著改變,在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時有抑制趨勢(差異無統(tǒng)計學意義)。金黃色葡萄球菌生物膜形成情況在尼古丁存在時明顯受到抑制。糞腸球菌生物膜形成情況與尼古丁無明顯相關(圖4)。

    圖 4 10種細菌單獨培養(yǎng)24 h后生物膜的形成情況Fig 4 Biofilm formation of 10 species of bacteria after individual culture for 24 h

    2.4 混合培養(yǎng)生物膜細胞的情況

    混合培養(yǎng)生物膜細胞時,變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌的生物膜細胞數(shù)量在尼古丁存在的情況下明顯增加,且變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌生物膜細胞數(shù)量與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關(0~4 mg·mL-1)。在尼古丁存在時,緩癥鏈球菌、金黃色葡萄球菌生物膜細胞數(shù)量呈減少趨勢,干酪乳桿菌生物膜細胞數(shù)量顯著減少,且這3種菌都與尼古丁質(zhì)量濃度呈負相關(圖5)。

    在混合培養(yǎng)的10種生物膜細胞中,表皮葡萄球菌數(shù)量極低??谇绘溓蚓图S腸球菌生物膜細胞數(shù)量最多,在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占生物膜細胞總量超過80%??谇绘溓蚓疃?,隨尼古丁質(zhì)量濃度增加,其占比下降;其次為糞腸球菌,隨尼古丁質(zhì)量濃度增加,其占比升高。唾液鏈球菌在無尼古丁存在的情況下占生物膜細胞總量的9%,其占比在尼古丁質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1時輕微增高,在尼古丁質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時輕微降低。變異鏈球菌、血鏈球菌、干酪乳桿菌、格氏鏈球菌、緩癥鏈球菌數(shù)量最少,這5種細菌生物膜細胞數(shù)量之和在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占生物膜細胞總量不超過6%(圖5、6)。

    圖 5 10種細菌混合培養(yǎng)24 h后生物膜的形成情況Fig 5 Biofilm formation of 10 species of bacteria after mixed culture for 24 h

    圖 6 經(jīng)不同質(zhì)量濃度尼古丁處理的10種細菌混合培養(yǎng)24 h后生物膜的占比情況Fig 6 Proportion of biofilm of 10 species of bacteria after mixed culture for 24 h with different concentrations of nicotine

    3 討論

    現(xiàn)代口腔生物學認為,齲病在本質(zhì)上是口腔菌群生態(tài)失衡導致的。在外來致病因素的影響下,牙菌斑內(nèi)致齲菌的比例將會異常升高,而有益菌的比例則會隨之下調(diào)[14]。吸煙是導致齲病的重要原因之一,作為煙草的主要成分,尼古丁在齲病發(fā)生、發(fā)展過程中有其獨特的病理作用,其機制可能是尼古丁刺激變異鏈球菌浮游細胞葡糖基轉移酶(glucosyltransferase,Gtf)和葡聚糖結合蛋白(glucan-binding protein,Gbp)的表達,導致更多的浮游細胞附著在牙齒生物膜上,從而促進齲病的發(fā)展[15]。口腔微環(huán)境十分復雜,與齲病相關的病原菌多種多樣,細菌之間也存在競爭、共生等密切的相互作用[16],因此,研究尼古丁對混合菌群的作用是非常重要的。本實驗選取10種口腔中具有代表性的細菌種類進行研究,對以往實驗進行了有力的拓展與補充。

    如上所述,細菌在口腔中有浮游細胞和生物膜細胞2種形式,兩者蛋白質(zhì)表達不盡相同,代謝活動也有所差異[17]。在真實的口腔環(huán)境中,生物膜是大多數(shù)細菌的首選生長形式,因此,研究尼古丁對口腔致齲菌生物膜的影響是十分必要的。結果顯示:在尼古丁培養(yǎng)時,變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、干酪乳桿菌、表皮葡萄球菌生物膜形成情況明顯受到促進,其中變異鏈球菌、干酪乳桿菌等致齲菌的活躍可能在一定程度上解釋了吸煙者患齲的風險更高。相比之下,尼古丁誘導浮游細胞生長上調(diào)的能力似乎不那么顯著。變異鏈球菌、唾液鏈球菌和表皮葡萄球菌浮游細胞的數(shù)量在尼古丁存在的情況下變化并不明顯??梢钥闯觯峁哦≡鰪娚锬ぜ毎L的能力更顯著和普遍。

    在混合菌群的培養(yǎng)中,口腔鏈球菌和糞腸球菌生物膜細胞數(shù)量最多,在各種尼古丁質(zhì)量濃度下占生物膜細胞總量超過80%,其中口腔鏈球菌最多,這可能是因為口腔鏈球菌的傳代時間較短,在相同的時間內(nèi)繁殖的代數(shù)多,有利于其與其他菌種的競爭。變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌、糞腸球菌的生物膜細胞數(shù)量在尼古丁存在的情況下明顯增加,且與尼古丁質(zhì)量濃度呈正相關,這說明在混合菌群中,尼古丁依然能使變異鏈球菌等致齲菌的數(shù)量上調(diào),這比單獨培養(yǎng)更能體現(xiàn)尼古丁在復雜口腔環(huán)境中的作用。這些菌在混合菌群中的相互作用值得關注,Kreth等[10]的研究顯示:在營養(yǎng)豐富的生長條件下,如蔗糖環(huán)境,血鏈球菌和變異鏈球菌之間沒有抑制作用?;旌吓囵B(yǎng)中格氏鏈球菌的絕對細胞數(shù)量也因尼古丁的作用而增加,這些增加的格氏鏈球菌細胞既能產(chǎn)生更多的過氧化氫抑制變異鏈球菌的生長,也能為變異鏈球菌的附著提供更多的結合位點[10]。值得一提的是,作為齲病的重要病原菌,干酪乳桿菌在浮游和生物膜混合培養(yǎng)中,數(shù)量均顯著減少,這意味著尼古丁的存在對干酪乳桿菌的生長不利,但具體的機制還待進一步探索。

    總結和比較本實驗和國內(nèi)外關于細菌種類細胞數(shù)量變化的研究??偟膩碚f,尼古丁對大部分的菌都有促進作用,但促進程度不同,當混合培養(yǎng)時,尼古丁在促進細菌的同時也會調(diào)節(jié)菌群各種之間的比例,因而尼古丁對各菌的作用在混合培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)中是不同的。其中,尼古丁對變異鏈球菌、格氏鏈球菌、口腔鏈球菌3種菌的促進作用最明顯,在單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)情況下,其浮游細胞和生物膜細胞數(shù)量均增加,而對其他細菌的促進作用受細菌狀態(tài)影響較大。因此,尼古丁導致口腔菌群朝利于致齲菌群生長的方向發(fā)展,進而增加了吸煙者的齲風險。當然,由于本研究中納入的細菌同種類數(shù)量與人類口腔微生物組相差甚遠,目前的研究只是一個多物種研究的試點研究,進一步的研究會包括更多的細菌種類和優(yōu)化生長條件。

    利益沖突聲明:作者聲明本文無利益沖突。

    猜你喜歡
    浮游尼古丁生物膜
    幽門螺桿菌生物膜的研究進展
    生物膜胞外聚合物研究進展
    浞河浮游藻類的調(diào)查研究與水質(zhì)評價
    認清尼古丁的真面目
    大眾健康(2020年11期)2020-11-13 03:44:58
    《浮游》
    流行色(2019年10期)2019-12-06 08:13:26
    浮游藻類在水體PAHs富集與降解中的研究
    光動力對細菌生物膜的作用研究進展
    NY3菌固定化及生物膜處理含油廢水的研究
    圍墾對椒江口夏季浮游植物群落結構和多樣性的影響
    歐洲飛機提供尼古丁代用品
    祝您健康(2000年5期)2000-12-29 03:53:12
    亚洲国产精品一区三区| www.熟女人妻精品国产| 精品福利永久在线观看| 自线自在国产av| 色播在线永久视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | av卡一久久| 国产成人91sexporn| 国产精品国产av在线观看| 春色校园在线视频观看| 日韩制服骚丝袜av| 美女大奶头黄色视频| 十八禁网站网址无遮挡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲 欧美一区二区三区| 观看av在线不卡| 夫妻性生交免费视频一级片| 伊人久久国产一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 国产 一区精品| 日本黄色日本黄色录像| av在线app专区| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产乱人偷精品视频| 五月天丁香电影| 激情五月婷婷亚洲| 最新的欧美精品一区二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久久国产电影| 久久久久网色| 青春草亚洲视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久国产欧美日韩av| 水蜜桃什么品种好| 久久青草综合色| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩伦理黄色片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲国产精品成人久久小说| 观看美女的网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 自线自在国产av| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品乱久久久久久| 视频在线观看一区二区三区| videosex国产| 日韩一区二区视频免费看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 9热在线视频观看99| 国精品久久久久久国模美| 色哟哟·www| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久精品亚洲av国产电影网| 成年人免费黄色播放视频| 岛国毛片在线播放| 欧美在线黄色| 中文字幕亚洲精品专区| 下体分泌物呈黄色| 91精品国产国语对白视频| 亚洲av福利一区| 69精品国产乱码久久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 女性生殖器流出的白浆| 在线观看免费视频网站a站| 丝袜脚勾引网站| 一区二区三区四区激情视频| 欧美中文综合在线视频| 国产一区二区在线观看av| 两性夫妻黄色片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲,欧美精品.| 国产日韩欧美在线精品| 99久久人妻综合| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 91久久精品国产一区二区三区| 成人国语在线视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 波多野结衣一区麻豆| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产探花极品一区二区| av在线老鸭窝| 超碰成人久久| 日日爽夜夜爽网站| 97在线视频观看| 亚洲国产av影院在线观看| 1024视频免费在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲成人一二三区av| 一二三四在线观看免费中文在| 精品久久久精品久久久| 午夜免费鲁丝| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 色94色欧美一区二区| 99re6热这里在线精品视频| av线在线观看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 高清欧美精品videossex| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久99蜜桃精品久久| 伊人亚洲综合成人网| 在线看a的网站| 亚洲在久久综合| 成年动漫av网址| 一级爰片在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 18禁观看日本| 欧美成人午夜精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜91福利影院| 高清不卡的av网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美精品国产亚洲| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产国语露脸激情在线看| 街头女战士在线观看网站| 久久久亚洲精品成人影院| 国产成人精品久久久久久| 在线看a的网站| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲第一区二区三区不卡| 在线天堂最新版资源| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 色94色欧美一区二区| www.av在线官网国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品卡一卡二卡四卡免费| av国产久精品久网站免费入址| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品少妇久久久久久888优播| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品 欧美亚洲| 色吧在线观看| 极品人妻少妇av视频| 久久99精品国语久久久| 男女边摸边吃奶| av网站免费在线观看视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99国产综合亚洲精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产xxxxx性猛交| 亚洲少妇的诱惑av| 日本91视频免费播放| 欧美97在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 蜜桃在线观看..| 久久这里有精品视频免费| 午夜免费观看性视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 99国产精品免费福利视频| 国产成人一区二区在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产欧美亚洲国产| 国产成人精品在线电影| 免费观看在线日韩| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美人与性动交α欧美软件| 视频在线观看一区二区三区| 日本av免费视频播放| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产av新网站| 在线观看三级黄色| √禁漫天堂资源中文www| 丰满乱子伦码专区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 9色porny在线观看| 极品人妻少妇av视频| 26uuu在线亚洲综合色| 日本wwww免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 青青草视频在线视频观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 美国免费a级毛片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 激情视频va一区二区三区| 999久久久国产精品视频| 久久久国产欧美日韩av| 少妇精品久久久久久久| 秋霞伦理黄片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲经典国产精华液单| 黄频高清免费视频| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲精品视频女| 欧美日韩精品成人综合77777| 七月丁香在线播放| 亚洲内射少妇av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 在现免费观看毛片| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩一区二区三区影片| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲伊人色综图| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩欧美一区视频在线观看| 大香蕉久久网| 久久久久久久久久久久大奶| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费在线观看黄色视频的| 日韩一区二区三区影片| 另类精品久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品一区二区三卡| 日本黄色日本黄色录像| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲天堂av无毛| 各种免费的搞黄视频| 久久青草综合色| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久精品区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩电影二区| 久久久久精品人妻al黑| 日本-黄色视频高清免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 久久久久久伊人网av| 久久久精品94久久精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 在现免费观看毛片| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费看不卡的av| 黑丝袜美女国产一区| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲综合色惰| 黄片播放在线免费| 99久久精品国产国产毛片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 丁香六月天网| 欧美+日韩+精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 老鸭窝网址在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩一区二区三区影片| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美+日韩+精品| 成人毛片60女人毛片免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 18禁动态无遮挡网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久视频综合| 一区二区三区四区激情视频| 99久久精品国产国产毛片| 老汉色∧v一级毛片| 欧美成人精品欧美一级黄| 丝瓜视频免费看黄片| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久久久精品人妻al黑| 五月伊人婷婷丁香| av天堂久久9| 欧美日韩av久久| 亚洲国产精品国产精品| 91精品三级在线观看| 男女边摸边吃奶| 色哟哟·www| 色播在线永久视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产看品久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 2022亚洲国产成人精品| 国产男人的电影天堂91| 热re99久久国产66热| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 大香蕉久久成人网| 精品午夜福利在线看| 日日爽夜夜爽网站| 欧美成人午夜精品| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲av日韩在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品一品国产午夜福利视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 青草久久国产| 男女边吃奶边做爰视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲国产av影院在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费日韩欧美在线观看| 日本91视频免费播放| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 国产97色在线日韩免费| 高清不卡的av网站| 激情视频va一区二区三区| 午夜免费观看性视频| 国产成人精品久久久久久| 最新中文字幕久久久久| 天美传媒精品一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| av有码第一页| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩av免费高清视频| 一本大道久久a久久精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 青草久久国产| 久久久精品94久久精品| 精品久久久精品久久久| 老熟女久久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av.在线天堂| av片东京热男人的天堂| 国产av国产精品国产| 青春草国产在线视频| 国产淫语在线视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产一区二区在线观看av| 中文字幕av电影在线播放| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品一二三| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 五月天丁香电影| 精品国产一区二区三区四区第35| 丝袜美腿诱惑在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美激情极品国产一区二区三区| 青草久久国产| 美女xxoo啪啪120秒动态图| a 毛片基地| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 大片免费播放器 马上看| 在线免费观看不下载黄p国产| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99久久中文字幕三级久久日本| 人妻人人澡人人爽人人| 桃花免费在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久久久久久久久免费av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男男h啪啪无遮挡| 国产日韩欧美亚洲二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲av福利一区| 欧美日韩精品网址| 亚洲人成网站在线观看播放| 香蕉国产在线看| 国产成人a∨麻豆精品| 老女人水多毛片| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧洲日产国产| 青春草国产在线视频| 国产探花极品一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 自线自在国产av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 啦啦啦在线免费观看视频4| 在线免费观看不下载黄p国产| av在线老鸭窝| 亚洲人成77777在线视频| 国产男人的电影天堂91| 成年人午夜在线观看视频| 精品人妻在线不人妻| 麻豆av在线久日| 我的亚洲天堂| 久久人人97超碰香蕉20202| 熟女电影av网| 多毛熟女@视频| 性色av一级| 成人亚洲精品一区在线观看| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 高清av免费在线| 一二三四在线观看免费中文在| 十八禁网站网址无遮挡| 久久这里只有精品19| 人妻人人澡人人爽人人| 国产乱人偷精品视频| 国产成人精品久久久久久| 国产精品免费大片| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 桃花免费在线播放| 国产精品久久久久成人av| 国产色婷婷99| 亚洲av中文av极速乱| 综合色丁香网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 水蜜桃什么品种好| 深夜精品福利| 精品久久久久久电影网| 不卡av一区二区三区| 蜜桃在线观看..| 午夜av观看不卡| 午夜福利视频精品| 丁香六月天网| 母亲3免费完整高清在线观看 | 午夜91福利影院| 亚洲第一av免费看| 男女下面插进去视频免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美 日韩 精品 国产| 色网站视频免费| 亚洲欧洲日产国产| 成人二区视频| 最近中文字幕2019免费版| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人欧美| 国产av精品麻豆| 国产成人91sexporn| www.熟女人妻精品国产| 一区二区三区四区激情视频| 久久精品国产综合久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| av电影中文网址| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久国内精品自在自线图片| 三上悠亚av全集在线观看| 黄频高清免费视频| 人人澡人人妻人| 极品少妇高潮喷水抽搐| 午夜福利网站1000一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品亚洲成国产av| 免费高清在线观看视频在线观看| 色播在线永久视频| 考比视频在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜福利影视在线免费观看| 久久狼人影院| 亚洲美女黄色视频免费看| 午夜福利影视在线免费观看| av视频免费观看在线观看| 精品国产一区二区久久| 午夜激情av网站| 国产精品.久久久| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲第一区二区三区不卡| 黑人欧美特级aaaaaa片| videos熟女内射| 午夜av观看不卡| 久久久久精品性色| 国产精品.久久久| 男女国产视频网站| av在线老鸭窝| 国产黄频视频在线观看| 亚洲综合精品二区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 国产成人精品久久久久久| av在线播放精品| 午夜福利乱码中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 黄片无遮挡物在线观看| www日本在线高清视频| 国产欧美亚洲国产| 有码 亚洲区| 国产深夜福利视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 免费看不卡的av| 国产一区亚洲一区在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 一级片免费观看大全| 精品国产国语对白av| 伦精品一区二区三区| 777米奇影视久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 男女边摸边吃奶| 99久久精品国产国产毛片| 大香蕉久久网| 精品第一国产精品| 亚洲国产看品久久| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品国产三级国产专区5o| 在线天堂最新版资源| 日日爽夜夜爽网站| 久久av网站| 男女国产视频网站| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇熟女欧美另类| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲av免费高清在线观看| 黄色一级大片看看| 日韩中文字幕视频在线看片| 成人二区视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产成人精品在线电影| 精品少妇久久久久久888优播| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产一区二区在线观看av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产在视频线精品| 看十八女毛片水多多多| 天堂8中文在线网| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 大香蕉久久成人网| 下体分泌物呈黄色| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日韩av不卡免费在线播放| 日韩欧美精品免费久久| 五月开心婷婷网| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩一区二区视频免费看| 大码成人一级视频| 久久久a久久爽久久v久久| 99热网站在线观看| 18禁观看日本| 久久精品国产自在天天线| 欧美成人午夜精品| 久久99一区二区三区| av不卡在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 久久韩国三级中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产又爽黄色视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 飞空精品影院首页| 91aial.com中文字幕在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 在线 av 中文字幕| 制服丝袜香蕉在线| 春色校园在线视频观看| 黑丝袜美女国产一区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产在线视频一区二区| 看免费av毛片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产视频首页在线观看| 18+在线观看网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久婷婷青草| 伦理电影免费视频| 熟女av电影| 9色porny在线观看| 免费在线观看完整版高清| 久久影院123| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久av网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 天美传媒精品一区二区| 99国产精品免费福利视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久国产网址| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产免费现黄频在线看| 久久精品国产综合久久久| 男女午夜视频在线观看| 一级毛片 在线播放| 久久久国产欧美日韩av| 精品午夜福利在线看| 在线观看免费视频网站a站| 成人影院久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲中文av在线| 咕卡用的链子| 最近最新中文字幕大全免费视频 |